מאמר שיטה

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה באתר הכלאה

DOI:

10.3791/52799

⸱

17 ביוני 2015

 ,  ,  , 
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNAs לעתים קרובות מקומי לאקסונים חוליות והתרגום המקומי שלהם נדרש לpathfinding האקסון או הסתעפות בפיתוח ותחזוקה, תיקון או ניוון של מערכת עצבים בתקופות postdevelopmental. ניתוחי תפוקה גבוהים חשפו לאחרונה כי יש לי האקסונים transcriptome יותר דינמית ומורכבת יותר מהצפוי בעבר. ניתוח אלה, עם זאת כבר נעשה בעיקר בנוירונים בתרבית שבו ניתן לבודד האקסונים מתאי somato-הדנדריטים. זה כמעט בלתי אפשרי להשיג בידוד כזה ברקמות שלמות in vivo. לפיכך, על מנת לאמת את הגיוס של mRNAs ורלוונטי הפונקציונלי שלהם בכל בעלי חיים, צריכים להיות משולבים באופן אידיאלי ניתוחי transcriptome עם טכניקות המאפשרות ההדמיה של mRNAs באתר. לאחרונה, טכנולוגיות ISH רומן המזהות RNAs ברמת מולקולה בודדת פותחו. זה חשוב במיוחד בעת ניתוח לוקליזציה subcellular של mRNA, RNAs המקומי מאז נמצא בדרך כלל ברמות נמוכות. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים לצורך זיהוי של mRNAs axonally-מקומי באמצעות טכנולוגית RNA ISH רומן רגישה. יש לנו שילוב RNAscope ISH עם counterstain axonal באמצעות אימונוהיסטוכימיה הקרינה או צבעים היסטולוגית כדי לאמת את הגיוס של Atf4 mRNA לאקסונים in vivo בעכבר הבוגר והמוח אנושי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גיוס mRNA axonal ותרגום מקומי לאפשר האקסונים להגיב לגירויים תאיים באופן 1 באופן זמני ומרחבית חריפה. סינתזת חלבון תוך-axonal היא הדרך הטובה ביותר להבין בהקשר של התפתחות המוח שבו משחק תפקידים מכריעים בצמיחה חרוט התנהגות 2-8, האקסון מפלס-הדרך 9-11 ומדרדר איתות 12,13. אבל הרבה פחות ידוע על המשמעות התפקודית של סינתזת חלבון axonal בתאי עצב פוסט-התפתחותית כאשר רמות ה- mRNA והריבוזום axonal מופחתות 14,15 מאוד. האקסונים חוליות בוגרים כבר מזמן חשבו להיות translationally פעיל 16. עם זאת, המחקרים אחרונים מצביעים על כך שהתרגום מקומי מחדש באקסונים בוגרים תחת מצבים פתולוגיים. לדוגמא, קבוצת משנה של mRNAs מגויס לאקסונים התחדשות הבאה פגיעה עצבית וסינתזה של חלבונים תוך-axonal נדרשים להתחדשות הנכונה של אקסונים אלה 17. בנוסף, חה הקבוצה שלנוים הוכיח כי mRNAs הספציפי מגויסים לאקסונים לאחר חשיפה מקומית לפפטיד מחלת אלצהיימר Aβ 1-42, ותרגום המקומי של ATF4 גורם השעתוק נדרשת כדי להפיץ את השפעות ניווניות של Aβ 1-42 מן האקסונים לסומה העצבית 18. לבסוף, ניתוחי תפוקה גבוהים גילו כי יש לי האקסונים בוגרים transcriptome יותר מורכבת ודינמית מהצפוי 18-21, במיוחד בתנאים פתולוגיים. לאור המחקרים הללו, שיטה רגישה וספציפית מאוד כדי לזהות mRNAs axonally מקומי במערכת העצבים הבוגרת יש צורך.

חלק גדול מהעבודה על גיוס mRNA ותרגום מקומי באקסונים בוגרים שבוצע על נוירונים בתרבית. זה נכון במיוחד עבור transcriptome ניתוחים מאז שיטות culturing מיוחדות קיימות המאפשרות הבידוד של אקסונים מהתא הדנדריטי somato-18-20. למרות שמחקרים כאלה ניתנו תוספות יקרותight לתוך התפקיד של תרגום המקומי באקסונים בוגרים, השאלה אם נוירונים בתרבית מייצגים נאמנה את המצב בvivo או אם גיוס mRNA הוא תגובה אדפטיבית של אקסונים לתנאי culturing עדיין פתוח. מחקרים מעטים סיפקו ראיות לגיוס mRNA להבשיל האקסונים in vivo. לדוגמא, תמליל קידוד לחלבון סמן חוש הריח זוהה באקסונים בתאי עצב תחושתיים מבוגרים 22. Transgene המכיל 'UTR 3 של mRNA β-אקטין מועבר לאקסונים בתאי עצב במערכת עצבים היקפיים ומרכזיים בעכברים ומתורגם באופן מקומי לאחר תקופות התפתחותיות 23. B2 Lamin mRNA הוא מקומי לאקסונים רשתית בXenopues laevis ראשנים ודלדולה משפיע תחזוקת האקסון לאחר פיתוח axonal 21. הפרעה לתחבורה axonal של קידוד mRNA לIV מונואמין ציטוכרום C משנה עכבר התנהגות 24. לבסוף, Atf4 mRNA נמצא במבוגריםxons של עכברים ומוח אנושי בהקשר של Aβ 1-42 -induced ניוון מוחיים 18.

ניתוחי transcriptome תפוקה גבוהה הוכיחו להיות שימושי כדי לזהות פרופילי mRNA באקסונים מבודדים במבחנה אבל יש מגבלות במחקרי vivo מאז בכל רקמות האקסונים לא נמצאים בבידוד, אבל התערבבו עם גופים עצביים תא, תאי גלייה וסוגי תאים אחרים. לפיכך, ניתוח כזה צריך להיות משולב עם טכניקות הדמיה שלאשר את לוקליזציה subcellular של mRNAs. RNA הכלאה באתר (RNA ISH) מאפשר זיהוי והדמיה של רצפי RNA ספציפיים בתאים וברקמות. עם זאת, מבחני RNA ISH המקוריים היו מתאימים רק לזיהוי RNAs הנרחב ביותר 25, שהוא לעתים רחוקות במקרה של mRNAs המקומי axonally. לעשורים האחרונים גוברים מאמצים כבר הכניס לתוך טכנולוגיות חדישות פיתוח המאפשרות זיהוי של mRNAs ברמת המולקולה בודדת 25,26. לדוגמא, זינגר ועמיתיו פיתחו בדיקות ISH לזהות mRNAs בתאים בודדים, הכוללים 5 שאינם חופף שכותרתו fluorescently 50 מרס (לפרטים עיינו 27). ההבדל העיקרי בין השיטות שהוזכרו לעיל ואחד כאן תאר הוא שמאוחר יותר משתמש 20 Z-מבנה כפול (לא ליניארי) בדיקות, כי בדרך כלל היעד ~ אזור KB 1 של ה- RNA של הספציפיות הבטחת ריבית ורמות רקע נמוכות. אז בדיקות הם הכלאה עם רצפי מגבר קדם מגבר שסופו של דבר כותרת או מצומדות עם אנזימים המאפשרים תגובות chromogenic fluorescently. צעדי הגברה אלה משפרים את יחס אות לרעש בהשוואה לטכנולוגיות אחרות ISH 28. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים באמצעות RNAscope בשילוב גם עם immunocytochemistry הקרינה או עם צבעים היסטולוגית מאפשרים counterstaining axonal. שני הפרוטוקולים מתאימים לדמיין לוקליזציה axonal של Atf4 mRNA במו הבוגרלהשתמש ומוח אנושי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נהלי כל החיה אושרו על ידי IACUC של אוניברסיטת קולומביה והנחיות החלים על הטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה היו במעקב. הערה: הכן את כל המאגרים המשמשים לנוהלי ISH במי RNase בחינם או DEPC שטופל. המלצה זו היא לא ממש הכרחית לאחר ISH הושלם אבל הוא הציע לי מאגרים עדיין מוכנים במים מזוקקים כפולים autoclaved ו / או עיקור על ידי סינון.

1. איתור של Atf4 mRNA מקומי לכולינרגית האקסונים בקרינה באמצעות מבוגרי עכבר המוח באתרו הכלאה (דגים) ואחריו אימונוהיסטוכימיה

  1. לדוגמא הכנה לפרוסות מוח קפוא-קבוע paraformaldehyde
    1. לדוגמא הבאה, להכין פרוסות ממוח עכבר קפוא קבוע.
      1. בקצרה, להקריב את העכברים 9 חודשים ישנים על ידי הרדמה עם קטמין (100 קילוגרם מ"ג -1 משקל גוף) ו xylazine (10 קילוגרם מ"ג -1 weig גוףHT) ואחריו עירוי transcardial של paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS (pH 7.4).
      2. הסר את המוח ולאחר תיקון-paraformaldehyde 4% למשך 24 שעות ב 4 o C.
      3. לאחר קיבוע, לשטוף דגימות שלוש פעמים PBS וcryoprotect בסוכרוז 30% ב- PBS (pH 7.4) במשך 24 שעות ב 4 o C.
      4. מוח שבץ ב אוקטובר הקפאת מתחם, סדרתי סעיף 20 מיקרומטר על cryostat והר בשקופיות מיקרוסקופ טופלו פולי-D ליזין. שמור פרוסות מוח ב -20 מעלות צלסיוס עד לשימוש.
    2. הסר פרוסות מוח-קבוע paraformaldehyde מהמקפיא ואוויר יבש למשך 30 דקות ב RT.
    3. לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS.
    4. במנדף, מוח מחדש לתקן משסף את 20 דקות עם paraformaldehyde 4% ב RT.
      הערה: זהירות: paraformaldehyde 4% הוא רעיל ויש לטפל בם והושלך כראוי הבאה פרוטוקולי בטיחות.
    5. לשטוף שלוש פעמים עם 1X PBS.
    6. ליבש פרוסות מוח.
      1. הכן 50%, 75% ו -100%פתרונות אתנול.
      2. לטבול את השקופיות ב 50% אתנול למשך 5 דקות על RT.
      3. לטבול את השקופיות באתנול 75% במשך 5 דקות על RT.
      4. לטבול את שקופיות אתנול 100% במשך 5 דקות על RT.
      5. לטבול את השקופיות באתנול 100% טריים במשך 5 דקות על RT. הערה: לחלופין, ניתן לאחסן שקופיות באתנול 100% ב -20 מעלות צלזיוס עד 1 בחודש.
  2. assay דגים ואחרי אימונוהיסטוכימיה באמצעות אנטיגן / הסרת מסכות RNA מושרה חום
    1. לפני שמתחיל להכין את כל החומר הנדרש:
      1. מחממים את תנור הכלאה עד 40 מעלות צלזיוס ולמקם את מגש המכיל מים מזוקקים בתנור כדי ליצור סביבת humidified.
      2. קח קופסא שקופיות ולמקם את מגבות נייר ספוגות במים מזוקקים בתוך כדי ללחלח את תיבת השקופיות. מניחים את תיבת השקופיות בתנור ההכלאה.
      3. הסר בדיקות (שתי בדיקות שליליות ויעד) מהמקרר ולחמם אותם בתנור ההכלאה במשך 10 דקות. בואו הבדיקות לקרר דאוn ב RT.
      4. לאזן ריאגנטים ההגברה AMP 1-4 (כלולים בערכת פלורסנט Multiplex מגיב) ב RT.
      5. הכן פתרון אחזור אנטיגן: ציטראט 10 מ"מ נתרן (pH 6), Tween 0.05% 20. הערה: פתרון יכול להיות מאוחסן בRT ללא הגבלת זמן ומשומשות לצביעת עתיד.
      6. הכן לשטוף חיץ 1x דילול פתרון 50x המניות (הכלול בערכת פלורסנט Multiplex מגיב) במי RNase בחינם או DEPC שטופל.
        הערה: לשטוף חיץ 1x ניתן לאחסן על RT עבור 1 חודש ומשומשות לצביעת עתיד. חיץ לשטוף 50x עשוי לזרז. אם כן, חיץ לשטוף חום 50x בC o 40 במשך 10 דקות לפני הכנת הפתרון 1x.
    2. הסר שקופיות מאתנול 100% ואוויר יבש במשך 5 דקות על RT.
    3. הכן צנצנת coplin המכילה 50 מיליליטר של תמיסה אחזור אנטיגן. לטבול את השקופיות בפתרון אחזור אנטיגן ולהרתיח אותם במשך 10 דקות במיקרוגל.
      הערה: לחלופין מקום מחליקה אופקית ב100 מ"מצלחת בקוטר סיבוב של זכוכית המכילה פתרון אחזור 100 מיליליטר.
      1. למלא את כוס 1 ליטר עם מים מזוקקים ולמקם אותו במיקרוגל.
        הערה: המים "חיץ" החום בעת ביצוע הסרת מסכות.
      2. מניחים את השקופיות בפתרון אחזור אנטיגן בתוך המיקרוגל. רתיחה מחליקה במתח גבוה במשך 5 דקות. מייד לאחר הדגימות הפסיקו רותחת, חום מחליק שוב בעצמה גבוהה למשך 5 דקות נוספות.
      3. להתקרר שקופיות ב RT.
        הערה: שלב קריטי: משך רותח והליך צריך להיקבע על ידי משתמש, בהתאם למאפייני המיקרוגל. מהר הרתיחה מתחילה גבוהה יותר הסיכויים של אידוי פתרון. במקרה זה מומלץ שהדגימות מבושלות לתקופות זמן קצרות יותר יותר מפעמיים כדי להשלים זמן הסרת מסכות כולל של 10 דקות. להיפך, אם חימום מתבצע בכוח בינוני או נמוך, הסרת מסכות יכולות להתבצע פעם אחת במשך 10 דקות. עם זאת, אם דגימות לא להרתיח continuously עבור הסכום כולל של כ 10 דקות, זה עלול לגרום להסרת מסכות חלקיות של שני RNA היעד והחלבון כדי להתגלות.
    4. לשטוף שקופיות שלוש פעמים עם 1X PBS.
    5. להוסיף 2-3 טיפות (~ 100 μl) של חללית dapB מוגדרת פרוסות המוח אלה המשמשים להערכת מכתים רקע. הערה: סט הבדיקה dapB מטרות גן חיידקים ולא צריך להכיר כל RNA יונקים.
    6. להוסיף 2-3 טיפות של חללית המיקוד מוגדרת פרוסות המוח אלה משמשים לאיתור RNA של עניין. הערה: סט בדיקה מיקוד שאריות 20 - 1,381 של העכבר Atf4 mRNA משמש בדוגמא זו.
    7. שקופיות כיסוי עם parafilm כדי למנוע אידוי בדיקה, למקם אותם בתיבת שקופיות humidified בתוך תנור הכלאת דגירה אותם ב 40 מעלות צלסיוס במשך 2 שעות.
      הערה: אופציונלית: יכולות להיות הכלאה פרוסות מוח נוספת עם סט בדיקה מיקוד העכבר Polr2A ומשמשות כביקורת חיובית.
    8. לשטוף SLIdes פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    9. להוסיף 2-3 טיפות של AMP מגיב הגברה 1-פלורידה לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 30 דקות בתנור ההכלאה.
    10. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    11. להוסיף 2-3 טיפות של AMP מגיב הגברה 2-פלורידה לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
    12. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    13. להוסיף 2-3 טיפות של AMP מגיב הגברה 3-פלורידה לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 30 דקות בתנור ההכלאה.
    14. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    15. להוסיף 2-3 טיפות של AMP מגיב הגברה 4 FL-לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבה ושקופיות לדגור על 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
    16. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ 1x לשטוף עבור 2 דקות ב RT ופעמים עם 1X PBS.
    17. להוסיף 100-200 μl (או נפח מספיק כדי לכסות את הפרוסות לגמרי) של פתרון חסימה המכילות 3 מ"ג / מיליליטר BSA, 100 מ"מ וגליצין 0.25% Triton X-100 ב PBS (pH 7.4) לשקופיות, לכסות אותם עם parafilm ו דגירה במשך 30 דקות ב RT.
    18. הוספת 100 - של הנוגדן אנטי-צ'אט בדילול מלא בפתרון חסימה (1/100) לשקופיות 200 μl, לכסות אותם עם parafilm ו דגירה של 2 ימים בשעה 4 מעלות צלסיוס ודא שפרוסות המוח לא יתייבשו. במידת הצורך, מחדש להחיל פתרון נוגדן אנטי-צ'אט לפרוסות מוח 24 שעות לאחר הדגירה.
    19. לשטוף שקופיות שלוש פעמים ב1x PBS במשך 5 דקות ב RT.
    20. הוספת 100 - של הנוגדנים משני Alexa מצומדות המתאימים 200 μl (. למשל, Alexa-594 חמורים נגד עז לדוגמא זו בפרט) לשקופיות, לכסות עם parafilm וincubאכלתי במשך שעה 1 ב RT.
    21. לשטוף שקופיות שלוש פעמים ב1x PBS במשך 5 דקות ב RT.
    22. לשטוף שקופיות פעם במים מזוקקים.
    23. הר שקופיות עם הרכבה בינונית המכיל DAPI.
    24. דמיינו פרוסות מוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

2. איתור של Atf4 mRNA מקומי לאקסונים בדוגמאות מוח אנושיים באמצעות Chromogenic באתרו הכלאה (CISH) ואחריו כחול מהיר Luxol וCresyl יולט counterstaining

  1. לדוגמא הכנה לדגימות מוח האנושי מוטבע פרפין-קבוע פורמלין
    1. פרוסות אופה בתנור יבש בC o 60 לשעה 1.
    2. פרוסות מוח Deparaffinize במנדף.
      הערה: זהירות: ריאגנטים הם רעילים ויש לטפל בם וזנוח פועלים בהתאם להנחיות האבטחה המתאימות
      1. לטבול את השקופיות בסולקו חלופי קסילן פעמיים במשך 10 דקות.
      2. לטבול את השקופיות ב 100% אתנול פעמיים דקות 1.
      3. פרוסות IR-יבש 5 דקות ב RT. הערה: לחלופין דגימות עשויות להיות מיובשים בRT O / N אבל יש להשתמש תוך 24 שעות.
  2. Diaminobenzidine (DAB) המבוסס assay ISH chromogenic אחרי כתם כחול וcresyl המהיר luxol הסגול באמצעות הסרת מסכות RNA מושרה חום ופרוטאז-induced
    1. לפני שמתחיל להכין את החומרים נדרשים:
      1. מחממים את תנור הכלאה עד 40 מעלות צלזיוס ולמקם את מגש המכיל מים מזוקקים כדי ליצור סביבת humidified.
      2. קח קופסא שקופיות ולמקם את מגבות נייר ספוגות במים מזוקקים בתוך כדי ללחלח את תיבת השקופיות. מניחים את תיבת השקופיות בתנור ההכלאה.
      3. הכן 1x Pretreat 2 על ידי דילול פתרון 10x המניות (כלולים בערכת CISH מגיב) במי RNase בחינם או DEPC שטופל. אם לפני הטיפול מתבצע על צלחת חמה, להוסיף לפתרון Pretreat 100 מיליליטר לצלחת זכוכית קוטר 100 מ"מ להגדיל את שטח המגע בין הצלחת והצלחת החמה (אם המקדיםמתבצע במיקרוגל, צנצנת coplin ניתן להשתמש במקום כמפורט ב1.2.3). פתרון לחום 100 המעלות צלסיוס ולשמור אותו רותח לא יותר מ 30 דקות לפני הצללה דגימות.
      4. בדיקות חום שליליות וחיוביות של 10 דקות ב -40 מעלות צלזיוס ולהתקרר בRT.
      5. לאזן ריאגנטים ההגברה AMP 1-6 (כלולים בערכת CISH מגיב) ב RT.
      6. הכן לשטוף חיץ 1x דילול פתרון 50x המניות (הכלול בערכת CISH מגיב) במים מזוקקים. הערה: 1x חיץ לשטוף יכול להיות מאוחסן על RT עבור 1 חודש ומשומשות לצביעת עתיד.
    2. להוסיף 4 טיפות ~ (~ 120 μl) של 1 Pretreat לכל פרוסה מוח, לכסות עם parafilm ולדגור על RT במשך 10 דקות.
    3. לשטוף 3 עד 5 פעמים במים מזוקקים טריים.
    4. לבצע הסרת מסכות מושרה בחום:
      1. העברת שקופיות חמות Pretreat 2 (כלולות בערכת CISH מגיב) ופתרון רתיחה במשך 15 דקות. הערה: ניתן לבצע רותחים על צלחת חמה הבטחהרתיחה רציפה או במיקרוגל הבא שצוינו ב1.2.3 שלבים קריטיים).
    5. מייד להעביר שקופיות למים מזוקקים ולשטוף 3 עד 5 פעמים.
    6. לשטוף שקופיות 3 עד 5 פעמים באתנול 100% טריים.
    7. פרוסות אוויר יבש 5 דקות ב RT. הערה: O לחלופין ניתן לייבש פרוסות / N.
    8. לבצע הסרת מסכות מושרה פרוטאז:
      1. הוסף 4 טיפות של Pretreat 3 (כלולים בערכת CISH מגיב), לכסות עם parafilm ו דגירה 30 דקות ב -40 מעלות צלזיוס בתנור ההכלאה.
    9. לשטוף שקופיות 3 עד 5 פעמים במים מזוקקים טריים.
    10. הוסף 4 טיפות של חללית dapB מוגדרת פרוסות המוח אלה המשמשים להערכת מכתים רקע.
    11. הוסף 4 טיפות של חללית המיקוד מוגדרת פרוסות המוח אלה משמשים לאיתור RNA של עניין.
      הערה: סט בדיקה מיקוד שאריות 15 - 1,256 של ATF4 mRNA האנושי משמשת בדוגמא זו. אופציונליות: פרוסות מוח נוספות יכולות להיות היבridized עם סט בדיקה מיקוד PPIB אדם ומשמש כביקורת חיובית.
    12. מניחים שקופיות בתיבת השקופיות ודגירה של 2 שעות. ב 40 מעלות צלסיוס בתנור ההכלאה.
    13. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    14. הוסף 4 טיפות של מגיב AMP 1 לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 30 דקות בתנור ההכלאה.
    15. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    16. הוסף 4 טיפות של AMP 2 מגיב לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
    17. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    18. הוסף 4 טיפות של AMP 3 מגיב לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 30 דקות בתנור ההכלאה.
    19. לשטוף שקופיות פעמיים עם 1x היהחיץ שעות למשך 2 דקות על RT.
    20. הוסף 4 טיפות של AMP 4 מגיב לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm, למקם אותם בתיבת השקופיות ולדגור על 40 מעלות צלסיוס במשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
    21. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    22. הוסף 4 טיפות של AMP 5 מגיב לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm ו דגירה 30 דקות ב RT.
    23. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    24. הוסף 4 טיפות של AMP 6 מגיב לכל פרוסה מוח, לכסות שקופיות עם parafilm ו דגירה 15 דקות ב RT.
    25. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT.
    26. לערבב נפח שווה של חום-1 וחום-2 ריאגנטים (כלול בערכת CISH מגיב), להוסיף ~ 120 μl של פתרון לכל פרוסה מוח, לכסות עם parafilm ו דגירה 10 דקות ב RT.
    27. לשטוף שקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף 1x עבור 2 דקות ב RT ולשטוף פעם אחת במים מזוקקים.
      הערה: צעדים קריטיים: השלבים הבאים הם קריטיים ללהשיג counterstain axonal אופטימלי ללא מיסוך הנוכחות של גרגרי RNA.
    28. לפני ביצוע counterstain לבדוק הנוכחות של mRNA של עניין תחת מיקרוסקופ brightfield. להגדיר אזורי התייחסות בדגימות המוח שבו כדי לפקח על הנוכחות של puncta לאורך הליך counterstain.
    29. פתרון כחול מהיר luxol מחממים ב 60 מעלות צלסיוס
    30. מגלשות מקום בכחול מהיר luxol דגירה 30 דקות ב -60 מעלות צלסיוס
    31. יש לשטוף מספר פעמים במים מזוקקים.
    32. טובלים שקופיות כמה פעמים ב0.05% פתרון ליתיום קרבונט להתחיל בידול.
    33. טובלים שקופיות פעמיים באתנול 75% טריים.
    34. יש לשטוף במים מזוקקים.
    35. בדקו פרוסות מוח תחת מיקרוסקופ brightfield. שים לב שחומר אפור ולבן צריך להתחיל להיות גרגרים להבחין ו- RNA עדיין נראים כמו puncta הכחול כהה / שחור. ודא שהאקסונים יתחילו להופיע כסיבים תכלת.
    36. חזור על שלבים 2.2.28 ל2.2.32. Perforincubations מ 'עם פתרון מהיר luxol כחול ב10 - 20 צעדי דקות, ניטור counterstain ואת הנוכחות של גרגרי RNA בזהירות. הערה: בדרך כלל, counterstain האופטימלי נרכש ב60-90 דקות (סה"כ זמן דגירה), אך זמן יכול להתקצר אם הוא חשוד כי גרגרי RNA עשויים להיות רעול פנים על ידי הכתם הכחול המהיר luxol (ראה איור 2 דוגמאות).
    37. דגירה שקופיות בפתרון סגול cresyl במשך 10 דקות ב RT.
    38. יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים.
    39. טובלים שקופיות 5 עד 10 פעמים באתנול 70%.
    40. ליבש פרוסות מוח באמצעות 3 שינויים מהירים של 100% אתנול.
    41. במנדף, פרוסות מוח ברורות על ידי דוגרים פעמיים בסולקו חלופי קסילן 2 דקות ופעם שלישית במשך 5 דקות על RT.
    42. פרוסות מוח ההר בהרכבה בינונית קבועה מבוסס קסילן.
    43. ניתוח דגימות תחת מיקרוסקופ brightfield.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיכום קצר של ההליכים שתוארו לעיל מוצג באיור 1.

זיהוי אופטימלי של Atf4 mRNA גרגירים באקסונים כולינרגית באמצעות הסרת מסכות מושרה חום

כאשר הערכת לוקליזציה axonal של mRNAs, זה הוא קריטי כדי להיות מסוגל לזהות את האקסונים ולהיות מסוגל לדמיין RNAs שפע נמוך. טכנולוגית RNA ISH המתוארת כאן מאפשרת זיהוי של RNAs ברזולוציה מולקולה ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדוח זה אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית ISH ברזולוציה גבוהה בזיהוי של mRNA Atf4 המקומי axonally. מחקרים שפורסמו אלה וקודמים הראו כי טכנולוגיה זו היא תואמת עם זיהוי חלבון מבוסס נוגדנים ברקמות או אפילו עובר כל 33. חשוב לציין, זה כבר היה בשימוש לאחרונה לגילוי Arc mRNA בתוך הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס 34. זה גם יכול להיות בשילוב עם צבעים היסטולוגית לצביעת רקמות. לבסוף, הוא מתאים לזיהוי בו זמני של מספר יעד RNAs 28,30,33. ממצאים אל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי אגודת האלצהיימר (NIRG-10-171721; ל-U.H.), המכון הלאומי לבריאות הנפש (MH096702; ל-U.H.), המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NS081333; ל-C.M.T.), ופרסי מחקר פיילוט מהמכון הלאומי להזדקנות המרכז לחקר מחלת האלצהיימר באוניברסיטת קולומביה (AG008702; לג'.ב. וי.י.ג'יי) התומך גם בבנק המוח של ניו יורק. אנו מודים לחברי מעבדת Hengst על ההערות והדיונים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בדיקה מותאמת אישית מכוונת שאריות 20-1,381 של העכבר Atf4 mRNA (NM_009716)Advanced Cell Diagnostics-בדיקה
מותאמת אישית שאריות בדיקה מותאמת אישית 15-1,256 של ATF4 mRNA (NM_001675.2)Advanced Cell Diagnostics-בדיקה
בקרה שלילית-DapBAdvanced Cell Diagnostics310043
בדיקהבדיקה בקרה חיובית-עכבר Polr2A (אופציונלי)אבחון תאים מתקדם312471בדיקה
בדיקה בקרה חיובית-PPIB אנושי (אופציונלי)אבחון תאים מתקדם313901
בדיקה RNAscope ערכת ריאגנט פלואורסצנטי (לזיהוי פלואורסצנטי)אבחון תאים מתקדם320850in-situ ערכת
הכלאהערכת ריאגנטים RNAscope 2.0 HD - חום (לזיהוי כרומוגני)אבחון תאים מתקדם310035in situ ערכת הכלאה
נוגדן אנטי-ChAT פוליקלונלי עזMilliporeAB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain KitAmerican MasterTechKTLFB
Clearify Clearify Agent (תחליף קסילן)American MasterTechCACLEGAL
תושבת זהב ProLong  בינונית עם מדיום הרכבה DAPILifeTechnologies P36935
DPXSigma6522

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506(2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079(2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55(2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Situ HybridizationRNAscope TechnologyAxonal mRNA DetectionBrain Section AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryAntigen UnmaskingProbe HybridizationSignal AmplificationCholine Acetyltransferase StainingLuxol Fast Blue Counterstain

מאמרים קשורים