מאמר שיטה

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש במבחנה

DOI:

10.3791/52779

⸱

18 ביוני 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצגים מבחני תפוקה גבוהים המספקים בשילוב כלים מצוינים לכימות שחרור NET מנויטרופילים אנושיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרנולוציטים נויטרופילים הם הלויקוציטים הנפוצים ביותר בדם האדם. נויטרופילים הם הראשונים להגיע לאתר ההדבקה. נויטרופילים פיתחו מספר מנגנונים אנטי-מיקרוביאליים כולל פגוציטוזיס, דה-גרנולציה ויצירת מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs). NETs מורכבים מפיגום DNA מעוטר בהיסטונים ומספר סמני גרגירים כולל מיאלופרוקסידאז (MPO) ואלסטאז נויטרופילים אנושי (HNE). שחרור NET הוא תהליך פעיל הכולל שינויים מורפולוגיים אופייניים של נויטרופילים המובילים לגירוש ה-DNA שלהם לחלל החוץ-תאי. NETs חיוניים למלחמה בחיידקים, אך שחרור בלתי מבוקר של NETs נקשר למספר הפרעות. כדי ללמוד עוד על הרלוונטיות הקלינית ומנגנון היווצרות ה-NET, יש צורך בכלים אמינים המסוגלים לכמת NET.

כאן מוצגות שלוש שיטות שיכולות להעריך שחרור NET מניטרופילים אנושיים במבחנה. הראשון הוא בדיקת תפוקה גבוהה למדידת שחרור DNA חוץ-תאי מנויטרופילים אנושיים באמצעות צבע קושר DNA אטום לממברנה. בנוסף, מתוארות שתי שיטות נוספות המסוגלות לכמת היווצרות NET על ידי מדידת רמות של קומפלקסים MPO-DNA ו-HNE-DNA ספציפיים ל-NET. שיטות אלה המבוססות על מיקרו-פלטות בשילוב מספקות כלים נהדרים לחקר יעיל של המנגנון והוויסות של היווצרות NET של נויטרופילים אנושיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
היווצרות

NET היא מנגנון חדשני שבאמצעותו נויטרופילים נלחמים בפתוגנים. 1 הליבה של NETs היא DNA גרעיני. 1 רשת DNA זו קשורה לחלבוני גרגירי נויטרופילים והיסטונים. 1 הצורה העיקרית של היווצרות NET דורשת מוות של נויטרופילים המאופיינים בעיבוי כרומטין, היעלמות ממברנות גרגיריות וגרעיניות, העברה של נויטרופילים אלסטאז לגרעין, ציטרולינציה של היסטונים ולבסוף דליפה של NETs מבוססי DNA. 2 NETs לוכדים והורגים מגוון רחב של חיידקים ומהווים חלק חיוני מרפרטואר הנשק החיסוני המולד. עם זאת, היווצרות NET בלתי מבוקרת נקשרה למחלות אוטו-דלקתיות רבות. 3,4 למרות הרלוונטיות ההולכת וגוברת שלהם, מעט ידוע על המנגנון והרגולציה של שחרור NET.

נויטרופילים שמתים על ידי שחרור NETs שונים מנויטרופילים אפופטוטיים או נמקיים. 3.5 נויטרופילים משחררי NET מראים מספר תכונות האופייניות להיווצרות NET. רכיבי גרגירים קשורים ל-DNA ב-NETs. 1 מיאלופרוקסידאז (MPO) ואלסטאז נויטרופילים אנושי (HNE) נמצאים שניהם בגרגירים ראשוניים בתאים במנוחה, אך מועברים לגרעין כדי להיקשר ל-DNA ב-NETs. 1 קומפלקסים של MPO-DNA ו-HNE-DNA הם ספציפיים ל-NETs, אינם מופיעים בנויטרופילים אפופטוטיים או נמקיים. 1,3,5 עיבוי כרומטין הוא תכונה נוספת האופיינית ל-NETosis. 2 שחרור NET דורש גם ציטרולינציה של היסטונים על ידי פפטידיל אמינידאז 4 (PAD4). 6 היסטונים ציטרולינים הם סימני היכר של נויטרופילים שעברו שחרור NET. 6

כאן מוצגות שלוש שיטות המספקות בשילוב כלים מצוינים לכימות NETs בסולם תפוקה גבוה. הבדיקה הראשונה שימשה בשטח עם שינויים שונים ומכמתת שחרור DNA חוץ-תאי בפורמט מיקרו-צלחת. הבדיקות השנייה והשלישית מספקות אישור ל-NETs על ידי מדידת קומפלקסים MPO-DNA ו-HNE-DNA ספציפיים ל-NET.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדירקטוריון סקירה מוסדיים מאוניברסיטת ג'ורג'יה אישרה את המחקר הסובייקט האנושי לאסוף דם היקפיים ממתנדבים בריאים (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 מתנדבים חתם על טופס הסכמה מדעת נדרש לפני לקיחת הדם. המחקר מבוצע במאמר זה תואם עם הקווים המנחים האתיים מחקר רפואי, כולל בבני אדם של הצהרת הלסינקי.

1. ניתוק של נויטרופילים מן היקפיים ודם (איור 1)

הערה: ישנן מספר דרכים כדי לבודד נויטרופילים מדם היקפי. הפרוטוקול הבא מספק אפשרות אחת. פרוטוקול זה מניב כמויות גדולות של נויטרופילים אדם שאינו מופעל מסוגל לשחרר נטס על גירוי חיצוני. השתמש 40 מ"ל דם מלא המתקבל מתנדבים בריאים ידי venipuncture. 7,9

  1. Aliquot דם 20 מ"ל לשני צינורות חרוטי 50 מ"ל. הוסף 10 מ"ל 6% Dextran. מערבבים בעדינות.
  2. לאחר 20 דקות העברה לויקוציטים-ריקיםהשלב העליון h בלי לקחת שום כדוריות דם אדומות pelleted לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל נקי, למלא אותו עם PBS סטרילית.
  3. צנטריפוגה ב 400 XG 10 דקות. Resuspend גלולה ב 4 מ"ל סטרילי PBS.
  4. הכן שיפוע Percoll 5 שלבים של 85% -80% -75% -70% -65% בשני צינורות חרוטי 15 מ"ל ההשעיה לויקוציטים מ"ל שכבת 2 על גבי אחד שיפוע.
  5. צנטריפוגה 800 XG במשך 30 דקות עם בלמים כבויים.
  6. לאסוף את כל התאים (נויטרופילים) בשכבות על% 75% / 80 ו -70% / 75% ממשק.
  7. פעמיים שטפו תאים PBS (350 XG, 10 דקות, RT) ולספור תאים באמצעות hemocytometer.

מדידה 2. קינטיקה של תאי DNA שחרור שימוש microplate fluorimeter

הערה: שיטה זו מאפשרת מדידה של שינויים הקרינה של צבען DNA מחייבת קרום חדיר מעיד על שחרור DNA על פורמט microplate 96-היטב (איור 2).

  1. כן השעיה של נויטרופילים במדיום assay (HBSS +1% (v / v) עצמיים סרום + 5 גלוקוז מ"מ) בריכוז של 2 x 10 6 תאים / מ"ל.
  2. הוסף 5 μmol / L של צבע DNA מחייבת קרום חדיר. מערבבים בעדינות.
  3. נויטרופילים האדם Aliquot (50 μl / טוב) על 96-היטב בתחתית שחור, שקוף microplates. ודא מדיום assay מכסה את כל תחתית הבאר. אם לא, הקש על צלחת בעדינות בצד.
  4. לחמם את נויטרופילים המכיל צלחת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. בינתיים להכין תמיסות של גירויים במחיר כפול של הריכוזי הסופי שלהם כדי לשמש (37 ° בינוני assay החם C). כביקורת חיובית נטו להשתמש נויטרופילים אדם עם 100 ננומטר phorbol-myristate-אצטט (PMA) עבור 4 שעות כדי לעורר שחרור NET מקסימלי. 5,8 גירוי PMA עבור 4 שעות מבטיחה שחרור NET מקסימאלי, תוך היווצרות NET ספונטנית נשאר 5,8 נמוכה.
  6. הכן את microplate fluorimeter לשקילה (4 שעות, 37 ° C, 530 ננומטר עירור 590 ננומטר עבור פליטה).
  7. לעורר נויטרופילים ידי הוספת פתרון הגירוי 50 μl 50 השעיות נויטרופילים μl. השתמש 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​saponin אחד טוב כדי למדוד אות שחרור DNA מקסימלי.
  8. מניחים צלחת בקורא ולמדוד שינויים הקרינה עבור 4 שעות ב כל 2 דקות עם לא רועד.
  9. לניתוח נתונים, לחשב עליות מנורמלות קרינה לאורך זמן.
    1. קרינת בסיס פחת מן ערכי נקודות קצה עבור כל הבארות כולל saponin (איור 2 א ', ב'). עליית קרינת saponin צריכה להיות האות הגבוהה ביותר. זה נקרא "שחרור DNA המקסימאלי" (איור 2 א).
    2. חישוב אחוזי שחרור DNA בדגימות ידועות על ידי חלוקת עליות קרינה של דגימות ידועות על ידי שחרור DNA מקסימאלי.
    3. ממוצע תוצאות של משכפל ולהציגם כמו "% של שחרור DNA המקסימאלי" (איור 2 ג).

3. כימות של בנטוation ידי MPO-דנ"א-DNA HNE מבחני ELISA

הערה: אלה מבחנים שונים (דנ"א MPO) או הקים (HNE-DNA) במעבדה שלנו לכמת היווצרות NET ידי מדידת רמות של מתחמי MPO-דנ"א HNE-DNA 5.

  1. מעיל 96-היטב גבוהה יכולת קשירה צלחות ELISA לילה עם נוגדנים לכידת (50 μl / טוב): אנטי-MPO (דילול 1: 2,000) או אנטי-HNE (1: 2,000).
  2. צלחות לשטוף ELISA שלוש פעמים עם PBS (200 μl / טוב) ולחסום אותם עם BSA 5% ו -0.1% אלבומין בסרום אדם עבור שעה 2 ב RT (200 μl / טוב). לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  3. נויטרופילים זרע על 96 גם microplates בצפיפות של 100,000 תאים / היטב במדיום assay 100 μl, וממריץ היווצרות NET. דגירת תאים: 4 שעות עבור 37 ° C.
  4. בצע עיכול DNase מוגבל על ידי הוספת 2 U / DNase מיליליטר supernatants נויטרופילים, לערבב אותם היטב. שמור אותם ב RT.
  5. עצור את DNase לאחר 15 דקות על ידי הוספת 11 μl 25 מ"מ EGTA (הריכוז הסופי 2.5 מ"מ). לערבב היטב. אסוף supernatants צינורות microfuge נקי. דגימות ספין להיפטר פסולת התא XG ב 300 דקות 5 ב RT. העבר supernatants שלהם לתוך צינורות microfuge נקיים. ולשמור אותם על הקרח עד מוכן.
  6. השתמש aliquot של "תקן NET" שהוכן קודם לכן.
    הערה: הסטנדרטית NET הוא שילוב של supernatants מתעכל DNase של נויטרופילים PMA מגורה המתקבלים לפחות 5 תורמים אנושיים שונים, עצמאיים.
    1. כדי להשתמש באותה רמה במשך זמן רב, לאסוף aliquot נפח גדול של supernatants נויטרופילים מכל תורם יחיד. איסוף למשל 2 מ"ל של supernatants מתעכל DNase של נויטרופילים מגורה PMA תגרום 200 aliquots (10 μl כל אחד) מספיק 200 צלחות ELISA. נתונים המאפיינים את תקן NET נמצאים איור 5.
    2. לעורר נויטרופילים אדם עם 100 ננומטר PMA עבור 4 שעות ולהחיל DNase לעכל כדי supernatants שלהם על פי השלבים 3.4-3.5.
    3. אסוף, בריכה, aliquot (10 μl) וחופשיze (-20 ° C) supernatants נויטרופילים.
    4. כדי להכין את "NET סטנדרטי", הפשרה אחד aliquot / תורם המתקבל לפחות חמישה תורמים נפרדים, לערבב אותם ולשמור אותם על קרח.
    5. בטל דגימות מופשרות ולהשתמש נרות חדשים לניסוי הבא.
    6. כן 1: דילול סדרה 2 של התקן-NET ב PBS + EGTA.
  7. לדלל דגימות מתעכלות DNase1 (סטנדרטי supernatants הידוע) פי 20 ב PBS + EGTA ו aliquot אותם על צלחות ELISA מצופות נוגדנים ללכוד.
  8. דגירה צלחות ELISA במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.
  9. החל פתרון נוגדן איתור (100 μl / טוב): נוגדן אנטי DNA מצומדות peroxidase חזרת (1: 500, העכבר). דגירה עבור שעה 1 בחושך.
  10. אחרי ארבעה שוטף עם PBS להוסיף מצע peroxidase TMB: 100 μl / היטב, 30 דקות. צבע הכחול הוא אינדיקציה לפעילות peroxidase (רשתות נוכחיות).
  11. עצור תגובה על ידי הוספת 100 μl / טוב 1 M HCl. הפתרונות כחולים יצהיבו (איור 5 א).
  12. קראו ספיגה ב 450 ננומטר באמצעות פוטומטר microplate.
  13. לניתוח נתונים, לחשב את כמות MPO-DNA או מתחמים-DNA HNE בהשוואת לתקן NET.
    1. הפחת את ערך צפיפות אופטית רקע של המדיום assay מכל המדגמים.
    2. מגרש את הערכים הספיגים (ציר ה- X) של דגימות תקן בדילול נגד תוכן NET היחסי (ציר ה- Y) (איור 5 א).
    3. באמצעות מגוון nonsaturated של עקומת סטנדרט זה להקים קו המגמה (להשתמש בכושר מעריכי הטוב ביותר מהתוכנה בשימוש) (איור 5 א). המשוואה של קו מגמה זו קובעת את ההמרה של ערכי OD כדי כמותיים סכומי נטס.
    4. הכנס את ערכי OD המדודים של האלמונים למשוואת המגמה אונליין מ 3.13.3 זה תיתן את כמות הרשתות במדגם הידוע כאחוז התקן-NET (איור 5 א).
    5. לחשבממוצעים של משכפל (triplicates) ולהציג את הנתונים הסופיים כמו "כמות MPO-DNA או מתחמי-DNA HNE (% לסטנדרטים)" (איור 5 ג).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנתונים בכתב היד הזה לתאר את שיטת בידוד נויטרופילים, פרוצדורות, ותוצאות נציג נוכחיות עם הסבר של ניתוח נתונים. איור 1 מציג את צעדי סדרתי של הכנת נויטרופילים אדם. פרוטוקול זה מייצג רק דרך אפשרית אחת של בידוד נויטרופילים. זה מניב כמויות גדולות של נח נויטרופילים מסוגל לשחרר נטס על גירוי. איור 2 מראה כיצד assay לשחרור DNA מבוסס-הקרינה עובד. באמצעות קינטיקה קורא microplate קרינה של שחרור דנ"א נויטרופילים אדם המיושמים 96 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשתות מייצגי מנגנון חדשני מרתק שבו נויטרופילים להרוג פתוגנים. 1 למרות שהספרות של הנטס כבר ברציפות ההרחבה בעשר השנים האחרונות מאז גילויין, מספר שאלות חשובות הקשורות לתפקידם בביולוגיה, מנגנון ויסות עדיין אינן ברורות. יש במתודולוגיה שתפותח למדוד נטס, זה מנגנון מיקרוביאלית מאוד ייחודי. מאמר זה מתאר את השיטות שבהן ניתן להשתמש כדי לכמת נטס באופן תפוקה גבוהה. את assay הראשון כדלקמן קינטיקה של הקרינה של צבען DNA מחייבת קרום חדיר. assay זה מספק כמות גדולה של מידע על המדרון ומהיר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תודה מיוחדת לצוות המעבדה של מרכז הבריאות של אוניברסיטת ג'ורג'יה על תמיכתם המתמשכת בעבודתנו על בידוד נויטרופילים אנושיים. עבודה זו נתמכה על ידי קרן הסטארט-אפ של ד"ר ראדה שסופקה על ידי משרד סגן הנשיא למחקר של UGA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נויטרופילים אנטי אנושיים אלסטאז  ארנב Ab Calbiochem4810011:2,000x מצופה
אנטי-מיאלופרוקסידאז Ab (ארנב)Millipore07-4961:2,000x מצופה
DNase-1Roche10-104-159-0011 µ גרם/מ"ל משמש לעיכול
20 מ"מ EGTA / PBSסיגמא-אולדריץ'E3889-25G
2.5 מ"מ EGTA/PBSסיגמא-אולדריץ'E3889-25G
זיהוי מוות תאי ELISA Anti-DNA PODRoche115446750011:500x 
Eon Microplate ספקטרופוטומטרBiotek
Gen5 All-in-One תוכנת מיקרו-פלטותBiotekכלי אנליטי (ELISA)
Sytox orangeLife TechnologyS113680.2% ריכוז/נפח סופי
1 M HepesCellgro25-060-Clהשתמש בריכוז סופי של 10 מ"מ.
1 M גלוקוזסיגמאהשתמש בריכוז סופי של 5 מ"מ.
HBSSCorning21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3Thermoscientific
PMASigmaP 8139100 ננומטר בשימוש סופי
ELISA PlateGreiner bio-one655061
צינורות חרוטיים 15 מ"לThermoscientific339650
צינורות חרוטיים 50 מ"לThermoscientific339652
פרקול (pH 8.5-9.5) SigmaP 1644נתרן כלורי, סיגמא, S7653-250G
ספקטרום דקסטרןD1004
RPMI 1640 מדיהקורנינג Cellgro17-105-CV
96 צלחת בדיקה היטב צלחת שחורה תחתית שקופהCostar3603

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  2. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
  4. Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34(2013).
  5. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
  6. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
  7. Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
  8. Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
  9. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
  10. Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205(2013).
  11. Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
  12. Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
  13. Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
  14. Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

throughputMPO DNA ELISAHNE DNA ELISASYTOX OrangePercoll

מאמרים קשורים