מאמר שיטה

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

10.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52756

⸱

25 ביוני 2015

 ,  , 
1Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Ulm University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר.

תקציר

דג הזברה הפך לאורגניזם מודל חשוב מאוד לחקר התפתחות בעלי חוליות, פיזיולוגיה, מחלות והתחדשות רקמות. הבנה מעמיקה של המנגנונים המולקולריים והתאים המעורבים דורשת כלים ניסיוניים המאפשרים מניפולציה ספציפית לרקמה של ביטוי גנים או מסלולי איתות. לכן, אנחנו ואחרים התאמנו לאחרונה את מערכת TetON לשימוש בדגי זברה. מערכת TetON מאפשרת ביטוי גנים מבוקר זמנית ומרחבית ולאחרונה השתמשנו בכלי זה כדי לחקור פונקציות ספציפיות לרקמות של איתות Wnt/beta-catenin במהלך התחדשות סנפיר זנב דג הזברה. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה לשימוש במערכת TetON להשגת ביטוי גנים ספציפי לרקמה בסנפיר הזנב המתחדש של דג הזברה הבוגר. זה כולל יצירת קווי TetActivator ו-TetResponder טרנסגניים יציבים, אינדוקציה טרנסגנית וטכניקות לאימות ביטוי גנים ספציפיים לרקמה בהתחדשות הסנפיר. לפיכך, פרוטוקול זה משמש כתוכנית להקמת מערכת TetON פונקציונלית בדגי הזברה והשימוש בה לאחר מכן, במיוחד לחקר התחדשות סנפירים.

מבוא

דג הזברה הוא אורגניזם מודל חוליות מבוסס היטב ללמוד היבטים רבים של פיתוח, פיזיולוגיה, מחלות, והתחדשות. עם האימוץ הגובר של דג הזברה כמודל לתהליכי פוסט-עובריים ביולוגיים, כלים ניסיוניים למניפולציה של ביטוי גנים או מסלולי איתות מושרה, רקמות ספציפיות הפכו חשוב יותר ויותר. במיוחד, מחקרים לאיברים והתחדשות תוספת בדג זברה מבוגרת סובלים ממחסור בכלים לניתוח של דרישות מרחב ובזמן של מסלולי איתות בתהליכי התחדשות אלה.

נכון לעכשיו, שלוש מערכות שונות שימשו להשגת ביטוי מותנה, רקמות ספציפיות גנים בהתחדשות איברים של דג הזברה מבוגרת: מערכת טיטון מערכת Cre-לקס, ביטוי פסיפס של transgenes מושרה חום-הלם באמצעות transgenesis הגופנית בתיווך transposon, ו1 -3. טיטון מתייחס לגרסה של טטרציקלין-המשךמערכת התגלגלה תעתיק הפעלה, שבו הביטוי מופעל בנוכחות טטרציקלין האנטיביוטיקה או נגזרת, למשל דוקסיציקלין. מערכת Cre-לקס, כפי שעד כה השתמש בדגים בוגרים, מסתמכת על recombinase שליטת טמוקסיפן Cre (CreERT2), הביטוי שהוא מוגבל במרחב על ידי גורמי רגולציה רקמות ספציפיות. ההסרה מונעת-Cre של קלטת STOP מאפשרת ביטוי של הגן של עניין מונע על ידי אמרגן שצריכה להיות פעיל בכל סוגי התאים 1. יצירה בתיווך transposon של transgenes הגופני הביע mosaically מספקת מערכת לביטוי transgene מושרה בשושלות תאים בודדות. הזרקה של עוברי דג הזברה עם transposon Tol2 נושא גן של עניין בשליטת תעתיק של תוצאות אמרגן הלם חום באנשי chimeric בדרך כלל נושאים את הגן רק בשושלות תאים נפרדות של איבר התחדשות 2. בעוד שני המערכות מאפשרות לרקמות SPE המותנהביטוי גני cific, מערכת Cre-לקס הוא לא הפיכה, ואת האסטרטגיה באמצעות תיוג משובט מבוסס transposon סובלת מהטבע סטוכסטיים שלה. לפיכך, אנו ואחרים לאחרונה מותאמים מערכות מהונדסים טיטון לשימוש בדג זברה, המאפשרות באופן זמני וביטוי גנים במרחב שבשליטה שהוא במתכונן בנוסף ו3-5 הפיכים.

מערכת טיטון משמשת כאן כוללת קו מהונדס נהג (TetActivator) שבדוקסיציקלין (DOX) activator תעתיק -inducible (שיפור transactivator ההפוך טטרציקלין, irtTA, Teta הקצר) הוא תחת שליטה של ​​רצפים רגולטוריים הגנומי רקמות ספציפיות. שנית, היא דורשת קו מגיב מהונדס (TetResponder) שמטפח גן של עניין בשליטת תעתיק של מפעיל טטרציקלין; (איור 1 א) (אלמנט תגובת ט TetRE). לפיכך, השימוש בשילובים מסוימים של קווי TetActivator וTetResponder מאפשר לרקמות ספציפיות מותנותמניפולציה פיק של ביטוי גנים.

יש לנו לאחרונה ניצלתי את מערכת טיטון לחקור לפונקציות רקמות הספציפיות של איתות / בטא קטנין Wnt במבוגרי התחדשות זנב דג הזברה סנפיר 3. בפרוטוקול המתואר כאן אנו מתארים את זרימת עבודה להקמה ושימוש במערכת טיטון בדג זברה, בפרט ללימודים של התחדשות סנפיר. זה כולל הוראות מפורטות על איך ליצור קווי TetActivator וTetResponder מהונדסים יציבים ופרוטוקול לזירוז transgene בעוברים ודג זברה מבוגרת. יתר על כן, אנו מתארים טכניקות לאימות ביטוי רקמות ספציפיות גנים בלהתחדש הסנפיר, כולל פרוטוקול להכנת cryosections של סנפירי דג הזברה מבוגרים. בנוסף, אנו דנים שיקולים לעיצוב של transgene TetActivator, הבחירה של שיטת transgenesis, וזיהוי של ביטוי TetResponder. לפיכך, המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לשמש כתכניתלהגדרה-עד מערכת טיטון פונקציונלית בדג הזברה להשיג ביטוי מותנה רקמות ספציפיות גן, אשר יכול להיות מיושם על כל רקמות של עניין.

יצרנו וקטור TetActivator מאפשר לאני-SCEI או דור תיווך Tol2 של קווי TetActivator יציבים באמצעות רצפים רגולטוריים הגנומי קצרים (שברים משפר; מסד נתוני פלסמיד מעבדה וייגינגר לא 1,247;. איור 1). מבנה זה מכיל קלטת TetActivator בהיקף של גרסת המוטציה M2 של תחום זה מדכא את ההפוך ט התמזגו עם תחום נגזרים 3F transactivation VP16 וירוס הרפס סימפלקס [irtTAM2 (3F)]. ביטוי של TetActivator (Teta) יכול להיות במעקב בקלות שכן הוא עם AmCyan fluorophore מאותה מסגרת קריאה פתוחה הביע שיתוף; פפטיד p2a מתווך דילוג ריבוזומלי, שאמור לגרום לייצור של תטא וAmCyan חלבונים נפרדים של 1: 5,6 יחס 1. המבנה מכיל גם poylinker 5 'של Tקלטת etActivator כדי להקל על החדרה של רצפים רגולטוריים הגנומי של עניין באמצעות שיטות שיבוט קונבנציונליות.

בנוסף, יצרנו מבנה המורכב של הקלטת מעל תיארה TetActivator בתוספת קלטת בחירת Kanamycin (מסד נתונים פלסמיד מעבדה וייגינגר לא 1,180;. איור 1 ג), שבו ניתן recombined לתוך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) המכילה אזור הגנומי גדול ( בדרך כלל לקודון ההתחלה של גן הביטוי שתבנית היא לחיקוי על ידי transgene). שני המבנים זמינים מהמעבדה וייגינגר על פי דרישה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דור של קווי דגי TetActivator הטרנסגניים

  1. דור של מבנה TetActivator
    1. רצפים רגולטוריים שיבוט של מעלה זרם עניין של קלטת TetActivator ב# וקטור 1,247 באמצעות טכניקות סטנדרטית. לחלופין, להשתמש בטכניקות רקומבינציה ליצור BAC, שבקלטת TetActivator (וקטור # 1180) מוכנס לתוך אקסון הראשון של גן המטרה, ושבו Tol2 הפוך חוזרים מוכנסים עמוד השדרה BAC (לפרוטוקול recombineering מפורט לראות 7,8).
    2. הכן את ה- DNA פלסמיד ללא רעלן או תכשירי BAC DNA באמצעות ערכות זמינות מסחרי.
  2. דור של קווי דג המהונדס TetActivator
    1. בצע microinjection של מבנה TetActivator על פי נהלים קבועים 9.
      1. הזרק 25-50 PG של פלסמיד דנ"א או עד 250 DNA BAC PG לעוברי אחד תאים בשלב יחד עם קידוד RNA התחושה כתרים לtra tol2nsposase לtransgenesis בתיווך transposon, או עם חלבון I-SCEI לtransgenesis בתיווך I-SCEI.
        ניתן למצוא שיקולים בבחירת שיטת transgenesis בסעיף הדיון: הערה.
        הערה: להזריק רצוי לתוך הציטופלסמה, לא החלמון, מאז יעילות של transgenesis עשויה להקטין כאשר ה- DNA לא נמסר לציטופלסמה.
    2. להעלות עוברי G0 הזריקו לבגרות. לחלופין, עובר G0 מסך לקרינת AmCyan ומעדיפים לגדול עוברים מראים את דפוס הביטוי הרצוי. זה עשוי להגביר את קצב השידור נבט-קו, בפרט לtransgenesis בתיווך Tol2.
    3. להעריך אינטגרציה נבט-קו מוצלחת על ידי outcrossing דגי G0 פרט לדגים פרא-סוג והמראה של הקרינה AmCyan בדפוס הביטוי הצפוי בעוברי F1 או זחלים באמצעות סטראו ניאון (דוגמא מוצגת באיור 1D).
    4. להעלות הקרינה חיוביתעוברי F1 לבגרות ולהזדווג עם דגים פרא-סוג להשיג דגים מהונדסים F2 יציבים.
    5. להעלות ולאפיין לפחות 3 sublines שונה הנגזר מדגי מייסד G0 שונים, מאז קווים בודדים עשויים להיות שונים ברמות ביטוי, דפוס ביטוי, יכולתו להשפיע על קווי TetResponder, דליפות, והרגישות שלהם להשתקה.
      הערה: transgenes רבים שבאים לידי ביטוי וחסונה בעוברים הם או באופן חלקי או לחלוטין הושתק בזחלים בשלב מאוחר או דגים בוגרים. לכן, אם קווים נועדו לשמש בדגים בוגרים, לאפיין כמה קווים עצמאיים לביטוי TetActivator ותפקודם במהלך בגרות.
      הערה: יש לנו נוצרה פנל של קווי TetActivator לביטוי רקמות ספציפיות של TetActivator בשני העוברים ומבוגרים דגים, ששמותיהם מופיעים בטבלה 1 קווים אלה זמינים מהמעבדה וייגינגר על פי בקשה..

2. דור של הטרנסגניים Tקווי דגי etResponder

הערה: יש לנו נוצרה מבנה TetResponder מאפשר לאני-SCEI או דור תיווך Tol2 של קווי TetResponder יציבים, אשר זמינה מהמעבדה וייגינגר על פי דרישה (מסד נתונים וייגינגר מעבדה פלסמיד לא 1,444; איור 1E.). מבנה זה מכיל מפעיל טטרציקלין, ואחריו אזור polylinker להקל על ההחדרה של רצפי קידוד (CDS) של גן של עניין ואת רצף קידוד YPet YFP נגזרים. לפיכך, המבנה מיועד לביטוי בתיווך Teta של היתוך C-מסוף של החלבון של עניין עם YPet. אם ביטוי של חלבון היתוך מתויג יש להימנע, יכול להיות הציג פפטיד p2a או T2a עם הגן של CDS העניין, המאפשר שיתוף ביטוי של החלבון של עניין וYPet כפוליפפטידים נפרדים 6,10.

  1. דור של מבנה TetResponder
    1. CDS שיבוט של הגן של עניין 3 'של מפעיל טטרציקליןו 5 'של CDS YPet על פי נהלים קבועים. ודא שקודון העצירה הוסר מהגן של CDS העניין.
    2. הכן הכנות פלסמיד דנ"א ללא רעלן באמצעות ערכות זמינות מסחרי.
  2. דור של קווי דג המהונדס TetResponder
    1. בצע microinjection של TetResponder לבנות על פי נהלים קבועים 9.
      1. הזרק 25-50 PG של פלסמיד דנ"א לתוך הציטופלסמה של עוברים אחד תאים בשלב יחד עם קידוד RNA תחושה כתרים לtransposase tol2 לtransgenesis בתיווך transposon או עם אנזים I-SCEI לtransgenesis בעזרת meganuclease.
        ניתן למצוא שיקולים בבחירת שיטת transgenesis בסעיף הדיון: הערה.
        הערה: להזריק רצוי לתוך הציטופלסמה, לא החלמון, מאז יעילות של transgenesis עשויה להקטין כאשר ה- DNA לא נמסר לציטופלסמה.
    2. להעלות עוברי G0 הזריקו לdulthood.
    3. להעריך שילוב מוצלח נבט-קו וinducibility של transgene ידי הזדווגות דגי G0 בודדים עם קו TetActivator הוקם בעבר ואחרי טיפול דוקסיציקלין של עוברי F1 או זחלי F1.
      הערה: בדרך כלל אנו משתמשים קו TetActivator מונע אמרגן היוביקוויטין (היוביקוויטין: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, היוביקוויטין הקצר: Teta AmCyan 3) למסך לספקי TetResponder פונקציונליים, כקו הזה מניע ביטוי למדי בכל מקום בעוברים ומבוגר דגים ובכך מתאים גם להעריך inducibility TetResponder בכל הרקמות של עניין. קו זה זמין מהמעבדה וייגינגר על פי דרישה.
    4. איסוף עובר כל מצמד בצלחת פטרי 10 סנטימטרים נפרדת המכילה בינוני עובר E3 (ראה טבלת חומרים) ודגירת מנות על 28.5 מעלות צלזיוס.
    5. דגי G0 המקום שנתנו לעוברי טנקים ממוספרים בודדים (תיבות רבייה; ראה טבלת חומרים) עד עוברים היו מסךאד. זה מאפשר התאוששות של דגי G0 שמראים שידור קו נבט של transgene.
    6. אם רק מחצית מהעוברים צפויות יישא את גן TetActivator (במקרה ספק TetActivator הטרוזיגוטיים נחצה לדגי מייסד TetResponder), בחר לעוברים המכילים את גן TetActivator על ידי מראה של הקרינה AmCyan בשלב התפתחותי המתאים.
    7. לגרום לפעילות תעתיק TetActivator ידי טיפול עובר עם דוקסיציקלין (DOX) כמפורט בסעיף 2.3.
    8. עוברי F1 המסך להופעתה של הקרינה YPet. מעדיף קווים (דגי G0) שמייצרים ביטוי YPet הומוגנית, כי הוא עובר במצמד צריך להציג הפסיפס קטן בתוך תחום הביטוי הצפוי ווריאציה קטנה בין עוברי אדם. ראה ראשי חץ באיור 1F ואיור 1G לדוגמאות מייצגות.
    9. דגי G0 Mate העברת transgene TetResponder מושרה זוהה בצעד 2.2.8 עם דגים פרא-סוג ולהעלות את כל עוברי F1 לבגרות.
    10. לזהות דג מהונדס F1 בוגר או על ידי genotyping PCR מבוסס (ראה סעיף או על ידי חציית דג F1 פרט לקו TetActivator אחרי טיפול DOX של עוברי F2 והופעתה של הקרינה YPet (ראה סעיף 2.5).
    11. להקים ולאפיין לפחות 3 sublines TetResponder שונה הנגזר מדגי מייסד G0 שונים, מאז inducibility עשויה להיות שונה בקווים בודדים. ברמות ביטוי השגה מסוימות ואם מגיב יכול להיות מופעל בכל סוגי התאים עשויים להשתנות. בנוסף, רגישות להשתקה תהיה שונה בין קווים. לבסוף, במקרים מסוימים זה יכול להיות עדיף על בחירת שורות שמתווכות רק רמות ביטוי מתונות של החלבון של עניין, בפרט אם ביטוי דולף מיוצר בשילוב עם קו TetActivator בהעדר דוקסיציקלין צפוי לגרום למומים או רעילות התפתחותית.
      הערה: ט 'קווים מגיב שחסונה מושרה בעוברים ניתן גם באופן חלקי או לחלוטין הושתקו בזחלים בשלב מאוחר או דגים בוגרים. לכן, אם קווים נועדו לשמש בדגים בוגרים, צריכים להיות מאופיינים כמה קווים עצמאיים לinducibility במבוגרים. אם האינדוקציה של הגן של עניין תואמת התפתחות נוספת, הוכח שימושי כדי ליצור עוברים מהונדסים כפולים (TetResponder x TetActivator), כדי לגרום לביטוי ממשלת ישראל בעוברים וכדי לבחור ולהעלות רק אנשים המציגים את הפסיפס חזק ולפחות ביותר אינדוקציה.
    12. כדי לשמור ולהפיץ קווי TetResponder הוקמו, דגים בוגרים גנוטיפ כאמור בסעיף 2.5).
  3. טיפול דוקסיציקלין של עוברים
    1. הכן מניות 2,000x דוקסיציקלין (DOX). לפתור DOX ב -50% EtOH כדי להשיג ריכוז של 50 מיליליטר / מ"ג (97 מ"מ). מניות DOX חנות מוגנות מפני אור ב -20 ° C.
    2. למזוג את רוב בינוני E3 מעוברים ולהחליף אותו בבינוני E3 עובר המכיל DOX בריכוז סופי של 25 מיקרוגרם / מיליליטר DOX (2.5 μl של 2,000x מניית DOX לכל 50 מיליליטר E3). Dechorionation לא נדרש.
    3. חזרו לעוברי 28.5 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימאלית של 6 שעות לפני בחינת ביטוי של הגן מתויג של ריבית על ידי מראה של הקרינה YPet.
    4. להעריך דליפות של TetActivator / TetResponder שילוב של טיפול בעוברים עם EtOH ממס בלבד.
      הערה: בהכלאה באתר (איש) או RT-PCR כדי לזהות את ה- mRNA TetResponder יכולה לשמש כאמצעי רגיש יותר של דליפות מקרינה של הגן מתויג של עניין. של דליפות המידה תהיה תלויה בשילוב קו TetActivator / TetResponder המסוים וזה יכול גם להשתנות בין רקמות ושלבי התפתחות.
  4. הרדמה של דג הזברה מבוגרת
    1. הכן צלחת 10 סנטימטרים קוטר פטרי או כוס קטנה מלאים במי מערכת דגים המכילים 1 מ"ג / מיליליטר Tricaine (אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222).
    2. העבר את הדגים למכל המכיל חומר הרדמה ולחכות עד שזה מגיע לרמה 4 של הרדמה כפי שצוין על ידי אובדן מוחלט של שיווי משקל (דגים שוכב על הצד שלה), אין תנועות ואין תגובה לנגיעת 11.
    3. להעביר בזהירות דגים באמצעות פינצטה או כפית על גבי זכוכית, מכסה של צלחת פטרי פלסטיק, או צלחת פטרי מצופה agarose ולבצע כריתה או הדמיה סנפיר (ראה סעיף 3.2).
    4. חזור דגים למכל המכיל כמויות גדולות של מים מערכת דגים טריים ולפקח על זה. אם תנועות זימים לא לחדש בתוך 3 דקות, לסייע על ידי פיצוץ מים על הזימים באמצעות pipet העברת פלסטיק.
  5. genotyping של דגי TetResponder PCR מבוסס
    1. לבצע כריתה חלקית של זנב סנפיר 12. הנח דגים לתוך טנקים ממוספרים בודדות, (תיבות רבייה; ראה טבלת חומרים). זה מאפשר להתאוששות של דג המהונדס הבא genotyping המוצלח.
    2. Traרקמות סנפיר nsfer לבארות בודדות של היטב 96 צלחת PCR מראש מלאה במים ללא DNase 20 μl לבידוד של הדנ"א הגנומי 13.
      1. להוסיף 120 μl 1 M NaOH לכל היטב דגירה דגימות עבור 20 דקות ב 95 מעלות צלזיוס באמצעות thermocycler.
      2. דגימות צ'יל עד 4 מעלות צלזיוס, להוסיף 14 μl של 1 M טריס- HCl (pH 8.0) זה טוב, ודגימות מערבולת בקצרה. צנטריפוגה דגימות במשך 5 דקות ב16,000 XG כדי גלולה פסולת תא. אחסן הדנ"א הגנומי על 4 מעלות צלזיוס עד צורך.
    3. פריימרים לעיצוב להגביר במיוחד קטע של transgene TetResponder. השתמש 2 μl של DNA המבודד בתגובת PCR סטנדרטית ולנתח מוצר ה- PCR על ג'ל agarose.

אינדוקציה 3. רקמות ספציפית של ביטוי transgene בזנב המבוגרים Regenerating דג הזברה Fin

  1. הקמת TetActivator; TetResponder דגים כפולים מהונדסים
    1. Mate ספקי TetActivator עם TetResponder carriERS.
    2. עוברים בחרו ביצוע transgene TetActivator בשלב ההתפתחותי שבו אלמנטי הרגולציה הנהיגה קלטת TetActivator פעילים. בקלות ניתן לזהות על ידי מראה של הקרינה AmCyan עובר מהונדס באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו.
      הערה: דגי transgene החיובי TetActivator יכולים לחלופין להיות מזוהים בבגרות על ידי הדמיה של דגים בהרדמה, למשל. הבא קטיעת סנפיר הזנב והופעתה של הקרינה AmCyan בלהתחדש.
    3. להעלות עוברים שנבחרו לבגרות.
    4. לזהות דגים כפולים מהונדסים בוגרים (דגים שנושאים TetResponder בנוסף לTetActivator) על ידי genotyping PCR מבוסס או (עדיף) על ידי היכולת שלהם להשפיע על ביטוי של TetResponder ברקמות של עניין. פרוטוקול לזירוז TetResponder וזיהוי בסנפיר זנב ההתחדשות מתואר בסעיף 2.3 וסעיף 4.
      הערה: אם ביטוי TetResponder החולף תואםעם התפתחות עוברית או זחל נוסף, כדאי לזהות עוברים מהונדסים כפולים ביצוע transgenes TetActivator וTetResponder לאחר טיפול DOX במהלך התפתחות עוברית כפי שתואר לעיל (סעיף 2.3, איור 1H). עוברים חיוביים זוגיים יציגו הקרינה AmCyan וYPet. להעלות עוברים חיוביים לבגרות.
  2. קטיעה של סנפירי זנב דג הזברה ואינדוקציה של ביטוי transgene בסנפיר ההתחדשות
    1. לבצע כריתה חלקית של סנפיר הזנב בדג בהרדמה (ראה סעיף 2.4) 12. טיפול בדגים או מייד עם DOX או להחזיר אותם למערכת דיור דגים.
    2. הכן תיבת רבייה (איור 2 א; ראה טבלת חומרים) מלא 1 ליטר של מים מערכת דגים המכילים 25 מיקרוגרם / מיליליטר DOX (להוסיף 500 μl של 2,000x 50 מ"ג / מיליליטר מניות ל1 ליטר של מים מערכת דגים).
      הערה: אינדוקציה של ביטוי transgene מייד לאחר קטיעה מאפשרת כלsessment של השפעות על אירועים מוקדמים במהלך התחדשות, ואילו יש להשתמש באינדוקצית 3 ימים שלאחר קטיעה (3 DPA) כדי להעריך ביטוי transgene או פונקציה במהלך צמיחת משובי.
    3. להעביר עד 10 דגים מהונדסים, כפולים נקטעו בעבר לתיבת הרבייה וקרובה קופסא עם מכסה כך שדגים לא יכולים לברוח (איור 2 א).
    4. מניחים תיבות רבייה אל תוך החשכה כדי להפחית את הלחץ. אנחנו בדרך כלל למקם את התיבות ל28.5 ° C חממה באוויר כדי להבטיח חושך וטמפרטורה קבועים.
    5. פנק את הדג מהונדס כפול שליטה שלילית עם EtOH (250 μl למי מערכת דגי 1 ליטר) בלבד.
      הערה: המהונדס יחיד או דגים פרא-סוג שטופלו בDOX יכולה לשמש כביקורת שלילית נוספת, למרות שאנחנו מעולם לא נצפו תופעות לוואי של מינוני DOX משמשים כאן על התחדשות סנפיר.
    6. הרדימי דגים כאמור בסעיף 2.4 ודגי העברה באמצעות פינצטה או כפית על פטרי מצופה agarose רטוב צלחת. זהירות להפיץ סנפיר הזנב באמצעות פינצטה.
    7. דגי מסך למראה של YPet בתוך להתחדש באמצעות סטריאו מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2).
      הערה: בדרך כלל, הקרינה מונע TetResponder ניתן לצפות חסונה הבאה 6 שעות של טיפול DOX. עם זאת, אנו ממליצים לאפיין את הדינמיקה של ביטוי TetResponder עבור כל קו שנוצר.
    8. חזור דגים למערכת דיור הדגים לסיים אינדוקציה transgene TetResponder או להמשיך טיפולים.
      הערה: לטיפולים> 24 שעות (טיפולים לטווח ארוך) הוא חיוני כדי להחליף מים ולנקות ביסודיות את תיבות הקינון יומי.
    9. במהלך טיפולים לטווח ארוך, דגים להאכיל כל 2-3 ימים על ידי העברת דגים למכל נקי עם מים מערכת דגים טריים לפני החזרתם לתיבות קינון לאחר ההאכלה.

4. אפיון ביטוי TetResponder במחדש סנפיר

לא "> הערה:. אנחנו בדרך כלל לאמת ביטוי רקמות ספציפיות גנים בסנפיר זנב ההתחדשות באמצעות הדמיה ניאון של cryosections ב 3 DPA בנקודה זו בזמן תאי הרקמה השונים של להתחדש יצרו וניתן לזהות ברקמת סעיפים ברור, וcryosectioning הוא פשוט יותר מאשר בשלבים מאוחר יותר של התחדשות. איור 2C מתאר את תחומי רקמות שניתן להבחין בלהתחדש ומפרט כמה סמנים מולקולריים לתחומים אלה. הפרוטוקול הבא מתאר את ההכנה של cryosections אורך או הרוחבי להדמיה או immunostaining ישירים .

  1. Cryosectioning של סנפירי זנב בוגרים
    1. טיפול בדגי זנב שנקטעו מסנפירי 2 DPA עד 3 DPA עם DOX כאמור בסעיף 3.2
    2. הרדימי דגים כאמור בסעיף 2.4
    3. השתמש בכפית או פינצטה להעביר בעדינות דגים על מכסה של צלחת פטרי פלסטיק.
    4. -לקטוע מחדש להתחדש הסנפיר בכ 4-5 קטע גרמיהפרוקסימלי של למטוס הקטיעה הראשוני באמצעות אזמל ולהחזיר את הדג למים מערכת דגים טריים.
    5. בזהירות העברה מחדש לצלחת פטרי קטנה (למשל, 35 מ"מ) המכילה 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA) שבנאגר המלוח פוספט 1x (PBS; ראה טבלת חומרים) באמצעות פינצטה בסדר. אל תיגע בלהתחדש אבל רק חלק הגדם של הרקמה.
    6. הנח רקמה שטוחה על גבי תחתית צלחת פטרי ולתקן O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
    7. לשטוף מחדש פעמיים ב1x PBS המכיל 0.1% Tween (PBT) כדי להסיר PFA דגירה מחדש o / n על 4 מעלות צלזיוס ב 0.5 M EDTA-PBS (pH 7.5) לdecalcify מטריצת עצם.
    8. דגירה מחדש ב RT ב 10% סוכרוז-PBS, 20% סוכרוז-PBS, 30% סוכרוז-PBS ו -30% סוכרוז-PBS: בינוני הקפאת רקמה ביחס של 1: 1 (TFM; ראה טבלת חומרים) במשך 30 דקות כל אחד. בהמשך לכך, דגירה סנפירים בC ° 4 ל> שעה 2 במדיום הקפאת רקמה.
    9. הנח cryomolds לשקופית מיקרוסקופ ולמלא אתמ 'עם מדיום הקפאת רקמה. הימנע החדרת בועות אוויר.
    10. העברה מחדש לcryomolds ורקמת אוריינט כראוי להשיג סעיפים אורך או רוחביים של מחדש סנפיר (איור 2 ד). ודא להתחדש כי הוא ישר, המאפשר חתך.
    11. העברת cryomolds יחד עם שקופיות מיקרוסקופ על מדף מתכת ממוקם על מצע של קרח יבש כדי להתחיל את תהליך ההקפאה (איור 2 ד).
    12. ברגע שמדיום הקפאת הרקמה הפך מוצק, מקום cryomold על ספסל ולתת לשבת על RT במשך כמה דקות כך שרקמת הקפאה בינונית מפשירה בממשק הפלסטיק-בינוני.
    13. השתמש בעט או דומה לדחוף את הגוש הקפוא מתוך cryomold. cryoblocks חנות בקופסא ב -80 ° C עד חתך רקמות.
    14. הכן 10-14 מיקרומטר cryosections העבה באמצעות קריו microtome ולאסוף חלקים בשקופיות מיקרוסקופ הידבקות (ראה טבלת חומרים). שקופיות חנות ב -20 ° C עד needed.
  2. אפיון של ביטוי TetResponder על חלקי סנפיר המבוסס על הקרינה YPet
    1. פנק את חלקי סנפיר למשך 30 דקות עם MeOH 100% מקוררים ל -20 מעלות צלזיוס כדי לשפר את ההיענות לשקופית מיקרוסקופ ואחריו שני שוטף ב RT בPBT ולשטוף 1 ב PBS, 5 דקות כל אחד.
    2. דמיינו גרעינים על ידי סעיפים דוגרים במשך 10 דקות ב 4 ', 6 diamidino-2-phenylinodole (DAPI) ב PBS (1: 5,000) ואחריו שני שוטף 10 דקות כל אחד ב- PBS.
    3. חלקי ההר ב 75% גליצרול-PBS או mounts antifade זמין מסחרי, ולכסות עם מכסה שקופיות.
    4. תמונת YPet וקרינת AmCyan תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal או רחב בתחום (איור 1E).
      הערה: כדי להקל על זיהוי חד משמעי של סוגי תאים המבטאים YPet, immunofluorescence או אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים כנגד אנטיגנים ספציפיים תאים מהסוג יחד עם נוגדנים אנטי-GFP (שמגיב עם YPet, אבל לא AmCyan) יכול להתבצע. לחלופין, כדי להקל על זיהוי של ביטוי YPet החלש, RNA הכלאה באתר נגד YPet RNA יכול להתבצע גם על כל הר סנפירים או חלקי פרפין של סנפירים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

להקים מערכת טיטון פונקציונלית לביטוי רקמות ספציפי גנים מושרה, TetActivator המהונדס וקווי TetResponder צריכה להיות שנוצר (איור 1 א). המטרה זו מושגת על ידי microinjecting TetActivator (איור 1 ב - C) או TetResponder (איור 1E) בונה לעוברי דג הזברה מוקדמים ואינטגרציה נבט-שורה שלאחר מכן. יכולים גם להיות שנוצרו מבני TetActivator פונקציונליים על ידי שיבוט של רצפים קצרים רגולציה (אלמנטים משפר) במעלה הזרם של קלטת TetActivat...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש דג הזברה המבוגר יכולת מדהימה להתחדש בהצלחה רב איברים ואיברים פנימיים. הבנה מעמיקה של המנגנונים המולקולריים ותאיים המעורבים דורשת ניתוח רקמות הספציפיות של פונקציות גן ומסלולי איתות. לקראת זה, מערכת טיטון מספקת כלי יעיל לביטוי גנים מבוקר spatiotemporally בדג זברה עוברית ובוגרת. בונה מערכת טיטון והמתודולוגיה שתוארה בכתב היד הזה כבר השתמשו בהצלחה במחקר שנערך לאחרונה במעבדה שלנו 3. הנושאים נוספים הבאים יש לשקול בעת הקמת מערכת טיטון:

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים כריסטה האזה, דוריס וובר ובריג'יט Korte לקבלת סיוע טכני. עבודה במעבדה וייגינגר נתמכת על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, אנחנו 4223 / 4-1 ועל ידי Gesellschaft für דויטשה Kardiologie באמצעות אוסקר-לאפ-Stipendium וקלאוס-גיאורג אונד Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קופסאות גידולAqua SchwarzAquaBox 1
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מורכבלמשל, Leica, Zeissמשתנה עם היצרןכדי לצלם קטעי רקמה פלואורסצנטית
מיקרוסקופ קונפוקלילמשל, Leica, Zeissמשתנה עם היצרןכדי לצלם קטעי רקמה פלואורסצנטית
Cryostatלמשל, Leica, Thermo-Scientificמשתנה עם יצרןלהקפאה
4', 6- דיאמידינו-2-פנילינודול (Dapi)Sigma-AldrichD9542השתמש ב-1/5,000 ב-PBS
להדמיה של גרעינים
דוקסיציקליןסיגמא-אולדריץ'D9891הכינו מלאי ב-50% EtOH ב-50 מ"ג/מ"ל (97 מ"מ)
עבור אינדוקציה של TetResponder
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-AldrichP61484% (w/v) paraformaldehyde ב-PBS, pH 7.5
לקיבוע
1x תמיסת מלח פוספט-חוצץ (PBS)1.7 מ"מ KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5
1x מי מלח פוספט-בופר + טווין 20 (PBT)1x PBS עם 0.1% Tween 20
Superfrost Ultra Plus שקופיות מיקרוסקופ הידבקותThermo Scientific 1014356190לאיסוף קטעי רקמות
מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאולמשל, Leica, Zeissמשתנה עם היצרןעבור גנוטיפ מבוסס פלואורסצנטי
Thermocyclerלמשל, Biorad, Applied Biosystemsמשתנה עם היצרןעבור גנוטיפ מבוסס PCR
מדיום הקפאת רקמות (TFM)Triangel Biomedical SciencesTFM-Cלהטמעת רקמות דגימות
טריקאין (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)Sigma-AldrichE10521לשימוש בהרדמה
ב-1 מ"ג/מ"ל במדיום עוברי E3

מקורות

  1. Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
  2. Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317(2014).
  3. Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
  4. Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
  5. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  6. Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
  7. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
  8. Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
  9. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
  10. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556(2011).
  11. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
  12. Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
  13. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610(2007).
  14. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  15. Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
  16. Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Wnt Beta Catenin

מאמרים קשורים