הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

8.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52730

⸱

24 ביוני 2015

 ,  , 
1Department of Neurobiology and Behavior, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Science, Stony Brook University

במאמר זה

סיכום

פיתחנו תכשיר כימרי גנטי של מעגל היפוקמפוס גחוני - אקומבנס במבחנה המאפשר הדמיה חיה ישירה לנתח מנגנונים פרה-סינפטיים של קולטני אצטילכולין ניקוטיניים (nAChRs) בתיווך העברה סינפטית. הכנה זו מספקת גם גישה אינפורמטיבית לחקר המנגנונים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים של פלסטיות סינפטית.

תקציר

שיפור מתמשך של איתות אקסונלי ושחרור מוגבר של נוירוטרנסמיטורים על ידי הפעלת קולטני אצטילכולין ניקוטיניים פרה-סינפטיים (nAChRs) הוא מנגנון חשוב לנוירומודולציה על ידי אצטילכולין (ACh). הקושי בגישה לחקור את מנגנוני האיתות בתוך אקסונים שלמים ובמסופי עצבים הן במבחנה והן ב-vivo הגביל את ההתקדמות בחקר המרכיבים הקדם-סינפטיים של הפלסטיות הסינפטית. כאן אנו מציגים הכנה כימרית גנטית של מעגל היפוקמפוס גחוני (vHipp)-accumbens (nAcc) במבחנה המאפשר הדמיה חיה ישירה לנתח הן את מרכיבי ההעברה הקדם-סינפטיים והן את הפוסט-סינפטיים תוך שינוי סלקטיבי של הפרופיל הגנטי של הנוירונים הקדם-סינפטיים לעומת הפוסט-סינפטיים. אנו מדגימים כי הקרנות ממיקרו-פרוסות vHipp, כקלט אקסונלי קדם-סינפטי, יוצרות סינפסות גלוטמטרגיות מרובות ואמינות עם מטרות פוסט-סינפטיות, הנוירונים המפוזרים מ-nAcc. הלוקליזציה הקדם-סינפטית של תת-סוגים שונים של nAChRs מזוהה וההעברה הסינפטית המתווכת של איתות ניקוטיני קדם-סינפטי מנוטרת על ידי הקלטה אלקטרופיזיולוגית במקביל והדמיית תאים חיים. הכנה זו מספקת גם גישה אינפורמטיבית לחקר המנגנונים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים של פלסטיות סינפטית גלוטמטרגית במבחנה.

מבוא

אפנון כולינרגית של רגישות מעגל תורם להיבטים בסיסיים של הכרה, ואפנון כולינרגית שינה הוא תכונה של הפרעות ניווניות ונוירו-פסיכיאטריים, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סכיזופרניה והתמכרות 1-4. מנגנון שנקבע בהנחיית כולינרגית של שידור הסינפטי במערכת העצבים המרכזית הוא באמצעות הפעלה ישירה של nAChRs המקומי באתרים מראש הסינפטי. הפעלה של קולטנים מראש הסינפטי אלה מובילה לעליית 2 + (i [Ca 2 +]) במסופים מראש הסינפטי Ca תאיים - הן במישרין, בשל מוליכות סידן גבוהות יחסית של תת מסוימים nAChR, ובעקיפין, באמצעות מפלי איתות תאיות 5, ובכך משפרים את שחרור הנוירוטרנסמיטר. למעשה, ההפעלה של nAChRs מראש הסינפטי נקשרה עם שינויים בשחרור של מגוון רחב של נוירוטרנסמיטורים כוללים גלוטמט, GABA, ACH,דופמין ND 6-10. למרות שתהליך זה נחקר באופן עקיף באמצעות שיטות אלקטרו בהסינפסות שונות, כתבים אופטיים של [Ca 2 +] i ומחזור שלפוחית ​​סינפטית לאפשר מדידה ישירה ובזמן מדויק יותר של תופעות קדם-סינפטי.

לוקליזציה טרום הסינפטי של nAChRs הודגמה באופן משכנע עם תיוג חיסוני זהב ישיר של nAChRs במיקרוסקופי אלקטרונים (EM) רמת 11,12. כמה טכניקות אחרות יש גם שימשו לטיפול בלוקליזציה nAChR בעקיפין, לרבות מיקומים של מפלצות חלבון פלואורסצנטי subunit- nAChRs גילוי בנוירונים בתרבית 13,14, הקלטת אלקטרו של זרמי nAChR במסופים הסינפטי 15,16, מעקב אחר שינויי ניקוטין מושרה ב[ Ca 2 +] i במסוף עצב הסינפטי על ידי הדמיה לחיות תא 17, וניטור עקיף של שחרור הנוירוטרנסמיטר במסוף הסינפטי על ידיטכניקות הדמיה תא חיות עם אינדיקטורים ניאון, כולל exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית שנצפה על ידי צבעי styryl amphipathic FM (FM1-43 וFM4-64) ו / או synapto-pHluorin ועל ידי כתבים ספציפיים ניאון עצבי, כגון CNiFERs לאח וiGluSnFr לגלוטמט 18-20. בסך הכל, גישות הנוכחיות אלה לזיהוי לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs הן מסובכות, ודורשות מערכות וטכניקות מיוחדות כדי לאפשר זיהוי אמין וניטור פיסיולוגי של פעילות טרום-סינפטי.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים וציוד למערכת שיתוף תרבות במבחנה של היפוקמפוס הגחון (vHipp) - גרעין נסמך (nAcc) מעגל המספק גישה ישירה לזהות ולנתח את שני מרכיבים של לפני ואחרי-סינפטי של העברת הסינפטית. אנחנו מראים דוגמאות של לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs והדמית התא החי של nAChR תיווך Ca 2 + ALO איתות ושחרור הנוירוטרנסמיטרהאקסונים ng vHipp. המשך טבעי (וברור) של הפרוטוקול המובא כאן הוא ההכנה של אנשי קשר לפני ואחרי-סינפטי המורכב מתאי עצב מגנוטיפים שונים. באופן זה את התרומה של מוצר גן מסוים למראש ו / או פוסט-סינפטי מנגנונים של אפנון ניתן להעריך באופן ישיר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (NIH פרסומי מס '80-23, מתוקן 2012) ולימודים אושרו על ידי מוסדי טיפול בבעלי חיים והשתמשו לועדות מחקר בסטוני אוניברסיטה ברוק (# -1618 ו# 1792).

1. vHipp-nAcc Synaptic שיתוף תרבויות

  1. עכברי קורבן (יום לידה 0 - 3, מwild-type (WT) או nAChRs α7 קו עכבר מהונדס) עם CO 2. לערוף כל גור ולשמור את הזנב בצינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגות לgenotyping בדיעבד. בצע את השלבים הבאים במכסת מנוע מעוקר.
  2. הסר את החלק העליון של הגולגולת עם מספריים ומלקחיים כדי לחשוף את המוח כולו. החל בצומת שבו הקורטקס המוחי חלק מcaudally אחר, להשיג סעיף עטרה המכיל את קליפת המוח האחורי כולל vHipp 5,21 תחת מיקרוסקופ לנתח.
  3. לנתח נ 'רצועות באוקטובר יהוה רקמה המכילות את אזור CA1-subiculum לפי אטלס מוח עכבר 22 (איור 1 א) פיתוח. העברה לצלחת תרבות 35 מ"מ המכילה תקשורת הקרה תרבות (4 מעלות צלזיוס), לחתוך לפרוסות דקות קטנות (סביב 100 מיקרומטר × 100 מיקרומטר microslices).
  4. טרום דגירה פולי-D ליזין / coverslips זכוכית מצופה laminin 12 מ"מ בתוך 24 צלחות תרבית רקמה טובות עם תקשורת ותרבות (~ 500 μl) לפחות 30 דקות בחממה על 37 מעלות צלזיוס. הסר תקשורת לפני ציפוי microslices.
  5. צלחת עם פיפטה פסטר אש מלוטשת במרכז coverslip עם כמות מינימאלית של תקשורת (~ 50 μl, המכילה ~ 20 חתיכות של microslices) כדי להקל על התקשרות של explants. microslices vHipp צלחת שמקורם בבעלי חיים בודדים (או + / + או - / - גנוטיפ של קו α7 המהונדס) על כל coverslip.
  6. לאחר explants להתיישב על coverslip, בעדינות להוסיף מדיה נוספת (~ 100 μl) על ידי הקיר דואר, כך שרמת התקשורת גבוהה מספיק כדי לכסות את explants בפריפריה לחלוטין, אבל לא אלה שבמרכז coverslip.
  7. לאחר דגירה O / N 37 ° C, 5% CO 2 באינקובטור, לפזר נוירונים nAcc מימים עובריים 18 לעכברי WT יום 1 לאחר לידה ולהוסיף לexplants.
    1. לנתח את רקמות nAcc לפי אטלס פיתוח מוח עכבר 20 (איור 1).
    2. לחתוך לחתיכות קטנות (כ -500 מיקרומטר × 500 מיקרומטר microslices) ולהעביר צינור 15 מיליליטר.
    3. פנק עם טריפסין 0.25% (2 מיליליטר) במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס. לשטוף נתחי רקמות שלוש פעמים עם תקשורת כביסה קרה (5 מיליליטר, 4 ° C) ואחריו לשטוף אחד בתקשורת והתרבות הקרה (5 מיליליטר, 4 ° C). לאפשר השעיה לנוח במשך 5 דקות בכל שלב לשטוף, ואז לשפוך את supernatant בזהירות.
    4. לנתק את התאים על ידי טחינה דקה עדינה ב 2 מיליליטר של תקשורת בתרבות עם פיפטה פסטר קל אש מלוטשת.
    5. Transהשעיה תא FER לעוד צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב -2,000 סל"ד x למשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים בתקשורת והתרבות ב1 מיליליטר לכל 6 גורים. לפזר תאים על ידי pipetting בעדינות בתקשורת כמה פעמים עם פיפטה פסטר אש מלוטשת.
    6. להוסיף 0.25 מיליליטר של תאי nAcc התפזרו לכל coverslip עם explants vHipp.
    7. לשמור על התרבויות ב37 ° C humidified, 5% CO 2 באינקובטור. הנח צלחות תרבות על פדה גזת סטרילי לחה כדי לייצב מכאני ולשמור על לחות, להקל היווצרות סינפסה.

2. Immunocytochemistry

  1. תקן תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) ב -4% סוכרוז paraformaldehyde / 4% / PBS (~ 500 μl לכל coverslip, 20 דקות, RT).
  2. תרבויות Permeabilize עם 0.25% Triton X-100 / PBS (~ 500 μl לכל coverslip, 5 דקות, RT).
  3. תרבויות בלוק עם 10% חמורים בדם נורמלי בPBS (~ 500 μl לכל coverslip, 30 דקות, RT) לפני antibodצביעת y. דגירה עם נוגדנים עיקריים O / N ב 4 ° C. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: nAChRs אנטי (α 4 -ECD 1: 500; אנטי-α 5 יחידות משנה, 1: 500), טרנספורטר גלוטמט אנטי-לפוחי 1 (1: 250), אנטי-GAD65 (1: 100).
  4. לשטוף נוגדנים ראשוניים עם PBS (3 פעמים / ~ 500 μl לכל coverslip, 5 דקות) ולאחר מכן דגירה תרבויות בנוגדנים משני מצומדת לAlexa 488 (~ 500 μl לכל coverslip, 1: 500) או Alexa 594 (~ 500 μl לכל coverslip , 1: 500) לשעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. דגירה התרבויות בαBgTx מצומדת לAlexa 594 (~ 500 μl לכל coverslip, 1: 1,000 בתקשורת והתרבות) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס לפני הקיבוע לα7 משטח תיוג * nAChRs.
  6. coverslips הר והחותם.
  7. צלם תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצוידים ביעדי התכנית-Apochromat (20X עם 0.8 NA או שמן 63X עם 1.4 NA) ומצלמת CCD.

3. FM1-43 מבוסס לפוחי Fusion

  1. לשמור על תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) בחדר הדמיה, הר קאמרי על ספינינג מיקרוסקופ confocal דיסק. ברציפות perfuse (1 מיליליטר / דקה) עם קוקטייל HBS ב RT.
  2. תפסיק תרבויות זלוף ועומס עם 10 מיקרומטר FM1-43 ב -56 מ"מ K + ACSF (~ μl 500) למשך 90 שניות (צביעה), לשטוף צבע חיצוני משם במשך 15 דקות עם Ca 2 + HBS החופשי המכיל ADVASEP-7 (0.1 מ"מ) כדי לחפש FM1-43 קרום הנכנס.
  3. לעורר את התרבויות עם 56 מ"מ K + ACSF (~ 500 μl) ללא FM1-43 עבור 120 שניות (destaining), טען תרבויות עם FM1-43 באמצעות אותם התנאים, ולשטוף שוב עם Ca 2 + HBS חופשי המכיל ADVASEP-7 ל 15 דקות.
  4. לרכוש FM1-43 תמונות הקרינה עם מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב מצוידים במטרת התכנית-Apochromat (מים 60x עם 1.4 NA, ננומטר 488 העירור, פליטת 530 ננומטר) וללכוד תמונות עם מצלמת CCD.
  5. לאסוף תמונות הקרינה FM1-43 בסיס (כל 2 של דקות 1) כשליטה מראש ניקוטין; תחול ניקוטין (1 מיקרומטר) על ידי זלוף המהיר (2 מיליליטר / דקה) 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף ניקוטין עם קוקטייל HBS. שמור את תמונות זמן לשגות לכידה לפני, במהלך, ואחרי יישום ניקוטין כל 2 שניות למשך 5 דקות.
  6. לכמת את עוצמת הקרינה לפני FM1-43 (צביעת F) ואחרי (destaining F) יישום ניקוטין בכל אוטון הסינפטי.
  7. חישוב סכום כולל של הקרינה FM1-43 releasable לאורך האקסונים vHipp ידי כימות ההבדל של עוצמת הקרינה FM1-43 לפני ואחרי יישום ניקוטין (ΔF = destaining -F צביעת F). לנתח כל חלק של ירידת עוצמת הקרינה לאחר ניקוטין עם המשוואה הבאה:% מכתים = ΔF / F F ירידה.

הדמיה 4. סידן

  1. יש לשטוף תרבויות (5 - 7 ימים במבחנה) במהירות עם HBS הנורמלי, לאחר מכן טען תרבויות עם 5 מחוון מיקרומטר Fluo-4 Ca 2 + (אסתר בבוקר) ושל 0.02% pluronic F-127 בHBS (2 מיליליטר) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  2. לשטוף את פתרון Fluo-4 עם HBS (3 פעמים / 5 דקות). חזור תרבויות לחממה (37 CO / 5% מעלות צלזיוס 2) לפחות 30 דקות.
  3. לשמור על תרבויות באותו תא ההדמיה ואותם תנאים כפי שתואר בסעיף FM1-43 היתוך לפוחי מבוסס (ראה שלב 3.1).
  4. לאסוף תמונות Fluo-4 הקרינה של תחזיות axonal ממייקרו-פרוסות vHipp עם מטרת התכנית-Apochromat (מים 60x עם 1.4 NA, ננומטר 488 העירור, פליטה 530 ננומטר) ומצלמת CCD.
  5. לאסוף תמונות הקרינה Fluo-4 בסיס (כל 10 שניות למשך 2 דקות) כשליטה מראש ניקוטין, תחול ניקוטין (1 מיקרומטר) על ידי זלוף המהיר (2 מיליליטר / דקה) 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף ניקוטין עם קוקטייל HBS. שמור את תמונות זמן לשגות לכידה לפני, במהלך, ואחרי יישום ניקוטין כל 10 שניות למשך 30 דקות.
  6. את כל המסגרות של התמונות גולמי fluo-4 הקרינה, יצוא כסדרה שלתמונות בפורמט TIFF לניתוח נוסף.
  7. לאסוף את עוצמת המשולבת של fluo-4 הקרינה לאורך האקסונים vHipp לפני ואחרי יישום ניקוטין.
  8. לנרמל עוצמת הקרינה משולבת עם המשוואה הבאה: ΔF / F 0 = (FF 0) / 0 F, כאשר F 0 הוא עוצמת הקרינה משולבת מראש ניקוטין מתוקן רקע וF הוא עוצמת הקרינה המשולבת לאורך האקסונים vHipp בכל נקודת זמן לאחר יישום ניקוטין. לנתח ולתכנן עוצמת הקרינה משולבת מנורמלת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההכנה המועסקות מורכבת משיתוף תרבויות גן chimeric של מעגלי vHipp-nAcc במבחנה. תחזיות נובעות מmicroslices vHipp, כקלט axonal מראש הסינפטי, יכולות ליצור קשרים סינפטיים עם מטרות פוסט-סינפטי, תאי העצב המפוזרים מnAcc. ניקוטין מושרה סיוע מתמשך (≥ 30 דקות) של שידור glutamatergic מהנוירונים nAcc מעוצבבים על ידי vHipp האקסונים 21 וממושך סידן איתות לאורך האקסונים vHipp 5 באמצעות α7 מראש הסינפטי * nAChRs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הכנת שיתוף התרבות מתוארת מחדש נכנע מעגלים בהיפוקמפוס-נסמכים הגחון במבחנה. בחינת היתרי הכנה פשוטה יחסית ואמינה זה של פרופילי מרחב ובזמן שבו הפעלה של nAChRs מראש הסינפטי לעורר משופרת שידור glutamatergic 5, 21.

שיתוף תרבויות מוגדרות כצמיחת סוגי תאים ספציפיים שונים של במנה אחת שיכול לספק תנאים פיסיולוגיים במבחנה להפגין in vivo דמוי פונקציה. שיתוף תרבויות נוירון נוירון קונבנציונלי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים ליהואי צ'ין ומאלורי מאיירס על התמיכה הטכנית. אנו מודים גם לד"ר זיגיסמונד האק על שסיפק לנו את הנוגדן נגד α4-ECD. עבודה זו נתמכת על ידי NS22061 מענקים של המכונים הלאומיים לבריאות ל-L.W.R.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1. מצע תרבית (50 מ"ל)
נוירו-בזאלי GIBCO1088802248 מ"ל
תוספי B-27GIBCO0080085-SA1 מ"ל
פניצילין-סטרפטומיציןGIBCO10908-0100.5 מ"ל
תוסף GlutaMAXGIBCO35050-0610.5 מ"ל
גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF)GIBCO15140-12220 ng/ml
2. חומרי כביסה (HBSS, 100 מ"ל)
HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום GIBCO14175-09599 מ"ל
HEPES (1M)GIBCO15630-1301 מ"ל
3. תמיסת מלח חוצצת HEPES  (HBS)    pH=7.3
NaClSigmaS9888 135 מ"מ
KClסיגמאP9333 5 מ"מ
MgCl2SigmaM8266 1 מ"מ
CaCl2,סיגמאC1016 2 מ"מ
HEPESסיגמאH3375 10 מ"מ
גלוקוזסיגמאG0350500 10 מ"מ
4. קוקטייל HBS להדמיה חיה pH=7.3
NaClSigmaS9888 135 מ"מ
KClסיגמאP9333 5 מ"מ
MgCl2SigmaM8266 1 מ"מ
CaCl2,סיגמאC1016 2 מ"מ
HEPESסיגמאH3375 10 מ"מ
גלוקוזסיגמאG0350500 10 מ"מ
טטרודוטוקסין Tocris10782 ומיקרו; M
bicucullineTocris13110 ומיקרו; M
D-AP-5Tocris10550 ומיקרו; M
CNQXTocris104520 ומיקרו; M
LY341495Tocris120910 ומיקרו; M
5. ללא סידן  HBS    pH=7.3
NaClSigmaS9888 135 מ"מ
KClסיגמאP9333 5 מ"מ
MgCl2SigmaM8266 1 מ"מ
HEPESסיגמאH3375 10 מ"מ
גלוקוזסיגמאG0350500 10 מ"מ
6. 56 מ"מ אשלגן ACSF pH=7.4
NaClSigmaS9888119 מ"מ
KClSigmaP933356 מ"מ
MgSO4.7HSigmaM18801.3 מ"מ
CaCl2SigmaC10162.5 מ"מ
NaH2PO4SigmaS82821 מ"מ
NaHCO3SigmaS576126.2 מ"מ
גלוקוזסיגמאG0350500 10 מ"מ

מקורות

  1. Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
  2. Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
  3. Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
  4. Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
  5. Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719(2013).
  6. McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
  7. Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
  8. Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
  9. Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
  10. Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911(2011).
  11. Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
  12. Jones, I. W., Barik, J., O'Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
  13. Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
  14. Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  15. Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
  16. Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
  17. Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
  18. Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  19. Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
  20. St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
  21. Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
  22. Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , CRC Press. New York. (1998).
  23. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  24. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
  25. Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
  26. Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
  27. Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דימות תאים חייםקונפוקלי עם דיסק מסתובבקולטני ניקוטין לאצטילכוליןהכנת כימרות גנטיותמעגל היפוקמפוס ונטרלי-נוקליאוס אקומבנסצביעת FM 1-43אינדיקטור סידן Flu-4
הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.