מאמר שיטה

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

12.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52771

⸱

29 באפריל 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, 2Biointerfaces Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים הדמיה של בעלי חיים שלמים וטכניקות מבוססות ציטומטריית זרימה לניטור התרחבות של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן בתגובה לחיסון עם ננו-חלקיקים במודל חיסון עכברי.

תקציר

אדג'ובנטים חיסונים מסורתיים, כגון אלום, מעוררים תגובות לא אופטימליות של תאי CD8+ T. כדי להתמודד עם אתגר גדול זה בפיתוח חיסונים, מערכות ננו-חלקיקים שונות הונדסו כדי לחקות תכונות של פתוגנים כדי לשפר את העברת האנטיגן לבלוטות הלימפה המנקזות ולהגביר את ספיגת האנטיגן על ידי תאים מציגי אנטיגן, מה שמוביל לפורמולציות חיסון חדשות המותאמות לאינדוקציה של תגובות תאי CD8+ T ספציפיות לאנטיגן. במאמר זה, אנו מתארים את הסינתזה של מערכת ננו-חלקיקים "מחקה פתוגנים", הנקראת שלפוחיות רב-שכבתיות צולבות (ICMVs) שיכולה לשמש כנשא חיסון יעיל לאספקה משותפת של אנטיגנים תת-יחידות וחומרים חיסוניים ומעורר תגובות לימפוציטים ציטוטוקסיים CD8+ T (CTL) חזקות. אנו מתארים שיטות לאפיון גודל הידרודינמי ומטען פני השטח של ננו-חלקיקי חיסון עם פיזור אור דינמי ומנתח פוטנציאל זטה ומציגים הליך מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית לניתוח העברת אנטיגן בתיווך ננו-חלקיקים לבלוטות לימפה מנקזות. יתר על כן, אנו מראים טכניקת הדמיה חדשה של בעלי חיים שלמים המשתמשת בהעברה מאמצת של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן המבטאים לוציפראז לעכברים מקבלים, ואחריהם חיסון ננו-חלקיקים, המאפשר חקירה לא פולשנית של דפוסי התפשטות וסחר של CTLs בזמן אמת. אנו מתארים גם צביעת טטרמר וניתוח ציטומטרי זרימה של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי לכימות אורך של תגובות תאי T אנדוגניות בעכברים שחוסנו בננו-חלקיקים.

מבוא

פיתוח חיסון מסורתי בעיקר העסיק את הגישה האמפירית של ניסוי וטעייה. עם זאת, עם ההתפתחות האחרונה של מגוון רחב של ביו-חומרים וגילוי של גורמים מולקולריים של הפעלה חיסונית, ניתן כיום לעצב באופן רציונלי ניסוחים חיסון עם רמזי biophysical וביוכימיים הנגזרים מגורמי המחלה 1,2. בפרט, פלטפורמות משלוח הסמים חלקיקים שונות נבדקו כנישאי חיסון כפי שהם יכולים להיות שותף מלא באנטיגנים מקטע וסוכני immunostimulatory, להגן על רכיבי חיסון משפלה, ולשפר את שיתוף מסירתם לאנטיגן תאי מציגים (נגמ"שים) המתגוררים בהלימפה בלוטות (LNs), ובכך למקסם את הגירוי וההפעלה 3-5 חיסוניים. בדו"ח זה, אנו מתארים את הסינתזה של מערכת "מחקה לפתוגן" ננו-חלקיקים, המכונה שלפוחית ​​interbilayer-crosslinked multilamellar (ICMVs), שכבר הוכיח בעבר כplatfor חיסון חזקמ 'לדיבוב של הלימפוציטים חזקים T ציטוטוקסי (CTL) ותגובות חיסוניות הלחות בשני תאי רקמה מערכתיים ורירית 6-9. בפרט, חיסון עם ICMVs הושג משופר באופן משמעותי את רמות נוגדנים בסרום נגד אנטיגן מלריה, בהשוואה לחיסון עם adjuvants הקונבנציונלי (לדוגמא, אלום וMontanide) 7 וגם עורר תגובות CTL חזקות נגד תאים סרטניים ודגמי אתגר נגיפיים בעכברים 9. כאן, באמצעות ICMVs כמערכת חיסון ננו-חלקיקי מודל, אנו מתארים שיטות לאפיון של ננו-ניסוחים חיסון, כולל גודל חלקיקים ומדידות פוטנציאל זטה ומעקב של סחר בחלקיקים לLNs ניקוז (dLNs) ניצול ההדמיה confocal של רקמות cryosectioned 7. בנוסף, אנו מציגים שיטה של ניתוח הרחבת תגובות CTL בעכברים לאחר העברת מאמצת של תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי להביע לוציפראז 9,10 מבוססת הדמיה כל-חיה. לבסוף, אנו דהצביעת tetramer סופר של תאים ההיקפיים mononuclear הדם (PBMCs) לכימות אורך של תגובות תא T אנדוגני בעכברים שחוסנו בחלקיקים 6,9.

ICMVs הוא ניסוח ננו-חלקיקים המבוססים על שומנים מסונתזים על ידי היתוך מבוקר של יפוזומים פשוטים למבני multilamellar, אשר לאחר מכן התייצבו כימי על ידי קבוצות ראש פוספוליפידים cross-linking פונקציונליות maleimide בתוך שכבות שומנים עם dithiol crosslinkers 6. ברגע שICMVs מסונתזים, חלק קטן של חלקיקים יכול לשמש כדי לקבוע את גודל חלקיקים ופוטנציאל זטה (כלומר, תשלום פני השטח של חלקיקים) עם פיזור אור דינמי מערכת (DLS) ומנתח פוטנציאל זטה. DLS אמצעי שינויים בפיזור אור בהשעיות חלקיקים, המאפשרים קביעת מקדם הדיפוזיה והגודל הידרודינמית של חלקיקים 11. השגת גודל חלקיקים עקבי מיצווה לסינתזה אצווה היא קריטיתמאז גודל חלקיקים הוא אחד הגורמים העיקריים המשפיעים על הניקוז לימפטי של חלקיקי חיסון לdLNs וספיגה סלולרית לאחר מכן על ידי נגמ"שים 12,13. בנוסף, ניתן להשיג פוטנציאל זטה על ידי מדידת המהירות של החלקיקים כאשר זרם חשמלי מוחל, המאפשרת קביעת ניידות electrophoretic של חלקיקים וחלקיקי משטח תשלום 11. הבטחת ערכי פוטנציאל זטה עקבית של חלקיקים היא חשובה שכן תשלום של חלקיקי משטח קובע יציבות colloidal, שבה יש השפעה ישירה על פיזור חלקיקים במהלך אחסון ולאחר in vivo ממשל 14,15. על מנת לעקוב אחר חלקיק הלוקליזציה לdLNs, יכול להיות מתויג ICMVs עם fluorophores הרצויה כולל צבעי lipophilic ואנטיגנים קוולנטית מתוייגים. בעקבות חיסון, יכולים להיות מורדמים עכברים בנקודות זמן שונים, dLNs כריתה, cryosectioned, וניתחו עם מיקרוסקופיה confocal. טכניקה זו מאפשרת הדמיה של דראי הלימפהנינג של שני נשאי חיסון ננו-חלקיקים ואנטיגן לdLNs. בנוסף יכולים להיות מוכתמים סעיפי הרקמות עם נוגדנים שכותרתו fluorescently ומנוצל כדי לקבל מידע נוסף, כגון סוגים של תאים הקשורים לאנטיגן והיווצרות מרכזים נבטי כפי שהראינו בעבר 7.

ברגע שסינתזת החלקיקים היא מותאמת והסחר לdLNs הוא אישר, חשוב לאמת דיבוב של in vivo הרחבת CTL. על מנת לנתח את הדיבוב של תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי בתגובה לחיסון ננו-חלקיקים, שנוצלנו אנטיגן מודל, ovalbumin (OVA), עם OVA 257-264 פפטיד (SIINFEKL) epitope תא CD8 + T immunodominant, המאפשר ניתוח מפורט חיסוני של תגובות תא T אנטיגן הספציפי ל16,17 פיתוח חיסון ראשוני. בפרט, לחקור את הדינמיקה של התרחבות ונדידה של תאי CD8 + T אנטיגן ספציפי, יש לנו שנוצרומודל עכבר כפול מהונדס על ידי חציית הגחלילית בלוציפראז להביע עכברים הטרנסגניים (לוק) עם עכברים הטרנסגניים OT-לי שיש תאי CD8 + T עם T-cell קולט (TCR) ספציפי לSIINFEKL (בשיתוף עם H-2K ב). מעכברי OT-I / לוק אלה, להביע לוציפראז, יכולים להיות מבודדים תאי OT-אני CD8 + T ומוכנה להעברת מאמצת לעכברי C57BL / 6 נאיביים. ברגע שהזרע, חיסון מוצלח עם חלקיקים המכיל OVA יגרום הרחבת תאי T הועברו, אשר יכול להיות במעקב על ידי ניטור אות פליטת אור עם 9,10 מערכת הדמיה חיה שלמה. טכניקת הדמיה זה לא פולשנית כל הגוף כבר בשימוש עם אנטיגנים נגיפיים או גידול אחרים ב18-20 העבר, חושפת תהליכים מעורבים בהרחבת T תא ברקמות הלימפה והפצה לרקמות היקפית באופן אורך.

משלים לניתוח adoptively תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי הועברו, endogenoתגובות תא T לפרסם חיסון ניתן לבדוק עם מורכב פפטיד-גדול histocompatibility (MHC) assay tetramer 21, שבו מורכב tetramer פפטיד-MHC, מורכב מארבע כיתת MHC-מתויג fluorophore אני מולקולות עמוסות epitopes פפטיד, מועסק כדי לאגד TCR ותווית תאי CD8 + T באופן אנטיגן ספציפי. Assay tetramer פפטיד-MHC יכול להתבצע גם במחקרי נתיחה לאחר מות מסוף לזהות תאי CD8 + T אנטיגן הספציפי בהלימפה ורקמות היקפית או במחקרים ארוכי טווח עם תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) המתקבלים מהדם סידורי מושך. לאחר מכתים ימפוציטים עם tetramer פפטיד-MHC, cytometry זרימת הניתוח מבוצע ניתוחים מפורטים על הפנוטיפ של תאי-ההרג או כימות של התדר שלהם בין תאי CD8 + T.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים שתוארו בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת האוניברסיטה על שימוש וטיפול של בעלי חיים (UCUCA) באוניברסיטת מישיגן ומבוצעים על פי המדיניות והנחיות שנקבעה.

1. סינתזה ואפיון של ICMVs Co-עמוס חלבון Antigen וAdjuvant מולקולות

  1. לערבב 1: 1 יחס טוחנת של 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine (dOPC) ו1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4 (-maleimidophenyl p) butyramide] (MPB) בכלורופורם, שמירה על סך סכום שומנים ב1.26 μmol ליצווה (כלומר, 500 מיקרוגרם של dOPC ו 630 מיקרוגרם של MPB) בבקבוקון 20 מיליליטר זכוכית (קוטר = 28 מ"מ וגובה = 61 מ"מ).
  2. להוסיף תרופות lipophilic, כגון השומנים monophosphoryl (MPLA) או צבעי lipophilic (למשל, האם), לפתרון השומנים בריכוז רצוי. ביסודיות להסיר את הממס האורגני על ידי טיהור עם nitroge יבש נוסףn גז והצבת הדגימות תחת ואקום O / N.
  3. מימה סרט השומנים על ידי הוספת 200 μl 10 פרופאן מ"מ BIS-טריס (BTP, pH 7.0) המכיל תרופות מסיסים במים (לדוגמא, אנטיגנים חלבון). וורטקס במשך 10 שניות כל 10 דקות במשך שעה 1 ב RT.
  4. העבר את התוכן מזכוכית בקבוקון לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, דגימות מקום באמבט קרח-מים, וsonicate ברציפות במשך 5 דקות באמצעות עצמת 40% הגדרה בsonicator בדיקה-קצה / 20 kHz 125 W.
  5. הוסף 4 μl של 150 מ"מ dithiothreitol (DTT) לכל מנה (עובד ריכוז 2.4 מ"מ), מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה באמצעות microcentrifuge שולחן.
  6. הוסף 40 μl של 200 מ"מ CaCl 2 ולערבב עם פיפטה (עובד ריכוז 33 מ"מ). דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר crosslinking של MPB המכיל שכבות שומנים עם DTT.
  7. צנטריפוגה דגימות 20,000 XG במשך 15 דקות, להסיר את supernatant, וגלול ב200 μl של ddiH 2 O.
  8. חזור על שלב 1.7 ו צנטריפוגות שוב לאחר שטיפת O השנייה ddiH 2 כדי להסיר CaCl 2, DTT unreacted, וחומרי מטען unencapsulated מsupernatant.
  9. הכן 10 מ"ג / מיליליטר של 2 kDa פוליאתילן גליקול-תיאול (PEG-SH) בddiH 2 O. Resuspend כל דגימת ICMV בפתרון של PEG-SH 100 μl ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  10. לבצע שני 2 O שוטף ddiH (שלב 1.7) וresuspend גלולה הסופי ICMV בPBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, לערבב את ההשעיה ICMV, כמו חלקיקים עשויים ליישב לתחתית לאחר אחסון ממושך.
  11. לאפיון של חלקיקים, להסיר aliquot קטן (~ 10%) של ICMVs מכל אצווה ולדלל באופן אינדיבידואלי בנפח כולל של 1 מיליליטר של ddiH 2 O. הנח מדגם יחיד בגודל Zetasizer חלקיקי תא ומידה, מדד polydispersity, ופוטנציאל זטה של ​​הדגימות באמצעות מערכת zeta פוטנציאל מדידה (על פי הפרוטוקול של היצרן) DLS ו.

2. בחינת לימפה צומת הניקוז של הקרינה מתויגות ICMVs עם מיקרוסקופיה confocal

  1. הכנת ICMVs עמוסה אנטיגן fluorophore מתויג וצבע ניאון lipophilic
    1. הכן חלבון מתויג fluorophore, כגון ovalbumin הגיב באסתר 555-succinimidyl אלקסה פלואוריד, על פי הוראות היצרן.
    2. כדי להכין ICMVs מתויג עם fluorophore במעטפת השומנית, להוסיף צבע lipophilic ניאון, (למשל, 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (לא)) שלב במהלך הכנת סרט השומנים ( 1.2) בשעה 0.05% כמות שומנים טוחנות. ללחות שומנים סרט (שלב 1.3), המכיל מאגר השימוש אנטיגן fluorophore מתויג, וסינתזת ICMV מלאה כפי שמתואר בשלבים 1.4-1.11.
  2. ממשל תת עורית של חלקיקים בבסיס זנב
    1. להרדים עכבר באמצעות זרימה מאדה מבוקרת מצוידים בתא אינדוקציה utilizing 3% isoflurane ו -1.5 ליטר / דקת זרימת חמצן על פי IACUC אישר פרוטוקול בעלי חיים. ברגע שהעכבר הוא מחוסר הכרה, בצע את השלבים הבאים במהירות לפני ההרדמה מתפוגג כדי לאפשר גישה אופטימלית לאתר של ההזרקה ולמזער אי נוחות לבעלי החיים. לחלופין, להשתמש בחרטום הולם נכון כדי לשמור על הרדמה. אם עכברים מורדמים למשך זמן ארוך יותר מ -5 דקות, להחיל סיכה העין דרושה כדי למזער גירוי לאחר ההליך.
    2. לרסס את בסיס הזנב עם אתנול 70% כדי לטהר ולהרטיב את חלק הפרווה השיער הרטוב לחשוף תיקון קטן של עור גלוי, אשר יכול לשמש כדי לחזות את המחט מתחת לעור.
    3. הכינו השעיה הזרקת חלקיקים המכילה כמות רצויה של אנטיגן ומשלים לשל מינון חיסון 100 μl בPBS (למשל, 10 מיקרוגרם OVA ו0.3 מיקרוגרם לMPLA של מינון הזרקה 100 μl נעשו שימוש ב6,9 העבר).
    4. צייר את int ההשעיה חלקיקיםמזרק OA עם מחט G 27-29 ולהכניס את המחט בבסיס הזנב (~ 5 מ"מ מקו השיער) עם השיפוע כלפי מעלה ולהזריק 50 μl של ההשעיה חלקיק 22.
    5. המתן מספר שניות ללחץ להשוות כדי למנוע חזרה זרימה מוגזמת ולמשוך את המחט. חזור על ההזרקה בצד השני של בסיס הזנב האחר למקד שני LNs מפשעתי הניקוז.
  3. הכנת cryosections בלוטה לימפה ובדיקה עם מיקרוסקופ confocal.
    1. להרדים את העכבר עם CO 2 מחנק, ואחריו pneumothorax המושרה על פי IACUC אישר פרוטוקול בעלי חיים. לחלץ LNs מפשעתי על פי פרוטוקול הפגין בבדויה 23 ולשטוף את הדם על ידי הצבת הרקמות ב 1 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס PBS.
    2. ספוג PBS מהרקמות עם רקמות ולמקם את הרקמה בcryomolds רקמה (10 x 10 x 5 מ"מ 3) מראש מלא לראש עם אוקטובר הקפאת 24 בינוניים. Snap להקפיא את TISלתבוע בלוק בחנקן נוזלי למשך 30 שניות. לחלופין, למקם את בלוק רקמה על קרח יבש למשך 30 דקות. אחסן רקמה קפוא במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
    3. לחתוך קטעי רקמה 5-10 מיקרומטר עבים בcryostat להגדיר ב -20 ° C. 24.
    4. במידת צורך, לבצע תיוג immunofluorescence, ולבחון את הרקמה עם מיקרוסקופיה confocal כפי שהודגמה בעבר 24.

3. הרחבת ניטור של אנטיגן ספציפי, לוציפראז להביע תאי CD8 + T לאחר Nanoparticle חיסון עם כל חיה הדמיה

  1. בידוד של OVA -specific 257-264, תאי CD8 + T-לבטא לוציפראז מעכברים מהונדסים OT-I / לוק
    1. להרדים עכבר מהונדס OT-I / לוק עם CO 2 מחנק ולגרום pneumothorax לפי IACUC אישר פרוטוקול בעלי חיים. לקצור את הטחול באופן סטרילי על ידי הגישה חלל הצפק ובזהירות ניתוק הרקמה מהלבלב 23, ומקום 5 מיליליטר של 4 מעלות צלזיוס PBS + 2% FBS להעברה למכסת מנוע בתרבית רקמה.
    2. מניחים את הטחול במסננת ניילון 70 מיקרומטר על שפופרת 50 מיליליטר חרוטי צנטריפוגות (עד 3 טחולים בכל פעם). באמצעות בוכנה של מזרק 3 מיליליטר, לטחון את התאים דרך המסננת.
    3. שטוף את הבוכנה ואת המסננת עם PBS + 2% FBS וזורקים. תביא את הנפח הכולל עד 10 מיליליטר / טחול בשפופרת 50 מיליליטר, לקחת דגימה קטנה של ההשעיה התא לספור עם hemocytometer, וצנטריפוגות במשך 10 דקות ב 300 x גרם.
    4. באמצעות ערכת בחירה זמינה מסחרי מגנטית שלילית, לבודד את אוכלוסיית תאי CD8 + T על ידי ביצוע הוראות היצרן.
    5. לאחר שטיפת תאים עם PBS, לספור את מספר תאי CD8 + T מבודדים. כדי להעריך טוהר של תאי CD8 + T המבודדים, דגירה ~ 20,000-30,000 תאים ב -20 μl של CD16 עכבר / 32 נוגדן (0.025 מ"ג / מיליליטר) במשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף 20 μl של נוגדן αCD8-APC (0.005 מ"ג / מיליליטר) דגירה במשך 30 דקות. פrform כל incubations על 4 מעלות צלזיוס בPBS + 1% w / v BSA. ביצוע ניתוח cytometric זרימה 25.
  2. העברת מאמצת של תאי CD8 + T מבודדים ויזואליזציה של פוסט הרחבת החיסון שלהם
    1. לבצע העברת מאמצת של תאים המבודד OT-I / לוק CD8 + T לC57BL / 6 עכברים נאיביים על ידי מתן 1-10 × 10 5 תאים בנפח 200 μl של PBS באמצעות הזרקה לוריד זנב וריד 22 (יום -1). בהתחשב בכך שתיקוני הפרווה ועור שחור בעכברי C57BL / 6 עלול להפריע לאות bioluminescent, לבקן המגולח עכברי C57BL / 6 הם אידיאליים עבור מחקרים אלה.
    2. לאחר יום אחד (יום 0), לנהל את החיסון כפי שתואר לעיל (סעיף 2.2).
    3. נהל 150 מ"ג של luciferin למשקל גוף עכבר קילוגרם intraperitoneally ב300 μl נפח של PBS. לאחר 10 דקות, להרדים את העכברים עם isoflurane (כמו בשלב 2.2.1) ולדמיין תאי OT-I / לוק CD8 + T על ידי רכישת אות פליטת אור למשך 5-10 דקות wה- i מערכת הדמיה חיה שלמה (IVIS; מתייחס לווילסון 26 להדרכה מפורטת). חזור על פי צורך למחקרים ארוכי טווח.

תאי CD8 + T 4. פפטיד-MHC tetramer הכתמה של PBMCs לניתוח של אנטיגן ספציפי

הערה: הליך הפרוטוקול הבא יכול להתבצע באמצעות או / 6 עכברים C57BL הועברו adoptively עם תאי OT-I / לוק CD8 + T או C57BL עכברים / 6 ללא העברת המאמצת.

  1. בנקודת זמן רצויה לאחר חיסון, לאסוף כ -100 μl דם (4-6 טיפות) מעכברים באמצעות טכניקת דימום submandibular 27 לתוך צינור מצופה K 2 EDTA ולהפוך כמה פעמים כדי למנוע קרישה.
  2. העבר את דם 100 μl לצינור microcentrifuge, להוסיף 1 מיליליטר של חיץ תמוגה, ודגירה של 2 עד 3 דקות כדי להסיר תאי דם אדומים (RBCs). צנטריפוגה דגימות במשך 5 דקות ב 1500 XG ולהסיר את supernatant. אם גלולה עדייןppears האדום (המצביע על ההסרה חלקית של תאי דם אדום), לחזור על שלב תמוגה עם דגירה קצרה (<1 דקות) של מאגר תמוגה.
  3. שטוף את PBMCs נותר עם 1 מיליליטר של חיץ FACS (PBS + 1% w / v BSA) וצנטריפוגות ב 1500 XG במשך 5 דקות.
  4. לשאוב supernatant ו resuspend המדגם ב -20 μl של CD16 / 32 נוגדן עכבר (0.025 מ"ג / מיליליטר) כדי לחסום נוגדן ספציפי ותיווך FCR מחייב. דגירה של 10 דקות ב RT.
  5. העבר את התאים מצינורות microcentrifuge ל 4 מיליליטר צינורות FACS סיבוב תחתון. הוסף 20 μl של H-2K ב פתרון OVA tetramer-SIINFEKL-PE לפי המפרט של היצרן לכל דגימה ודגירה במשך 30 דקות על קרח.
  6. הכן את הקוקטייל של הנוגדנים (למשל, נוגדני αCD8-APC, αCD44-FITC, וαCD62L-PECy7 (0.005, 0.005, 0.002 ומ"ג / מיליליטר ריכוז, בהתאמה)). הוסף 20 μl לכל דגימת ניסוי, ודגירה של 20 דקות על קרח. הכן בקרות fluorophore יחידים על ידי להbeling תאים עם כל tetramer מתויג fluorophore או נוגדן בריכוז שצוין לעיל.
  7. לשטוף 2 פעמים עם חיץ FACS וresuspend גלולה הסופי במאגר FACS המכיל 2 מיקרוגרם / מיליליטר של DAPI. התאים מוכנים כעת לcytometry זרימה (ניתן למצוא את פרטים ודוגמאות בScheffold 25) ניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הצעדים מעורבים בסינתזה של ICMVs הם באיור 1 6. בקצרה, סרט שומנים המכילים כל תרופות lipophilic או צבעי ניאון הוא התייבשות בנוכחות תרופות הידרופילי. קטיונים דו ערכיים, כגון Ca 2 +, מתווספים לנהוג היתוך של יפוזומים אניוני לתוך שלפוחית ​​multilamellar. Dithiol crosslinker, כגון DTT, הוא הוסיף שומנים פונקציונליות maleimide "מצרך" על apposing שכבות שומנים בדם, ולבסוף נותרו קבוצות maleimide חיצוניות הרווה בתגובה עם moieties-PEG thiolated. ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול האמור במאמר זה מתאר את הסינתזה ואפיון של מערכת ננו-חלקיקים המבוססים על שומנים חדשה, המכונה ICMVs, ומספק את התהליך של אימות אפקטיבי של ניסוחים חיסון המבוסס על ננו-חלקיקים לגרום לתגובות תא אנטיגן הספציפי CD8 + T. סינתזת ICMV תושלם בכל המצב המימי, וזה יתרון גדול לעומת מערכות אחרות נפוצות פולימרי ננו-חלקיקים (למשל, פולי (lactide-שיתוף glycolide) חלקיקי חומצה), אשר בדרך כלל דורשים ממסים אורגניים להכנה, לעתים קרובות גורמות לאובדן של antigenicity בחלבון אנטיגנים 2...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

פרקין אלמר סיפק את עלות הייצור שנגרם במהלך הפרסום של מאמר זה.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק 1K22AI097291-01 ועל ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי Translational של המכון הלאומי לבריאות בפרס מספר UL1TR000433. אנחנו גם מכירים פרופ 'אירווין דארל ב- MIT ופרופ' מתיאס סטפן בפרד האצ'ינסון מרכז הסרטן על תרומתם בעבודה הראשונית על חלקיקי החיסון ועכברים הטרנסגניים OT-I / לוק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>1. סינתזה ואפיון של ICMVs טעונים במשותף עם אנטיגן חלבון ומולקולות אדג'ובנטיות
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (מלח נתרן) (MPB)Avanti Polar Lipids, INC.
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar Lipids, INC.
מונופוספוריל ליפיד A (סינתטי) (PHAD™) (MPLA)Avanti Polar Lipids, INC.699800
בקבוקוני זכוכית 20 מ"לWheaton0334125D
תנור ואקום SymphnyVWR414004-580
Ovalbumin (OVA)Worthington3054
Bis-Tris פרופאן (BTP)FisherBP2943
Q125 Sonicator (125  מ/20  kHz)QsonicaQ125-110
Dithiothreitol (DTT)FisherBP172
2 kDa פוליאתילן גליקול תיול (PEG-SH)Laysan BioMPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP Malvern
ZetaSizer CuvettesMalvernDTS1070
2. בדיקת ניקוז בלוטות הלימפה של ICMVs מתויגים פלואורסצנטיים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית
1,1'-דיוקטדציל-3,3,3',3'-טטרמתיל-אינדודיקרבוציאנין, מלח 4-כלורובנזנסולפונאט (DID)Life TechnologiesD-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)Life TechnologiesA37571
Tissue-Tek מדיום הקפאה OCT VWR25608-930
תבניות קריו-רקמותVWR25608-922
<חזק>3. ניטור התרחבות של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן, המבטאים לוציפראז לאחר חיסון ננו-חלקיקים עם עכברי הדמיה של בעלי חיים שלמים
C57BL/6 עכבריJackson000664
Albino C57BL/6 עכבריJackson000058
OT-1 C57BL/6עכברי Jackson003831
70 μ מסננת ניילון mBD352350
EasySep™ ערכת בידוד תאי T CD8+ עכבר StemCell19853
IVIS® מערכת הדמיה של בעלי חיים שלמיםPerkin Elmer
4. צביעת טטרמר פפטיד-MHC של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) לניתוח ציטומטרי זרימה של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן
K2EDTA צינורותBD365974
ACK מאגר ליזהLife TechnologiesA10492-01 
Anti-CD16/32 FC בלוקEbioscience14-0161-86
H-2Kb OVA TetramerMBLTS-5001-1C
Anti-CD8-APCBD553031
Anti-CD44-FITCBD553133
Anti-CD62L-PECy7Ebioscience25-0621-82
4′,6- Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)SIGMAD8417-10MG
ציאן ציטומטר זרימהבקמן קולטר
FlowJo תוכנהFlowJo
870012850375

מקורות

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130(2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771(2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765(2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. , 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740(2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465(2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105(2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627(2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

T CD8

מאמרים קשורים