מאמר שיטה

איתור של α-סינוקלאין קשורים למחלות על ידי ELISA משופר במוח של עכברים הטרנסגניים ביתר A53T אדם מוטצית α-סינוקלאין

10.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52752

⸱

30 במאי 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neurodegenerative Diseases Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 2Indicia Production, 3AJ Roboscreen GmbH, 4Epidemiology Unit, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety, 5Experimental Facilities, ANSES - French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety

במאמר זה

סיכום

מתואר ELISA המציע גישה כמותית חדשנית. הוא מגלה באופן ספציפי α-סינקליין הקשור למחלה (αSD) במודל עכבר מהונדס (M83) של סינקלינופתיה באמצעות מספר נוגדנים נגד צורת ה-αS המפוספסת ב-Ser129 או החלק ה-C-סופי של החלבון.

תקציר

בנוסף לשיטות מבוססות כמו כתם מערבי, יש צורך בשיטות חדשות לכמת במהירות ובקלות α-סינוקלאין הקשורים מחלה (αS D) במודלים ניסיוניים של synucleopathies. קו מהונדס עכבר (M83) αS A53T האנושי ופיתוח הפנוטיפ קליני דרמטי בין שמונה ו -22 חודשים של גיל, מאופיינים בתסמינים כוללים ירידה במשקל, השתטחות, וירידת ערך באופן ספונטני מוטורי קשה להביע מעל, שימש במחקר זה. עבור ניתוחים מולקולריים של αS D (αS הקשורים למחלות) בעכברים אלו, ELISA נועד לכמת במיוחד αS D בעכברים חולים. ניתוח של מערכת העצבים המרכזית במודל עכבר זה הראה הנוכחות של αS D בעיקר באזורים במוח הזנב וחוט השדרה. לא היו הבדלים בהתפלגות αS D בין תנאי ניסוי שונים שמוביל למחלה קלינית, כלומר, בuninoculated ובדרך כלל הזדקנות עכברים הטרנסגניים ובעכברים מחוסן עם תמציות מוח מעכברים חולים. זיהוי הספציפי של immunoreactivity D αS באמצעות נוגדן נגד Ser129 phosphorylated αS ידי ELISA בעצם מתואם עם שהושג על ידי כתם ואימונוהיסטוכימיה מערביים. באופן בלתי צפוי, תוצאות דומות נצפו עם כמה נוגדנים אחרים נגד חלק C-מסוף של αS. ההתפשטות של αS D, המצביעה על המעורבות של מנגנון "כמו הפריון-", לכן יכולה להיות במעקב בקלות ולכמת במודל עכבר זה באמצעות גישת ELISA.

מבוא

רוב השיטות הנוכחיות לזיהוי α-סינקלין הקשור למחלות (αSD) במודלים ניסויים של מחלת פרקינסון (PD), כגון אימונוהיסטוכימיה או ווסטרן בלוט, הן עתירות זמן ואינן כמותיות. מחלה ניוונית זו מאופיינת בצבירה של אלפא-סינקלין בעיקר בצורה של תכלילים המכילים צורה מצורבת של החלבון הטרום-סינפטי המסיס בדרך כלל αS1,2 (גופיפי לוי וניוריטי לוי). בדרך כלל רק זרחן באופן שוליים, αS מזורחן יתר על מידה בשארית הסרין 129 בתכלילים אלו3 וניתן לנטר אותו על ידי נוגדנים המכוונים במיוחד נגד αS זורחן Ser129, ובכך מספקים סמן אמין של הפתולוגיה.

מחקרים עדכניים מצביעים על כך שמנגנון "דמוי פריון" יכול להיות מעורב בהתפשטות הצבירה של αS בתוך מערכת העצבים של מטופל מושפע4,5. מחקרים אלו דיווחו על האצת סינוקלינופתיה על ידי חיסון של תמציות מוח המכילות αSD לתוך מודל עכבר מהונדס (M83) המבטא חלבון αS אנושי מוטציה A53T הקשור לפגיעה מוטורית חמורה המתרחשת עם הזדקנות העכברים6. באופן דומה, חיסון תוך-מוחי של αS רקומביננטי מצורב באותו מודל עכבר M83 אישר את האצת הצבירה5. השראה של משקעים של αS זורחן דווחה גם לאחר חיסון של עכברי C57Bl/6 בריאים עם חלבון αS רקומביננטי פיברילארי או תמציות מוח מחולי DLB אנושיים7,8. Sacino et al.9 הצביעו לאחרונה על כך שלאחר הזרקת αS אנושי פיברילארי, היווצרות תכלילי αS מוחית נרחבת ומתקדמת יכולה להיות מושראה בעכברי M83, אך לא בעכברי מהונדס E46K או בעכברים לא מהונדסים בהם תכלילי αS מושרה היו חולפים, ומוגבלים בעיקר לאתר ההזרקה. מחקרים עדכניים על קופים אישרו את התפשטות הצברים של αS לאחר חיסון של תמציות שנגזרו מ-PD במינים הקרובים יותר לבני אדם10.

הקישור בין שינויי αS למחלת פרקינסון מרמז שαSD הוא סמן פוטנציאלי עבור מחלת פרקינסון11. מחקר עדכני הראה את זיהוי האגרגטים הסוליביליים האוליגומריים של α-סינקלין בנוזל המוח והשדרה האנושי (CSF) ובפלזמה כסמן פוטנציאלי עבור מחלת פרקינסון על סמך מערכת סנדוויץ' קונבנציונלית ELISA באמצעות אותו נוגדן ללכידה וזיהוי αS12. על פי אותה שיטה, זוהו חלבונים מולטימריים בדגימות ביולוגיות, כולל המוח, מכיוון שיש מספר עותקים של אפיטופים הקיימים בצורות המורכבות13. לאחרונה, αS פתולוגי ב-CSF של חולים עם פתולוגיית גוף לוי מוכחת זוהה באמצעות ערכת ELISA עם נוגדן ספציפי במיוחד נגד αSD (5G4) ובאמצעות בדיקת אימונופריציפיטציה14. שיטות אלו יכולות להבדיל בין חולים עם PD/DLB לבין סוגים אחרים של דמנציה.

ההתפשטות ה"דמוית פריון" של הצבירה של αS נחקרה עוד יותר במודל עכבר מהונדס M83 באמצעות גישת ELISA שתוכננה לזיהוי ספציפי של αSD15. במחקר זה, אנו מדווחים על פרוטוקול ה-ELISA המפורט המשמש לזיהוי כמותי של αSD בעכברים חולים (בין אם חוסנו עם αSD מעכברי M83 חולים ובין אם לאו) ובמיוחד באזורי המוח הממוקדים במיוחד על ידי התהליך הפתולוגי במודל עכבר מהונדס M83 זה4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים והפרוטוקולים מעורבים בעלי חיים היו בהתאם לEC Directive 86/609 / EEC ואושרר על ידי יבוא, הוועדה הלאומית הצרפתית לשיקול אתי בניסויים בבעלי חיים (פרוטוקול 11-0043). בעלי החיים שוכנו וטיפלו בANSES של אושר מתקנים ניסיוניים בליון (אישור B 69,387 0801).

1. הכנת עכברים

  1. להרדים עכברים על ידי הזרקת intraperitoneal של מנה הקטלנית של pentobarbital נתרן.
  2. אחזר את המוח כולו מגולגולת העכבר ולמקם אותו בצלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ על קרח עד מיצוי.
  3. לחלץ את חוט השדרה הצווארי.
    הערה: αS או מאחד חצאים המוח לאחר חתך sagittal או ממוח עכבר גזור, זמין לאחר הניסויים מפורטים בטבלה 1 תמצית.
Experimenלא עכברים
הבידוד (שווה ערך מוח) 		תקופת הישרדות
(Dpi) 		חציון / הישרדות מקסימלי
(ימים) 		αS זיהוי ד ידי ELISA
/ WB / IHC
1 עכברי Uninoculated 441 ± 166 419/736 8/8
2 עכברים מחוסן (0.2 מ"ג) 150 ± 52 140/241 9/9

רשימת טבלת 1. של ניסויים שבוצעו על עכברי M83. חיסונים בוצעו לאחר 6 שבועות לניסוי 2 באזור striato-קליפת המוח עם 20 μl של homogenate מוח של עכבר חולה (כרך / WT 1% ברמת סוכר 5%), לאחר הרדמה של עכברים הומוזיגוטים בן 6 שבועות M83 ב -3% שאיפת isoflurane. dpi: ימי הודעה inoculני.

2. αS הפקה ממוח חצאים

  1. Sagittally לחתוך את המוח כדי להשיג שני חצאים. לשקול כל מחצית בצינור ribolysis מכיל כדורי טחינה.
  2. הכן חיץ מלח גבוה (HS) המכיל 50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.5, 750 מ"מ NaCl, 5 מ"מ EDTA, 1 מ"מ DTT, קוקטיילים phosphatase ומעכבי פרוטאז 1%. הוסף חוצץ מלח הגבוה לחצאים המוח כדי להשיג 20% homogenates (משקל / נפח).
  3. הכן דגימות מהחצאים המוח באמצעות homogenizer מכאני על 6.0 מ '/ s במשך 23 שניות פעמיים. לאחר הומוגניזציה 23 שניות הראשונות, למקם את הצינורות המכילים את homogenates על קרח למשך 2 דקות לפני מחזור 23-שניות השניה.
  4. צנטריפוגה דגימות XG ב 1000 במשך 5 דקות כדי לחסל ברי מוח unground. לשחזר את supernatants, מתחלק לaliquots 200 μl ולשמור אותם ב -80 ° C לניתוח ELISA שלאחר מכן.

3. αS הפקה מאזורי המוח גזור

  1. לנתחהמוח כולו בצלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ על קרח עם זכוכית מגדלת חשמל נמוכה (הגדלה 8X) באמצעות שתי forcipes שקצוות נשמרים יחד למעט כאשר לנתח את ההיפוקמפוס. לא יעלה על 10 דקות כדי לשמור על שלמות מוח. מניחים את המוח בצד ימין למעלה ולאחזר את האזורים במוח הבאים לפי סדר הבא:
    1. נפרד אחד משתי נורות חוש הריח באמצעות מלקחיים להציב מאחורי הנורה. לנתק אותו מהמוח על ידי תנועה כלפי מטה. חזור על פעולה זו עבור הנורה השנייה.
    2. בעדינות טריז המלקחיים בין שני cortexes ולהעביר אותה קדימה כדי להקל על ניתוק של שני cortexes. שמירה על המוח במקום אחד עם מלקחיים, להשתמש עוד להפריד את הקליפה מן ההיפוקמפוס.
    3. מקם את המלקחיים 2 מ"מ מתחת לקליפת המוח. לשמור על לחץ עדין על המלקחיים עד החלק העליון של ההיפוקמפוס הוא גלוי. לקלף את החלק הראשון של קליפת המוח, ולחזור עם החלק השני. השתמש במלקחיים כדי להפריד בין שני cortexesהחל משעת ההיפוקמפוס ונע לכיוון החלק הקדמי של המוח.
    4. מקם את המלקחיים הפתוחים סביב אחד hippocampi. סגור את המלקחיים בתחתית של ההיפוקמפוס אז בעדינות להסיר אותו, מתאושש ככל האפשר. חזור על התהליך עבור ההיפוקמפוס השני.
    5. מקם את המלקחיים הפתוחים מתחת לאחת מstriata ועדינות להפריד אותו מהמוח. השתמש במלקחיים כדי להסיר כל קליפה שנותרה מסטריאטום. חזור על תהליך זה עבור סטריאטום השני.
    6. השתמש במלקחיים כדי לדכא בעדינות על ידי 2 מ"מ קווי המתאר של המוח הקטן כדי להקל על הפרדה של המוח הקטן מהמוח. מניחים את המלקחיים ממש מאחורי המוח הקטן ולהסיר אותו על ידי העברת המלקחיים קדימה.
    7. השתמש בחלק הרחב של המלקחיים כדי להעלות את mesencephalon כדי לראות בבירור שבו מצטרף לגזע המוח. לעשות חתך אנכי בצומת לאחר מכן להסיר את גזע המוח.
    8. מקם את המלקחיים מאחורי mesencephalon, שבו אנישעות מורכבות מארבעה מבנים מעוגלים. לחתוך בצורה אנכית עד mesencephalon הופרד לחלוטין מהמוח שנותר.
  2. הכן homogenates של% משתנים (משקל / נפח) במאגר HS, בהתאם לכמות של רקמות זמינות, כלומר, homogenate 5% למשקל בין 10 ו -30 מ"ג, 10% למשקל בין 30 ל 80 מ"ג, ו -20% למשקל מעל 80 מ"ג.
    1. להוסיף נפח מתאים של חיץ HS לאזורים במוח גזור להשגת% הצפויים של homogenate.
    2. וורטקס ולבדוק שהרקמות שקועים לחלוטין במאגר HS.
    3. Homogenize דגימות שהוכנו מאזורי המוח גזור או חוט השדרה הצווארי עם מטחנת רקמה המורכבת משפופרת זכוכית בורוסיליקט ושני עליים, A ו- B.
    4. יוצקים כל אזור במוח שנמחץ ישירות לתוך הצינור. הכנס העלי לתוך הצינור ולחזור בו. חזור על תנועה זו כעשר פעמים ללנתק את הרקמה. לאחר מכן להשתמש העלי 'לגontinue טחינת הרקמה עם 20 תנועות נוספות. העבר את homogenates לתוך צינור 1.5 מיליליטר עם טפטפת העברה 1 מיליליטר.
  3. צנטריפוגה דגימות XG ב 1000 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס לחסל את כל שברי מוח unground. אחזר את supernatants, לחלק אותם לaliquots 200 μl ולשמור אותם ב -80 ° C לניתוח ELISA שלאחר מכן.

4. איתור של αS ידי ELISA

  1. לדלל את נוגדני ציפוי ל0.01 ng / ml. השתמש באחת אנטי-αS ארנב polyclonal או נוגדן חד שבטי בשיבוט 42 50 2 CO 3 / NaHCO חיץ מ"מ Na 3 (pH 9.6).
  2. מעיל עם כל טוב של פתרון ציפוי זה 100 μl, ולהשאיר 96 גם microplates על 4 מעלות CO / N. השתמש בנוגדן polyclonal הארנב נגד αS בפתרון הציפוי לELISAs באמצעות נוגדני זיהוי syn514, לשכפל 42, LB509, AS11, 4D6 או 8A5. השתמש בשיבוט הנוגדן חד שבטי נגד αS 42 כפתרון ציפויבשילוב עם נוגדני זיהוי αS אנטי-pSer129.
    הערה: אם יש צורך, הצלחות עשויות להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע אחד לפני ELISA מתבצע.
  3. השתמש מכונת כביסה צלחת לשטוף את הצלחות חמש פעמים עם 300 μl של פוספט שנאגרו מלוח עם 0.05% Tween 20 (PBST) בכל טוב. מהצעד הזה והלאה, דגירה היא על RT.
  4. הוסף 200 μl של T20 PBS חיץ חסימה בכל טוב. Shake עבור שעה 1 ב 150 סל"ד. לשטוף את הצלחות חמש פעמים עם PBST.
  5. לדלל את homogenates המוח (דילול 1: 100 של homogenates 20%, 01:50 של homogenates% 10 ו01:25 של homogenates 5% בPBST BSA 1%), ולהוסיף 100 μl היטב כל אחד. אז דגירה של 2 שעות בזמן שלוחץ על 150 סל"ד. לשטוף את הצלחות חמש פעמים עם PBST.
  6. הוסף את נוגדני זיהוי αS השונים בPBST עם BSA 1% בדילולים מוזכרים ברשימת חומרים. דגירה עבור שעה 1 ב 150 סל"ד. לשטוף את הצלחות חמש פעמים עם PBST.
  7. להוסיף או אנטי-mouse או conjugates HRP IgG נגד ארנב בדילול 1: 8,000 בPBST בתוספת 1% BSA עבור שעה 1 בעוד הרועד בסל"ד 150. לשטוף את הצלחות חמש פעמים עם PBST.
  8. הוסף ל3,3 ", פתרון 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) 100 μl לכל היטב דגירה במשך 15 דקות בחושך בזמן רועד בסל"ד 150.
  9. לעצור את התגובה על ידי הוספה של 1 N HCl 100 μl לכל גם אז למדוד את הספיגה ב 450 ננומטר עם קורא microplate.
  10. לניתוח נתונים, לחסר ערך OD שהתקבל בהיטב עם כל חומרים כימיים, למעט כל דגימות מוח עכבר (גם ריק) מערכי OD נמדדו עבור כל אחת מהדגימות נותחו.

5. epitope מיפוי

  1. לבצע מיפוי epitope לפי השיטה שתוארה על ידי אוסמן 16. בקצרה, פפטידים מקום של רצף α-סינוקלאין האנושי המכיל 12 חומצות אמינו על nitrocellulose עם 10 חומצות אמינו חופפות.
  2. לחסום עם 50 מ"מ טריס / pH חיץ 150 מ"מ NaCl 10 המכיל 0.05% Tween 20 ו 5% אבקת חלב. דגירה הנוגדן בחסימת פתרון בריכוז של 2 נוגדן מיקרוגרם למ"ל ב2-10 ° CO / N.
  3. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים באמצעות 50 מ"מ טריס / 150 pH חיץ מ"מ NaCl 10 המכיל 0.05% 20. דגירה Tween עם המצומד אנטי עכבר IgG HRP העז. שטוף את הקרום חמש פעמים נוספות תוך שימוש באותה החיץ אז כתם באמצעות ערכת צביעת הכתם TMB מערבית.

6. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש בתוכנת R וnlme החבילה לבצע רגרסיות מעורבת לוואי מודל OD. עבור כל השוואה, לבצע מודל רגרסיה השפעה מעורב. השתמש השפעה קבועה להבחין סימפטומטי מקבוצות ללא תסמינים.
  2. השתמש השפעה אקראית על מנת לשקף את השונות של חזרות לעכבר נתון. בדוק הומוסקדסטיות על ידי בחינת השאריות ואם יש צורך, להשתמש בפונקציות השונות למודל המבנה השונות של שגיאות בקבוצה בקנה אחד עם פיניירו ו1 בייטס7. קבע 0.05 כסף המשמעות של פ

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במחקר זה, ELISAs משמש לזיהוי ספציפי αS הקשורים מחלה (αS D) בhomogenates המוח נערכה בחיץ מלח גבוה מעכברי M83 חולים. באמצעות נוגדן ספציפי הכרת pSer129 αS (p = .0074), ELISA בקלות מבדיל עכברים זקנים, חולים (> בת 8 חודשים) מ( 2-5 חודשים) הצעירים, עכברי M83 בריאים (איור 1). כמה נוגדנים אחרים הראו אותות גבוהים באופן דומה (> 0.6 OD) רק בhomogenates המוח מעכברים חולים. זהו המקרה ל4D6 (p = 0.01), LB509 (p = .0047) ו8A5 (p <0.001) נגד רצפים שונים של חלק ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השימוש בELISA הודגם כדי לזהות באופן ספציפי αS D ישירות מhomogenates מוח עכבר במחלה במודל העכבר המהונדס M83. ואכן, זה יכול בקלות ELISA להבחין עכברי M83 חולים מעכברי M83 בריאים באמצעות homogenates המוח רק כל חיץ מלח הגבוה.

השלבים הקריטיים ביותר לתוצאות מוצלחות באמצעות ELISA זה הם: נכון לנתח האזורים השונים של מוח העכבר על ידי פיתוח המיומנות הידנית הנחוצה כדי למנוע נזק במהלך נתיחה; ביצוע דילולים מדגם באופן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין למחברים אינטרסים מתחרים לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות לדמיאן Gaillard לחיסונים ומעקב של ניסויים בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי ANSES (הסוכנות הצרפתית למזון, סביבה ובריאות תעסוקתית ובטיחות) ועל ידי מענק מהקרן צרפת פרקינסון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
LB509Abcamab27766Detection antibody 1/2,000
AS11Produced at AnsesDetection antibody 1/1,000
4D6Abcamab1903Detection antibody 1/2,000
PSer129Abcamab59264Detection antibody 1/3,000
PSer129 EP1536YAbcamab51253Detection antibody 1/1,000
syn514Abcamab24717Detection antibody 1/500
clone 42BD Biosciences610787Coating and detection antibody (1/2,000)
8A5Provided by Dr. AndersonDetection antibody 1/2,000
polyclonal anti-αsyn antibodyMilliporeAB5038PCoating antibody
Anti-mouse IgG HRP conjugateSouthern Biotech1010-05
Anti-rabbit IgG HRP conjugateSouthern Biotech4010-05
Goat anti-mouse IgG HRP conjugateDianova115-035-164
HS bufferAdjust at pH 7.5 and keep at 4 °C
  • Tris-HCl 50 mM
Euromedex26-128-3094-B
  • NaCl 750 mM
Euromedex1112-A
  • EDTA 5 mM
EuromedexEU0007-B
  • DTT 1 mM
Sigma43815
PBSAdjust at pH 7.5
  • Na2HPO4 1 mM
Euromedex1309
  • KH2PO4 1.5 mM
Euromedex2018
  • NaCl  137 mM
Euromedex1112-A
  • KCl 2.7 mM
EuromedexP017
Tween 20Euromedex2001-C
BSASigmaA7906
DTT 1 mMSigma43815Stock solution 100 mM, toxic
1% phosphatase cocktailPierce78428
1% protease inhibitor cocktailRoche04 693 132 00150x concentrated
Microplate MaxiSorpTMThermo Scientific442404
Tampon carbonate 50 mM pH 9.6
  • Na2CO3, 10H2O
Sigma713602.86 g/L
  • NaHCO3
Merk63293.36 g/L, pH 9.6
Superblock T20 PBS blocking bufferPierceE6423H10x concentrated
TMBSigmaT0440Used for ELISA
TMBAnalytik Jena AG847-0104200302Used for epitope mapping
HCl 1 NChimie plus40030
RibolyserThermoFast prep FP120keep on ice at this step
Grinding tubesBiorad355-1197
Plate washerTecanColumbus Pro
Plate readerBioradModel 680
Low power magnifier VWR630-10628X magnification
Forceps Dumont#7WPI14097For dissection steps
Transfer pipette 1ml SamsoSamso043231
1.5 ml tubesDutscher033290

מקורות

  1. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat Rev Neurol. 9, 13-24 (2013).
  2. Waxman, E. A., Giasson, B. I. Specificity and regulation of casein kinase-mediated phosphorylation of alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 402-416 (2008).
  3. Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. J Biol Chem. 281, 29739-29752 (2006).
  4. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, 2225-2228 (2012).
  5. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209, 975-986 (2012).
  6. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34, 521-533 (2002).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  8. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain : a journal of neurology. 136, 1128-1138 (2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Amyloidogenic alpha-synuclein seeds do not invariably induce rapid, widespread pathology in mice. Acta neuropathologica. 127, 645-665 (2014).
  10. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from parkinson's disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. , (2013).
  11. Foulds, P. G., et al. Phosphorylated alpha-synuclein can be detected in blood plasma and is potentially a useful biomarker for Parkinson's disease. FASEB J. 25, 4127-4137 (2011).
  12. El-Agnaf, O. M., et al. Detection of oligomeric forms of alpha-synuclein protein in human plasma as a potential biomarker for Parkinson's disease. Faseb J. 20, 419-425 (2006).
  13. Lee, H. J., et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities. J Neruosci Meth. 199, 249-257 (2011).
  14. Unterberger, U., et al. Detection of disease-associated alpha-synuclein in the cerebrospinal fluid: a feasibility study. Clin Neuropathol. 33, 329-334 (2014).
  15. Betemps, D., et al. Alpha-synuclein spreading in M83 mice brain revealed by detection of pathological alpha-synuclein by enhanced ELISA. Acta Neuropathol. (Berl). 2, 29(2014).
  16. Osman, A. A., et al. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins). Eur J Gastroenterol Hepatol. 13, 1189-1193 (2001).
  17. Pinheiro, J. C., Bates, D. M. Ch. 5. Mixed-Effects Models in S and S-PLUS. Chambers, J. 5, Springer. 206-225 (2000).
  18. Mougenot, A. L., et al. Production of a monoclonal antibody, against human alpha-synuclein, in a subpopulation of C57BL/6J mice, presenting a deletion of the alpha-synuclein locus. J Neruosci Meth. 192, 268-276 (2010).
  19. Specht, C. G., Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC Neurosci. 2, 11(2001).
  20. Lee, B. R., Matsuo, Y., Cashikar, A. G., Kamitani, T. Role of Ser129 phosphorylation of alpha-synuclein in melanoma cells. J Cell Sci. 126, 696-704 (2013).
  21. Perrin, R. J., et al. Epitope mapping and specificity of the anti-alpha-synuclein monoclonal antibody Syn-1 in mouse brain and cultured cell lines. Neurosci Lett. 349, 133-135 (2003).
  22. Emmanouilidou, E., et al. Assessment of alpha-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6, e22225(2011).
  23. Mougenot, A. L., et al. Transmission of prion strains in a transgenic mouse models overexpressing human A53T mutated alpha-synuclein. J Neuropathol Exp Neurol. 70, 377-385 (2011).
  24. Foulds, P. G., et al. A longitudinal study on alpha-synuclein in blood plasma as a biomarker for Parkinson's disease. Sci Rep. 3, 2540(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ELISAWestern BlotPhospho Ser129

מאמרים קשורים