הנכסים ומייקרו של המטריצה תאית מכאניים מאוד משפיעים על הגירת 3D של תאים. שיטה במבחנה ללמוד spatiotemporal התנהגות נדידת תאים בסביבות biophysically משתנים, בשתי רמות אוכלוסייה ותא בודדות, מתואר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מערכת ג'ל קונצנטריים כדי ללמוד את תפקיד Biophysical של מטריקס מייקרו-סביבה על נדידת תאי 3D
במאמר זה
סיכום
תקציר
היכולת של תאים לנדוד היא חיונית במגוון רחב של פונקציות תא לאורך כל חיים מהתפתחות עוברית וריפוי פצעים לגידול וגרור סרטני. למרות מאמצי מחקר אינטנסיביים, העקרונות ביוכימיים וbiophysical הבסיסיים של נדידת תאים עדיין לא הבינו באופן מלא, במיוחד במייקרו-הסביבות הרלוונטיות מבחינה פיזיולוגית תלת ממדי (3D). כאן אנו מתארים assay במבחנה נועד לאפשר בחינה הכמותית של התנהגויות נדידת תאי 3D. השיטה מנצלת את יכולתו של התא mechanosensing ונטייה לנדוד לתוך מטריצה פנויה בעבר תאי (ECM). אנו משתמשים בפלישה של תאי סרטן השד פולשני מאוד, מד"א MB-231, ג'ל קולגן כמערכת מודל. התפשטות אוכלוסיית תא ודינמיקת ההגירה של תאים בודדים מעל שבועות של התרבות ניתן לנטר באמצעות Live- תא הדמיה וניתחו כדי לחלץ נתונים spatiotemporally נפתרו. יתר על כן, השיטה היא להתאמה בקלות למטריצות תאית מגוונות, ובכך להציע דרך פשוטה אך רבת עוצמה כדי לחקור את תפקידם של גורמי biophysical במייקרו-הסביבה על נדידת תאים.
מבוא
נדידה של תאים ממלאים תפקיד מרכזי בתגובות פיסיולוגיות שונות כגון התפתחות עוברית, haemostasis, ותגובה חיסונית, כמו גם בתהליכים פתולוגיים כגון מחלות לב וכלי דם, דלקת, וסרטן 1. לנתח את הגורמים ביוכימיים וbiophysical יסוד נדידת תאים ולכן חשוב ביסודו לא רק כדי להבין את העקרונות הבסיסיים של פונקציות סלולריות, אלא גם לקידום יישומים ביו-רפואיים שונים, כגון בהנדסת רקמות, אנטי-גרורות ופיתוח תרופות אנטי-דלקתי. מאז תצפית in vivo היא מאתגרת מבחינה טכנית, הרבה מאמצים התמקד בסיכום במבחנה של נדידת תאים.
בשיטות מבחנה ללמוד נדידת תאים במידה ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
קציר 1. תא
- להשיג MD-MBA-231 תאים מ37 ° C, החממה 5% CO 2. ניתוק תאים מצלחת תרבית רקמה באמצעות 0.5% פתרון טריפסין- EDTA. השתמש 1 מיליליטר של תמיסת טריפסין-EDTA לתאים בתרבית בבקבוק T25.
- תאים גלולה בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב × 200 גרם במשך 4 דקות, לשאוב supernatant, ותאי resuspend ב 5 מיליליטר של תקשורת בתרבות.
- לספור צפיפות תאים, ρ, באמצעות hemocytometer.
הערה: כדי להכין את הג'ל הפנימי התא-זרע, הה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Assay ג'ל קונצנטריים מוצג כאן בוצע באמצעות תאי סרטן השד פולשני מאוד, מד"א MB-231, עם 2.4 מ"ג / מיליליטר ג'ל קולגן הפנימי וצפיפות זריעת תא של = 2 × 10 6 תאים / מיליליטר, כדוגמא. כפי שניתן לראות באיור 2, בדרך כלל אחרי כמה ימים של תרבות, תאי הפר ממשק ג'ל הפנימי-חיצוני והתחילו לפלוש ג'ל החיצוני. אוכלוסיית התא התפשטה בעיקר רדיאלית החוצה.
תנאי פילמור של ג'ל החיצ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול זה אנו מתארים מבחן חוץ גופי לחקר התנהגות הנדידה התלת-ממדית של תאים בסביבות מטריצה הדומות טופולוגית ל-ECMs שנתקלו בהם in vivo. ישנן שלוש נקודות חוזק עיקריות של בדיקה זו בהשוואה לשיטות אחרות הזמינות כיום. ראשית, בדיקה זו מאפשרת לבחון בו זמנית את מנגנוני נדידת התאים הן ברמת האוכלוסייה והן ברמת התא הבודד. זה פותח אפשרויות לחקור נדידת תאים קולקטיבית13, שעד כה הוגבלה במידה רבה למבחנים דו-ממדיים14, תוך התבוננות בהתנהגות התא הבודד בתוך האוכלוסייה. עבור תאים שאינם נודדים באופן טבע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש לי המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים W. שמש וק Jansen לדיונים הביקורתיים, ומכירים תמיכה על ידי מעבדת ביומכניקה Nano באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. NAK מודה תמיכה על ידי מארי קירי IIF מלגה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חממת תרביות תאים | Fisher Scientific Pte Ltd | דגם: 371, S/No 318854-6055 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי | Nikon A1R | מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך מצויד בתא חממה | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
| צבע CellTracker פלואורסצנטי CMTMR | Life Technologies | C2927 | |
| צלחת תחתית זכוכית | IWAKI Cell Biology | 3931-035 | צלחת בקוטר 35 מ"מ עם באר תחתית זכוכית בקוטר 12 מ"מ |
| Hemocytometer | iN CYTO | DHC-N01 (Neubauer Improved) | |
| מד pH של מיקרו-מעבד | Hanna Instruments | pH 211 | |
| Nutragen קולגן | מתקדם BioMatrix | #5010-D | קולגן בקר מסיס בחומצה מסוג I (מלאי pH ~ 2) |
| עדשת אובייקטיבית | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9 מ"מ, NA 0.45. | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Life Technologies | 15140-122 | |
| מד pH | Sartorius | S/No 29153352 | מד pH בסיסי PB-11 |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 |
מקורות
- Horwitz, R., Webb, D. Cell migration. Curr Biol. 13 (19), R756-R759 (2003).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Provenzano, P. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
