מאמר שיטה

מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית

DOI:

10.3791/52722

⸱

3 באפריל 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבודד שלפוחית ​​תאית (EVS), חלקיקים קרומיים קטנים שוחררו מהתאים, מ קטן כמו 10 דגימות סרום μl. גישה זו עוקפת את הצורך בultracentrifugation, דורשת רק כמה דקות של זמן assay, ומאפשרת בידוד של כלי רכב חשמלי מדגימות של כרכים מוגבלים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחית ​​תאית (EVS), חלקיקים קרומיים שוחררו מסוגים שונים של תאים, להחזיק פוטנציאל גדול עבור יישומים קליניים. הם מכילים מטען חומצת גרעין וחלבונים ומוכרים יותר ויותר כאמצעי לתקשורת בין תאית מנוצלת על ידי שני eukaryote ותאי פרוקריוטים. עם זאת, בשל גודלם הקטן, פרוטוקולים הנוכחיים לבידוד של כלי רכב חשמליים הם בדרך כלל זמן רב, מסורבל, ודורשים כמויות גדולות מדגם וציוד יקר, כגון ultracentrifuge. כדי לתת מענה למגבלות אלה, שפיתחנו פלטפורמת immunoaffinity מבוססת נייר להפרדה תת-קבוצות של כלי רכב חשמליים שהיא קל, יעיל, ודורש כרכי מדגם נמוכים כמו 10 μl. ניתן pipetted דגימות ביולוגיות ישירות על אזורי מבחן נייר ששונו כימי עם מולקולות ללכוד שיש לי זיקה גבוהה לסמני משטח EV ספציפיים. immunosorben צמוד אנזים אנו לאמת את assay באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), המבוסס על ניירמבחני t (P-ELISA), וניתוח transcriptome. מכשירים מבוססי נייר אלה יאפשר המחקר של כלי רכב חשמליים במרפאת והגדרת המחקר כדי לעזור לקדם את ההבנה של פונקציות EV בבריאות ובחוליים שלנו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן חלקיקים קרומיים הטרוגניים שגודלם נע בין 40 ננומטר ל-5,000 ננומטר ומשתחררים באופן פעיל על ידי סוגי תאים רבים דרך נתיבי ביוגנזה שונים1-9. הם מכילים תת-קבוצות ייחודיות ונבחרות של DNA, RNA, חלבונים וסמני פני שטח מתאי הורים. מעורבותם במגוון תהליכים תאיים, כגון תקשורת בין-תאית10, אפנון חסינות11, אנגיוגנזה12, גרורות12, עמידות לכימותרפיה13 והתפתחות מחלות עיניים9, מוכרת יותר ויותר ועוררה עניין רב בשימושיותם ביישומי אבחון, פרוגנוסטיקה, טיפולית וביולוגיה בסיסית.

ניתן לסווג

EVs באופן קלאסי כאקסוזומים, מיקרו-שלפוחיות, גופים אפופטוטיים, אונקוסומים, אקטוזומים, מיקרו-חלקיקים, טלרוזומים, פרוסטטוזומים, קרדיוזומים ווקסוזומים וכו', על סמך הביוגנזה או המקור התאי שלהם. לדוגמה, אקסוזומים נוצרים בגופים רב-שלפוחיתיים, בעוד שמיקרו-שלפוחיות נוצרות על ידי ניצנים ישירות מקרום הפלזמה ושלפוחיות אפופטוטיות הן מתאים אפופטוטיים או נמקיים. עם זאת, המינוח עדיין לא מעודן, בין היתר בשל חוסר הבנה ואפיון מעמיק של רכבים חשמליים. פותחו מספר שיטות לטיהור EVs, כולל אולטרה-צנטריפוגה14, אולטרה-סינון15, חרוזים מגנטיים16, משקעים פולימריים17-19 וטכניקות מיקרופלואידיות20-22. ההליך הנפוץ ביותר לטיהור רכבים חשמליים כולל סדרה של צנטריפוגות ו/או סינון להסרת פסולת גדולה ומזהמים תאיים אחרים, ואחריו אולטרה-צנטריפוגה סופית במהירות גבוהה, תהליך יקר, מייגע ולא ספציפי14,23,24. למרבה הצער, הצורך הטכנולוגי בבידוד מהיר ואמין של רכבים חשמליים עם טוהר ויעילות משביעי רצון עדיין לא נענה.

פיתחנו מכשיר חיסוני מבוסס נייר המספק דרך פשוטה, חסכונית בזמן ובעלויות, אך יעילה לבודד ולאפיין תת-קבוצות של EVs22. ניתן לסדר נייר תאית חתוך לצורה מוגדרת ולמינציה באמצעות שתי יריעות פלסטיק עם חורים עוברים רשומים. בניגוד לאסטרטגיה הכללית להגדיר את גבול הנוזל במכשירים מבוססי נייר על ידי הדפסת שעווה הידרופובית או פולימרים25-27, דפוסי נייר למינציה אלה עמידים בפני נוזלים אורגניים רבים, כולל אתנול. אזורי בדיקת נייר עוברים שינוי כימי כדי לספק כיסוי יציב וצפוף של מולקולות לכידה (למשל, נוגדנים ספציפיים למטרה) בעלי זיקה גבוהה לסמני משטח ספציפיים בתת-קבוצות EV. ניתן להזרים דגימות ביולוגיות ישירות לאזורי בדיקת הנייר, ורכבים חשמליים מטוהרים נשמרים לאחר שלבי השטיפה. אפיון של EVs מבודדים יכול להתבצע על ידי SEM, ELISA וניתוח טרנסקריפטומי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרשים כללי של נוהל המבצע מסופק באיור 1. שימוש בשיטות אתיות, אספנו דגימות דם מנבדקים בריאים, ואספתי דגימות הומור מימיות מחולים דרך טאיצ'ונג ותיקי בית החולים הכללי (TCVGH), טאיצ'ונג, טייוואן תחת IRB אושר פרוטוקולים ( IRB TCVGH מס 'CF11213-1).

1. ייצור של מכשירי נייר

  1. לחתוך נייר כרומטוגרפיה לחוגים של 5 מ"מ קוטר לספק את אותה הפריסה כצלחת microtiter 96-היטב. כריך חתיכות הנייר האלה עם שני גיליונות קלקר עם, ורבד הרשום דרך החורים.
  2. לשנות מכשירי נייר תוך שימוש בשיטת נטיה הכימית שמתוארת בשלבים הבאים 28.
    1. פנק את מכשירי נייר עם פלזמה חמצן (100 mW, חמצן 1%, 30 שניות) בתא פלזמה.
      זהירות: יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת עבודה עם trimethoxysilane 3-mercaptopropyl ו- maleimidobutyryloxy -γ succinimide Nאסתר (GMBS), מאחר שהם שתי הלחות רגישה ורעילה. ללבוש כפפות מגן ולהימנע משאיפה או מגע עם עור ועיניים. שמור את מניית הבקבוק סגור היטב ולאפשר לו לאזן לRT לפני הפתיחה כדי למנוע התעבות מים. לחלופין, לפתוח את מניית הבקבוק בתוך שקית כפפה מלא חנקן או תיבה. Aliquot לתוך צלוחיות קטנות כדי להימנע מפתיחה תכופה של מניית הבקבוק.
    2. מייד דגירה טופל מכשירי נייר בכ 4% (v / v) פתרון של trimethoxysilane 3-mercaptopropyl באתנול (200 הוכחה) למשך 30 דקות.
    3. יש לשטוף את מכשירי נייר עם אתנול דגירה אותם עם 0.01 μmol / GMBS מיליליטר באתנול במשך 15 דקות.
    4. לשטוף עם אתנול (200 הוכחה) ודגירת מכשירי נייר עם 10 מיקרוגרם פתרון / מיליליטר avidin בופר פוספט (PBS) במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס. חנות ב 4 ° C במידת הצורך, ולהשתמש תוך 4 שבועות.
  3. להרטיב כל אזורי מבחן נייר עם 10 μl PBS המכיל 1% (w / v) אלבומין בסרום שור (BSA) עבור 3 × 10 דקות לפני תצפית 10 μl biotinylated מולקולות ללכוד עבור 3 × 10 דקות. השתמש נגד CD63 נוגדן (20 מיקרוגרם / מיליליטר PBS המכיל 1% (w / v) BSA ושל 0.09% (w / v) אזיד הנתרן) או V Annexin (1:20, v / v במאגר מחייב V Annexin) כ מולקולות ללכוד.
  4. לשטוף את מולקולות נוגדן או V Annexin אנטי CD63 מאוגד באמצעות 10 μl מקביל PBS המכיל 1% (w / v) BSA או Annexin V מחייב פתרונות חיץ במשך 3 × 1 דקות, בהתאמה.

אוסף דוגמאות 2. סרום ומימי הומור ועיבוד

  1. אוסף סרום.
    1. לאסוף 10 מיליליטר של דם היקפי על ידי venipuncture בצינורות הפרדת סרום ובעדינות להפוך את הצינור חמש פעמים. הגדר את הצינור במצב אנכי ולחכות 30 דקות.
    2. צנטריפוגה ב× גרם 1,200 במשך 15 דקות. העבר את הסרום מהשכבה העליונה לצינור נקי, ו צנטריפוגות שוב ב 3000 × גרם במשך 30 דקות.
    3. להעביר את supernatant דרך fil 0.8 מיקרומטרter. שמור את המדגם ב -80 ° C עד שימוש.
  2. אוסף המימי הומור: לאסוף דגימות הומור מימיות מחולים שאובחנו על ידי רופא עיניים ישירות דרך פולשנית נהלים ודגימות חנות ב -80 ° C עד שימוש.

3. בידוד של שלפוחית ​​התאית

  1. דגימות ספוט על כל אזור מבחן נייר בשיעור של 5 μl / min.
  2. לשטוף את המכוניות חשמליות מאוגד עם 10 μl המקביל PBS המכיל 1% (w / v) BSA או Annexin V מחייב פתרונות חיץ דקות 3 × 1 עבור התקני נייר פונקציונליות עם מולקולות נוגדן או V Annexin אנטי CD63, בהתאמה. לבצע את מבחני במורד הזרם הבאים.

4. 1 Downstream Assay דוגמא: Electromicrographs סריקה

  1. לתקן כלי רכב חשמליים שנתפסו על אזור בדיקת נייר פונקציונליות באמצעות 10 μl 0.5 × המקבע של Karnovsky במשך 10 דקות.
  2. יש לשטוף את הדגימות עם PBS בשפע עבור 2 × 5 דקות.
  3. מייבש אתדוגמאות עם אתנול 35% לאחר 10 דקות, אתנול 50% עבור 2 × 10 דקות, אתנול 70% עבור 2 × 10 דקות, אתנול 95% עבור 2 × 10 דקות, ו 100% אתנול במשך 4 × 10 דקות.
  4. קריטי יבש וגמגום מעיל הדגימות עם פלדיום / זהב, ולבחון באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק פעל במתח האצת אלקטרונים נמוך (~ 5 קילו וולט).

5. Assay דוגמא 2 Downstream: ELISA מבוסס נייר

  1. הוסף פתרון 5 μl מכיל נוגדן ראשוני אנטי-CD9 ב 1: 1,000 דילול בPBS לכל אזור ניסיון שמכיל כלי רכב חשמליים שנתפסו. חכה דק '1.
  2. יש לשטוף את הדגימות עם 30 מיליליטר PBS מזועזע ב 100 סל"ד במשך 30 שניות.
  3. הוסף peroxidase חזרת תמיסה המכילה 5 μl (HRP) -linked נוגדנים משני בשעה 1: 1,000 דילול ב PBS ולחכות 1 דקות.
  4. יש לשטוף את הדגימות עם 30 מיליליטר PBS מזועזע ב 100 סל"ד במשך 30 שניות.
  5. הוסף מצע colorimetric 5 μl המכיל 1: יחס נפח 1 של מי חמצן3,3 ד ', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) ולסרוק באמצעות סורק שולחני.

6. דוגמא Downstream Assay 3: בידוד RNA

  1. לטבול את הדגימות ב -35 μl סיוע בידוד RNA מבוסס polyvinylpyrrolidone וμl 265 של תמוגה / חיץ מחייב לlyse כלי רכב חשמלי שנתפסו. מערבולת במרץ.
  2. הוסף 30 homogenate μl המסופק בערכת הבידוד לlysate. וורטקס במרץ ולשים על קרח למשך 10 דקות.
  3. חלץ את RNA באמצעות הפרדת פנול, כלורופורם חומצה מתוארת בשלבים הבאים.
    1. קח 330 μl של פנול, כלורופורם מהשכבה התחתונה של הבקבוק ולהוסיף לhomogenate / lysate. מערבולת במרץ.
    2. צנטריפוגה XG ב 10,000 במשך 5 דקות. מעביר את השלב המימי (העליון) לצינור נקי ולב נפח סיר.
  4. לזרז את הרנ"א המוחלט עם אתנול 100% מההיקף שהוא 1.25 פעמים הנפח של השלב מימי הוסר בשלב הקודם ושיתוףllect RNA בפתרון elution שחומם מראש ל 95 מעלות צלזיוס.
  5. להתרכז ועוד לטהר RNA באמצעות ערכת ניקוי RNA על פי הפרוטוקול של הייצור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת של מכשיר נייר לבודד את תת-קבוצות של כלי רכב חשמלי ביעילות מסתמכת על ההכרה שלה רגישה וספציפית של סמני משטח EV. השינוי היציב של סיבי נייר עם מולקולות ללכוד מושגת באמצעות הכימיה avidin ביוטין כפי שתואר במקומות אחרים 28-30. היעילות של נטיה הכימית ושל שיטת physisorption נבחנת באמצעות קריאות הקרינה מבוססת. אזורי מבחן נייר הוכנו לאחר צעד הפרוטוקול 1) פרט למולקולת הלכידה מוחלף במולקולות fluorophore 20 מיקרוגרם / מיליליטר R-Phycoerythrin מצומדות- ביוטין (PE-ביוטין) בשלב 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים ביותר לבידוד מוצלח של תת-קבוצות של שלפוחית ​​תאית הם: 1) בחירה טובה של נייר; 2) כיסוי יציב וגבוה של מולקולות ללכוד על פני השטח של סיבי נייר; טיפול נכון של דגימות 3); ו 4) תרגול היגיינה מעבדה כללית.

חומרים נקבוביים כבר נוצלו בהרבה מבחני זולים וחינמי ציוד. אולי יש להם גודל נקבובית מתכונן, פונקציונלי רב-תכליתי, עלות נמוכה ויחס קרקע-נפח גבוה מאפשר פתילה פסיבית של נוזלים. בחרנו כיתה נייר תאית כרומטוגרפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי המועצה הלאומית למדע טייוואן grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) והמועצה לביטחון לאומי 101-2,628-E-007-011-MY3 (CMC), ויוצאי הצבא הכללי בתי חולים ומערכת אוניברסיטת טייוואן משותף תכנית המחקר (CC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נייר כרומטוגרפיהGE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® נייר תאית דרגה 1
(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilaneSigma Aldrich175617כימיקל זה מגיב עם מים ולחות ויש למרוח אותו בתוך שקית כפפות מלאה בחנקן. יש להימנע ממגע עם העיניים והעור. אין לנשום אדים או לשאוף אדים.
אתנולפישר מדעיBP2818מוחלט, 200 הוכחה, ביולוגיה מולקולרית בדרגת
אלבומין סרום בקר (BSA)BioShop Canada Inc.ALB001מכונה לעתים קרובות שבר כהן V.
N-γ-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)Pierce Biotechnology22309GMBS הוא מקשר אמין לסולפידריל. GMBS רגיש ללחות.
ל-AvidinPierce Biotechnology31000NeutrAvidin יש 4 אתרי קשירה לביוטין וערך ה-pI שלו הוא 6.3, שהוא ניטרלי יותר מ-avidin מקומי
עכבר ביוטיניל אנטי-אנושי אנטי-CD63Ancell215-030שיבוט AHN16.1/46-4-5
נספח ביוטיניל VBD Biosciences556418ל-Annxin V יש זיקה גבוהה לפוספטידילסרין (PS)
אנטי-CD9 ראשוני ומשני נוגדניםSystem BiosciencesEXOAB-CD9A-1הנוגדן המשני הוא
שפופרות הפרדת סרוםBiosciences367991מפעיל קרישים וג'ל להפרדת סרום
Annexin V מאגר מחייבBD Biosciences556454פי 10; יש לדלל ל-1x לפני השימוש.
סט ריאגנטים למצע TMBBD Biosciences555214הסט מכיל מי חמצן ו-3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)
[header]
ערכת בידוד RNALife TechnologiesAM1560MirVana ערכת בידוד RNA
סיוע לבידוד RNA מבוסס פוליוויניל פירולידוןLife TechnologiesAM9690עזר לבידוד RNA צמחי מכיל פוליוויניל פירולידון (PVP) הנקשר לפוליסכרידים.
ערכת ניקוי RNAQiagen Inc.ערכת ניקוי RNA MinElute 74004 מיועדת לטיהור של עד 45  μ g RNA.
תא פלזמהMarch InstrumentsPX-250
מיקרוסקופ אלקטרונים סורקהיטאצ'י בע"מS-4300
סורק שולחניHewlett-Packard CompanyPhotosmart B110תמונות צבעוניות של 8 סיביות צולמו. ניתן להשתמש גם במצלמות ובטלפונים חכמים.
מערכת הקלטת תמונותJ& H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX8תמונות פלורוסצנטיות של 16 סיביות צולמו. ניתן להשתמש גם במיקרוסקופים פלורוסצנטיים.
מצומדות פרוקסידיז BD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Caby, M. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
  2. Lasser, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9(2011).
  3. Raj, D. A. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81, 1263-1272 (2012).
  4. Wiggins, R. C., Glatfelter, A., Kshirsagar, B., Brukman, J. Procoagulant activity in normal human-urine associated with subcellular particles. Kidney Int. 29, 591-597 (1986).
  5. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
  6. Keller, S., Ridinger, J., Rupp, A. K., Janssen, J. W. G., Altevogt, P. Body fluid derived exosomes as a novel template for clinical diagnostics. J. Transl. Med. 9, 86(2011).
  7. Asea, A., et al. Heat shock protein-containing exosomes in mid-trimester amniotic fluids. J. Reprod. Immunol. 79, 12-17 (2008).
  8. Bard, M. P., et al. Proteomic analysis of exosomes isolated from human malignant pleural effusions. Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 31, 114-121 (2004).
  9. Perkumas, K. M., Hoffman, E. A., McKay, B. S., Allingham, R. R., Stamer, W. D. Myocilin-associated exosomes in human ocular samples. Exp. Eye Res. 84, 209-212 (2007).
  10. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Lab. Invest. 90, 1549-1557 (2010).
  11. Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119, 756-766 (2012).
  12. Grange, C., et al. Microvesicles released from human renal cancer stem cells stimulate angiogenesis and formation of lung premetastatic niche. Cancer Res. 71, 5346-5356 (2011).
  13. Jaiswal, R., et al. Microparticle-associated nucleic acids mediate trait dominance in cancer. Faseb. J. 26, 420-429 (2012).
  14. Thery, C., Clayton, A., Amigorena, S., Raposo, G. Current protocols in cell biology. Morgan, K. K. (UNIT 3.22), John Wiley. New York, NY. (2006).
  15. Rood, I. M., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
  16. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110, 13-21 (2008).
  17. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).
  18. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 77, 736-742 (2010).
  19. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Ravi, R. K., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. 82, 1024-1032 (2012).
  20. Chen, C., et al. Microfluidic isolation and transcriptome analysis of serum microvesicles. Lab. Chip. 10, 505-511 (2010).
  21. Davies, R. T., et al. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. Lab. Chip. 12, 5202-5210 (2012).
  22. Chen, C., et al. Paper-based immunoaffinity devices for accessible isolation and characterization of extracellular vesicles. Microfluid. Nanofluid. 16, 849-856 (2014).
  23. Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J. Immunol. Methods. 270, 211-226 (2002).
  24. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: Purification of both vesicles from cell-free supernatants. J. Immunol. Methods. 338, 21-30 (2008).
  25. Carrilho, E., Martinez, A. W., Whitesides, G. M. Understanding wax printing: a simple micropatterning process for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 7091-7095 (2009).
  26. Dungchai, W., Chailapakul, O., Henry, C. S. Electrochemical detection for paper-based microfluidics. Anal. Chem. 81, 5821-5826 (2009).
  27. Glavan, A. C., et al. Omniphobic 'R-F paper' produced by silanization of paper with fluoroalkyltrichlorosilanes. Adv. Funct. Mater. 24, 60-70 (2014).
  28. Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y. H., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear-stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
  29. Murthy, S. K., Sin, A., Tompkins, R. G., Toner, M. Effect of flow and surface conditions on human lymphocyte isolation using microfluidic chambers. Langmuir. 20, 11649-11655 (2004).
  30. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosens. Bioelectron. 14, 683-688 (1999).
  31. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nat. Rev. Immunol. 2, 569-579 (2002).
  32. Scanu, A., et al. Stimulated T cells generate microparticles, which mimic cellular contact activation of human monocytes: differential regulation of pro- and anti-inflammatory cytokine production by high-density lipoproteins. J. Leukocyte Biol. 83, 921-927 (2008).
  33. Inal, J. M., et al. Microvesicles in health and disease. Arch. Immunol. Ther. Ex. 60, 107-121 (2012).
  34. Fridley, G. E., Holstein, C. A., Oza, S. B., Yager, P. The evolution of nitrocellulose as a material for bioassays. Mrs Bull. 38, 326-330 (2013).
  35. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
  36. Missoum, K., Belgacem, M. N., Bras, J. Nanofibrillated cellulose surface modification: a review. Materials. 6, 1745-1766 (2013).
  37. Kalia, S., Boufi, S., Celli, A., Kango, S. Nanofibrillated cellulose: surface modification and potential applications. Colloid Polym. Sci. 292, 5-31 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Extracellular VesiclesPaper based DeviceImmunoaffinity IsolationScanning Electron MicroscopyP ELISATranscriptome AnalysisCD63 AntibodyAqueous HumorSerum ProcessingRNA Extraction

מאמרים קשורים