רוז בנגל Photothrombosis ידי דימות אופטי Confocal<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של שבץ כלי אחד

סיכום

כאן, אנו מתארים גישת מיקרוסקופיה אופטית חצי פולשנית לאינדוקציה של קריש פוטו-טרומבוטי של רוז בנגל בקליפת המוח הסומטוסנסורית של עכבר in vivo. ההיבטים הטכניים של הליך ההדמיה מתוארים מאינדוקציה של אירוע פוטוטרומבוטי ועד ליישום ואיסוף נתונים.

תקציר

טכניקות הדמיה in vivo גדלו בשימוש עקב ההתקדמות האחרונה בצבעי הדמיה וטכנולוגיות אופטיות, המאפשרות את היכולת לדמות אירועים תאיים בבעל חיים שלם. בנוסף, היכולת לגרום למצבי מחלה פיזיולוגיים כמו שבץ מוחי in vivo מגדילה את התועלת שלו. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת הערכה פיזיולוגית של תגובות תאיות בתוך מערכת העצבים המרכזית לאחר שבץ מוחי וניתן להתאים אותה למצבים פתולוגיים אחרים הנחקרים. הטכניקה שהוצגה משתמשת בעירור לייזר של הצבע הרגיש לאור Rose Bengal in vivo כדי לגרום לאירוע איסכמי מוקדי בכלי דם בודד.

פרוטוקול הווידאו מדגים את הכנת חלון גולגולת דק גולגולת מעל קליפת המוח הסומטוסנסורית בעכבר לאינדוקציה של אירוע פוטו-טרומבוטי של רוז בנגל תוך שמירה על פגיעה בחומר הדורה הבסיסי ובמוח במינימום. ההכנה הכירורגית מבוצעת בתחילה תחת מיקרוסקופ מנתח עם פלטפורמת ניתוח/הדמיה מותאמת אישית, אשר מועברת לאחר מכן למיקרוסקופ קונפוקלי המצויד במתאם אובייקטיבי הפוך. תמונות מייצגות שנרכשו באמצעות פרוטוקול זה מוצגות כמו גם רצפי זמן-lapse של אינדוקציה של שבץ מוחי. טכניקה זו עוצמתית בכך שניתן לצלם את אותו אזור שוב ושוב בימים שלאחר מכן, מה שמקל על מחקרי אורך in vivo של תהליכים פתולוגיים לאחר שבץ מוחי.

מבוא

ההדמיה היתרי הטכניקה המתוארת של in vivo תגובות הסלולר הבאה אינדוקציה של רוז בנגל מייד photothrombosis בעכבר ללא פגע. רוז בנגל (4,5,6,7-tetrachloro-2 ', 4', 5 ', 7'-tetraiodofluorescein) הוא צבע רגיש לשימוש כדי לגרום שבץ איסכמי במודלים של בעלי חיים (עכבר וחולדה). בעקבות הזרקה של RB בולוס דרך וריד הזנב והתאורה שלאחר מכן דרך גולגולת דלילה עם אור לייזר 564 ננומטר, פקיק מושרה גורם שבץ פיסיולוגי ^1. השיטה שתוארה במקור על ידי רוזנבלום ואל-Sabban בשנת 1977, ומאוחר יותר הותאמה על ידי ווטסון באמצע 1980 ^1,2. בקיצור, רוז בנגל הוא מוקרן עם אור ירוק העירור (לייזר 561 ננומטר במקרה שלנו), אשר מייצר את הייצור של מיני חמצן מגיבים, אשר לאחר מכן מפעיל גורם רקמה, יוזם מפל הקרישה. האינדוקציה של מפל הקרישה מייצרת איסכמי lesיון שהוא פתולוגית רלוונטי לשבץ קליני ^3.

יש שבץ הפתופיזיולוגיה מורכבת בשל יחסי הגומלין של סוגי תאים שונים רבים, כולל נוירונים, גליה, האנדותל ואת המערכת החיסונית. בחירת הטכניקה הטובה ביותר ללמוד תהליך סלולארי מסוים מחייב שיקולים רבים. טכניקות ניסיוניות נופלות באופן כללי לאחת משלוש קטגוריות: במבחנה, in vivo ובסיליקון ועם כל יתרונות וחסרונות שיש במבחנה יש חסרון העיקרי של הסרת תאים מהסביבה הטבעית שלהם ולכן לא יכולה להתרבות תופעות ראו בשלמותה,. חיים של בעלי חיים. בvivo טכניקות לספק לשכפול ניסיוני משופר של מדינות מחלה עם משמעות translational גדלה. בסיליקון ובדרך כלל מתייחס למודלים ממוחשבים של מחלה או תהליך סלולארי, ובזמן שמנוצל יותר ויותר ללמוד תגובות בין תרופתיות פוטנציאליות לבחינהple, כל מידע שלוקט חייב עדיין להיבדק בתאים חיים או רקמה.

המודל האידיאלי של שבץ במעבדת ההגדרה צריך להפגין תכונות פתולוגיים דומות לאלה ראו באוכלוסייה האנושית. אמנם יש מאפיינים פיסיולוגיים שכיחים של שבץ באוכלוסייה האנושית, יש גם הבדלים רבים, תלוי בסוג של פציעה חווה. שבץ באוכלוסייה האנושית מתרחש כחסימות קטנות או גדולות ספינה, נגעים מדממים, ועורק לעורק או לב ותסחיפים שיגרמו כרכי אוטם מגוונים כמו גם הבדלים במנגנונים הקשורים לכל פתולוגיה. היתרון של שימוש במודלים של בעלי החיים שבץ הוא הדור של אוטמים לשחזור המחקים מאפיינים של שבץ אדם. דגמי השבץ בבעלי החיים הנפוצים ביותר כוללים חסימת עורק באמצעות: עורקים התיכון ספיגה מוחין (שיטות נימה תסחיפים או endovascular) שMCAO דיסטלי דגמים ומודל photothrombosis. היתרונותחסרונות של כל דגם ד נבדקו במקום אחר (ראה ⁴ ו ^-5). מודלים גלובליים איסכמי (MCAO), בעוד קל יחסית לביצוע הם פחות רלוונטיים לאירוע מוחי אנושי מאשר דגמי שבץ מוקדי. בנוסף, שיטות אלה הן משתנים מאוד בגרימת נגעי אוטם המוח לשחזור. מודל photothrombosis הוא מאוד לשחזור, כל עוד הניסוי שולט ניסויים שלהם גם, מתן יתרון ברור על פני דגמי MCAO. עם זאת, בשל עלבון microvasculature המודל שתואר להציג פנומברה איסכמית מינימאלית, האזור שבו תאים נחשבים להציל ^6,7. בנוסף, בצקת vasogenic והיווצרות בצקת ציטוטוקסיות יכולים גם להיגרם ההקרנה של אזור ההדמיה הבאה. למרות מגבלות אלה הטכניקה סיפקה תובנה חדשה תהליכים פיסיולוגיים רבים לאחר שבץ ^{8, 9, 10, 11.}

פרוטוקול

הערה: נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים של האוניברסיטה למדעי בריאות טקסס מרכז סן אנטוניו ועלו בקנה אחד עם ההנחיות להגיע.

1. הרדמה לקליפת מוח הכנה

1. מניחים את העכבר בתא אינדוקציה עם isofluorane 2-3% מעורבבים עם חמצן כדי לגרום להרדמה. שים לב לירידת קצב הנשימה כעכבר מושרה. לצבוט את הכפה של העכבר כדי לקבוע אם העכבר הוא מוכן לעבור לחרטום. הערה: רמת הרדמה היא שלב קריטי בכל הכנת in vivo ויש להיזהר שלא לגרום לרמה שתגרום איסכמיה הגלובלית.
2. לאחר העכבר הוא הרדים מספיק, להעביר את בעלי החיים לניתוח פלטפורמת ההדמיה / ולמקם את האף של העכבר בחרטום ולהחיל isofluorane 1-1.2% כדי לשמור על מדינה בהרדמה. ודא שהעכבר שוכב על שיתוף טמפרטורהכרית חימום ntrolled כדי לשמור על טמפרטורת הגוף (37 מעלות צלזיוס +/- 0.5 מעלות צלזיוס) לאורך כל ההליכים שנותרו. מניחים משחה וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
3. לפקח הפיסיולוגיה של העכבר באמצעות מערכת דופק oximetry באמצעות קליפ הזנב או רגל מסופק עם המערכת. בדוק שקצב הנשימה נשמר בין 50-65 נשימות / דקה. בדוק שקצב הלב נשאר בין 300-450 פעימות לדקה וריווי חמצן נשמר בין 97-98% כדי להבטיח את הישרדות לטווח הארוך של בעלי החיים.
4. כאשר העכבר הוא הרדים כראוי, לגלח את השיער מעל הגולגולת באמצעות קוצץ חשמלי, להסיר שיער שייר ונקי עם בטאדין, ואחריו ספוגית אתנול. חזור על תהליך זה עד שלוש פעמים על מנת להבטיח סביבה כירורגית סטרילית.

2. נוהל כירורגי

1. עם הקרקפת ניקתה ומגולחת באופן מלא, לעשות חתך 5 מ"מ בקרקפת של העכבר כדי לחשוף את fissu הגולגולתמיל ולאתר גבחת.
2. השתמש מוליך כותנה סטרילי כדי להסיר כל שנותר fascia שמעל הגולגולת.
3. דבק טבעת מותאמת אישית נירוסטה (איור 1) עם דבק רקמות העצם המכסה את הקליפה הקודקודית באמצעות קואורדינטות stereotaxic של גבחת: -1 ל-3 מ"מ ורוחב: 2-4 מ"מ. הערה: הדבק בדרך כלל קובע בתוך 2 דקות לאחר המיקום של הטבעת על העצם.
4. להדביק את הטבעת לבעל stereotaxic (איור 2) כדי לייצב את העכבר, ולמנוע תנועה במהלך הדמיה.
5. תחת מיקרוסקופ לנתח כיתה כירורגית, לקדוח לאט סעיף 1-2 מ"מ בגולגולת באמצעות כלי מהירות מבוקרת כמו DREMEL (Meisinger מקדח 3.9 מ"מ) והקפד לשמור על רמת השטח כפי שהוא קדח. להשיג זאת באמצעות דפוס זיג זג. כדי להימנע מחום לבנות, להגדיר את מהירות תרגיל לנמוך ולקחת הפסקות תכופות.
6. כאשר גולגולת הגולגולת הופכת shinny במראה, תמשיך הדלילשל הגולגולת באמצעות סכין אזמל ניצול אותו דפוס זיג זג ולהשאיר את השטח דליל כדי להקל על הסרת חלק משכבות דקות של גולגולת גולגולת. באמצעות הקצה של להב סכין המנתחים לעשות משיכות יניארי קטנות עם לחץ קל כדי להסיר שכבות דקיקות של עצם בכל פעם. תמשיך את זה עד שכלי הדם נראה בבירור דרך מיקרוסקופ לנתח.
7. אם הנסיין נקבים דרך או לשבור את הגולגולת בתהליך ההרזיה, להרדימו בשל סיכוי לניזק לקליפת המוח הבסיסי.
   הערה: גולגולת העכבר היא כ 300 מיקרומטר בעובי ומורכב משתי שכבות דקות של עצם קומפקטי (שכבה אחת חיצונית ופנימית) ושכבה של עצם ספוגי דחוקה בין שתי השכבות של עצם קומפקטי. השכבה החיצונית של עצם קומפקטי ורוב העצם הספוגי יוסרו בתוך אזור קידוח 5 מ"מ וכתוצאה משכבת ​​50 מיקרומטר משוערת של עצם קומפקטי שנותר (ראה איור 2). Visualizני של כלי הדם יבטיח כי הגולגולת דלילה שלמה הסופית היא כ 50 מיקרומטר בעובי. הגולגולת לכן עדיין קיימת כאשר דיללו לעובי זה.

3. מיקרוסקופים קמה

1. השתמש מערכת הפוכה מיקרוסקופ (קונבנציונלי, confocal או מערכות שני פוטונים) שיש מהפך אובייקטיבי. הערה: אפשר גם לנצל מיקרוסקופ זקוף סטנדרטי. הגורם המגביל יהיה השטח בין הבמה והיעדים. שינויים בשלב עשויים להיות נחוצים כדי להשיג הגדרה זו.
2. אבטח את פלטפורמת הניתוח / הדמיה לבמה בהתאמה אישית הממוקמת בצד את הבסיס של המיקרוסקופ. הערה: הפלטפורמה נעשית באמצעות שקע מעבדה כדי לאפשר תנועה אנכית של פלטפורמת ניתוח / הדמיה תחת המטרה. שקע המעבדה הוא רכוב על צלחת מודבקת ארבע מוטות גליליות. (ראה איור 2).
3. מקם את המהפך האובייקטיבי המכיל 20Xאובייקטיבי על פני חלון הגולגולת. השתמש במקור אור חיצוני כדי למצוא את חלון הגולגולת ע"י הסתכלות דרך העיני של המיקרוסקופ ולמקם את המטרה באזור ההדמיה. הערה: אזור ההדמיה יהיה כונה על ידי הנוכחות של כלי הדם.
4. ליעדים על בסיס מים, להשתמש בנוזל מוח השדרה מלאכותי (aCSF) (130 מ"מ NaCl, 30 מ"מ KCl; 12 מ"מ KH ₂ PO _4; 200 מ"מ NaHCO _3; 30 מ"מ HEPES; וגלוקוז 100 מ"מ) כבינוני בשל פוטנציאל דליפה לתוך חלל הגולגולת במהלך ההדמיה (איור 3).

4. רוז בנגל דיי הכנה, מנהל ואינדוקציה של שבץ

1. הכן פתרון חדש 20 מ"ג / מיליליטר של רוז בנגל בנוזל השדרה מוחין מלאכותי (aCSF); לסנן ולעקר לפני הממשל. אל תעשה שימוש חוזר או לאחסן בנגל רוז פעם אחת זה כבר מעורב. הפוך פתרון טרי עבור כל ניסוי.
2. תן הזרקה לוריד 0.1 מיליליטר זנב של רוז בנגל בזמן שלשימורי חלון הגולגולת עם לייזר 561 ננומטר, כדי להבטיח הזרקה נאותה של הפתרון. הערה: רוז בנגל יהיה דמיין בתוך 5 שניות לאחר ההזרקה בכלי הדם של המוח. כל הכלי צריך להיות מלא עם רוז בנגל.
3. לאחר הזרקה מספיקה של צבע רוז בנגל לבחור כלי מתאים לפקק מבוסס על קוטר כלי (40-80 מיקרומטר) כדי להבטיח שחזור של בפרט נפח נגעים. להבחין בין עורקים וורידים ע"י הסתכלות בכיוון זרימת דם: העורקים יעברו מקוטר גדול יותר לכלי קוטר קטנים יותר, ורידים לעבור מקטנים לכלי קוטר גדולים יותר. המטרה זו מושגת בקלות על ידי הדמיה פעם רוז בנגל מוזרק.
4. לשנות את הגדרת מיקרוסקופ כדלקמן:
   1. להגדיל את הזמן להתעכב. הערה: זה ישתנה בהתאם למערכת מיקרוסקופ מנוצל.
   2. להגדיל את כוח הלייזר עד 100%.
   3. לאסוף תמונות רצף זמן במסגרת 1 / sec באמצעותמהירות סריקה המרבית.
5. סרוק את העכבר עד קריש יציב נוצר בתוך הכלי. הערה: בדרך כלל זו מושגת תוך 5 דקות של סריקה רציפה (ראה איור 4).
6. בעקבות האינדוקציה של היווצרות קריש דם באמצעות רוז בנגל, להסיר את העכבר מאזור ההדמיה חזרה למיקרוסקופ לנתח. מוציא בזהירות את טבעת הנירוסטה מגולגולת הגולגולת. בדוק את חלון הגולגולת לכל דימום. אם דימום מתרחש, לסיים את הניסוי.
7. השתמש 6.0 תפר monofilament כדי לסגור את החתך מעל הגולגולת. מניחים משחה אנטיביוטית לאורך קו התפר כדי למנוע זיהום. הזרק Buprenex תת עורי כל 12 שעות במשך שלושה ימים לניהול כאב (0.05 מ"ג / קילוגרם).
8. להחזיר את העכבר לחדר התאוששות לאחר ההסרה מההרדמה עד ער לחלוטין ולנוע בחופשיות.
9. החזר את העכבר לכלוב נקי לחקירה נוספת במועד מאוחר יותר.

5. הדמיה אורך בימים שלאחר מכן

1. להעסיק את השיטות הבאות כדי לבצע הדמיה אורך בימים שלאחר מכן הודעה photothrombosis.
   1. להרדים את העכבר כפי שתואר בסעיף 1 לשיטות.
   2. על הולם הרדמה מחדש לפתוח את הקרקפת על ידי הסרת כל תפרי שייר לפתוח מחדש את העור שמעל תחום ההדמיה נקדח בעבר.
   3. השתמש מוליך כותנה סטרילי כדי להסיר כל שנותר fascia שמעל הגולגולת.
   4. דבק טבעת מותאמת אישית נירוסטה (איור 1) עם דבק רקמות העצם שמעל תחום ההדמיה הקודם.
   5. להדביק את הטבעת לבעל stereotaxic (איור 2) כדי לייצב את העכבר, ולמנוע תנועה במהלך הדמיה.
   6. אתר את כלי הדם שבבסיס הגולגולת דליל בעבר. השתמש הזרקה לוריד זנב של FITC-dextran כדי לאמת את הנוכחות של הקריש המושרה בעבר.
   7. השתמש 6.0 תפר monofilament כדי לסגור את בcision על הגולגולת. מניחים משחה אנטיביוטית לאורך קו התפר כדי למנוע זיהום. הזרק Buprenex (0.05mg / קילוגרם) תת עורי כל 12 שעות במשך שלושה ימים לניהול כאב.
   8. להחזיר את העכבר לחדר התאוששות לאחר ההסרה מההרדמה עד ער לחלוטין ולנוע בחופשיות.

6. אימות של אינדוקציה שבץ (פוסט מורט)

1. בסיומו של מחקר, לוודא שבץ באמצעות כלוריד צביעת 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) כפי שמוצג באיור 5 נפח. ניתן למצוא השיטה המלאה ב ^-12.

תוצאות

מטרתה של שיטה זו הייתה לגרום לשבץ איסכמי במודלים של בעלי חיים (עכבר וחולדה) הבאים הזרקה של RB בולוס דרך וריד הזנב והתאורה הבאה של גולגולת דלילה עם אור לייזר 561 ננומטר. התמונות באיור 4 מדגימות את ההתקדמות של היווצרות קריש דם בתוך כלי אחד לאחר הקרנה של האזור בדקות 0, 1, 1.5 ו -2. לפני היווצרות קריש כל הכלי לבן בשל זרימה חופשית רוז בנגל. בעקבות האינדוקציה של הקרנה של כלי השיט יש מחשיך ברור בחלקים של כלי השיט ומציין את האינדוקציה של היווצרות קריש דם (מסגרות 1 ו -1.5 ...

דיון

היכולת לתרגם הפתופיזיולוגיה שבץ ניסיונית מבעלי חיים לבני אדם יישום כבר נגועה בכישלון. עם זאת, השימוש במודלים של בעלי חיים, כגון מודל photothrombosis, מאפשר להבנה משופרת של הפתופיזיולוגיה שבץ וחקר גישות טיפוליות חדשות כדי לספק neuroprotection בעקבות שבץ. משיכות בקליפת המוח קטנות וmicroinfarctions מיוצר על ידי מודל photothrombotic קליני רלוונטיות לשבץ תת קליני או "שקט" ^13-15, שבה יש שכיחות גבוהה ומשפיע על כ 4 אחוזים מאוכלוסיית ארצות הברית (כ -11 מיליון בני אדם) ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים
רוז בנגל	סיגמא	330000
איזופלורן הרדמה	MWI אספקה וטרינרית	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 1.25 מ"מ NaH<תת>2PO<תת>4, 2 מ"מ MgCl2, 2 mM CaCl<>sub2, 10 מ"מ גלוקוז ו-26 מ"מ NaHCO3 (pH 7.4).
[header]
ציוד
ניתוחי מספריים	מוצרים ביו-תעשייתיים	500-410
מספריים הפעלה 14 ס"מ	מוצרים ביו-תעשייתיים	12-055
מלקחיים Dumont היי טק #5 סגנון, ישר	מוצרים ביו-תעשייתיים	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
פלטפורמה עבור Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
מחזיק מוט אוזניים מהתקנה סטריאוטקסית	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent מכונת הרדמה מכרסמים	DRE, Inc.	15001
Tech IV וופורייזר איזופלורן	DRE, Inc.	34001
F מיכל אוויר	DRE, Inc	80120
צינור נשימה מעגל Bain	DRE, Inc	86111B
מתאם מכרסמים לצינור ביין	DRE, Inc	891000
O2 רגולטור למיכלי חמצן	DRE, Inc	CE001E
תא אינדוקציה מכרסמים	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 אינץ' עם מחט P-3	תפר אקספרס	1639G
מהפך אובייקטיבי מתאם אופטי	טכנולוגיות
מקדחה Foredom מתח כפול 110/120	Foredom	134.53
מקדח מייסינגר 3.9 מ"מ	מייזינגר		(Ref#310 104 001 001 009)

LSM