מאמר שיטה

עכבר דגם של דחיית כלי דם הנוצרת על-Alloimmune וטרשת עורקים להשתלות

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52800

⸱

17 במאי 2015

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים פרוטוקול להשתלת אינטרפוזיציה של אבי העורקים בעכברים. מטרת הפרוטוקול היא לספק מודל שבאמצעותו ניתן לחקור תהליכים פתולוגיים ואסטרטגיות טיפוליות הרלוונטיות לתגובות אלואימוניות בעורקים ולשינויים העורקיים הנובעים מכך התורמים לכישלון השתלת איברים.

תקציר

דחיית כלי הדם המובילה לטרשת עורקים מושתלת (TA) היא הייצוג המוביל של אי ספיקת השתלת לב כרונית. ב-TA, המערכת החיסונית של המושתל גורמת לנזק לדופן העורקים ולתפקוד לקוי של תאי אנדותל ותאי שריר חלק. זה מעורר תגובת תיקון פתולוגית המאופיינת בעיבוי אינטימי וחסימה לומינלית. הבנת המנגנונים שבאמצעותם מערכת החיסון גורמת לדחיית כלי דם ו-TA עשויה לתרום לפיתוח דרכים חדשות לניהול כישלון השתל. כאן, אנו מתארים מודל אינטרפוזיציה של אבי העורקים של עכבר שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים הפתוגניים של דחיית כלי דם ו-TA. המודל כולל השתלה של מקטע אבי העורקים מבעל חיים תורם לנמען אלוגני. דחיית מקטע העורק כרוכה בתגובות אלואימוניות וגורמת לשינויים בעורקים הדומים לדחיית כלי הדם. ניתן להשתמש בגישה הטכנית הבסיסית שאנו מתארים עם זני עכברים שונים והתערבויות ממוקדות כדי לענות על שאלות ספציפיות הקשורות לדחיית כלי דם ו-TA.

מבוא

מעל 30 + השנים האחרונות, התקדמות בתרופות לדיכוי המערכת החיסונית הצטמצמה דחיית שתל בשל דחייה חריפה אבל דחייה כרונית עדיין מהווה אתגר עיקרי. הביטוי העיקרי של דחיית השתלת לב הכרונית הוא טרשת עורקים השתלה (ת"א) 1,2. מצב זה מאופיין על ידי היפרפלזיה intimal וחוסר תפקוד של עורקי vasomotor שתל ומתפתח כתוצאה של מיקוד חיסוני של תאי שריר אנדותל וחלק על ידי המערכת החיסונית הנמען. המיקוד הספציפי של כלי דם השתל בשל הכרה מורכבת הזר פפטיד-גדול histocompatibility (MHC) מודגש על ידי הפיתוח של ת"א באופן בלעדי בעורקי שתל תוך חוסך כלי מארח 3. בקנה אחד עם זה הוא התצפית שת"א אינה מתרחשת באופן ניסיוני כאשר הנמען הוא זהה מבחינה גנטית לתורם או כאשר הנמען חסר תאי T ו- B 4. פציעה של כלי דם בתיווך חיסוני וdysfunction גורם להתפתחות של עיבוי intimal וסיסטיק, כמו גם ההצטברות החריגה של שומנים וחלבוני ECM, בת"א 5. עיבוי intimal נוטה להיות קונצנטריים לאורך 4-6 עץ עורקים כולו. אובדן שתל ומוות מתרחשים בדרך כלל כתוצאה מאיסכמיה מתקדמת כתוצאה מחסימה של עורקי luminal שתל 4.

בשינה 1991, Mennander et al. 7 חלוצים מודל חציצת אב העורקים בחולדות מודל ת"א. מספר קבוצות שלאחר מכן מותאמות הליך זה לשימוש בעכברים. במודל זה, מגזרי אב העורקים שתל לפתח נגעים שיש להם תכונות דומות לת"א נצפו בהשתלות קליניות. זה כולל עיבוי intimal המאופיין בהצטברות של תאים כמו שריר חלק ולויקוציטים נמען 7. מעל 2 העשורים האחרונים מודל זה נעשה שימוש כדי ליצור תובנה חשובה למנגנונים של פגיעה בכלי הדם, דחייה ות"א. זה יכול להיות לנואד לבחון שאלות הקשורות למערכת חיסונית וכלי דם במהלך פתולוגיה עורקים. הבחירה של השפעות חוסר התאמת אנטיגן היכולת לטפל כראוי על שאלות אלה.

השתלה פני מחסומי MHC מלאים מאפשרת הערכה מקיפה של תגובות חיסוניות שידועים כי הם יהיו מעורבים בדחיית השתלות איברים. זה כולל הכרה ישירה CD4 ו CD8 T תא ומיקוד של פפטיד הזר-MHC שהוצג על ידי תאים שמקורם שתל, CD4 העקיף (ואולי CD8) הכרת T תא ומיקוד של alloantigens נגזר שתל שהוצג על ידי אנטיגן נמען מציג תאים, וantibody- הכרה בתיווך של alloantigens על משטחי תא כלי דם 8. עם זאת, התגובה של כלי הדם לפגיעה בניסויים הלא תואמים-MHC מלאים עשויה להיות שונה מזה שנצפה קליני. ג'ונסון et al. 9 הראה כי, בשתלי אב העורקים חציצה מושתלים על פני מחסום חוסר התאמת MHC מלא, רובתאי neointimal הם ממוצא נמען ולא ממוצא תורם. זה שונה מזה שנצפה בהשתלות אנושיות שבו רוב תאי שריר חלק intimal הם ממוצא תורם 9,10. כדי להסביר למגבלה זו, מודלים ניסיוניים חלופיים שכרוכים בהשתלה על פני חוסר ההתאמה אנטיגן histocompatibility קטין פותחו כי לעורר תגובות של כלי דם שדומים יותר לאלו שנצפו בהשתלת קלינית 11. בעוד מודלים החלופיים אלה מאפשרים למסקנות חשובים להתבצע לגבי התגובות של כלי דם המניע את ההתפתחות של ת"א, התהליכים החיסוניים הגורמים לדחייה של כלי דם בשתלים תואמים אנטיגן histocompatibility קטין לא לגמרי מחדש להיכנע אלה המתרחשים בסביבה הקלינית. לדוגמא, אנטיגנים histocompatibility קטין מוכרים היטב על ידי נוגדנים תגובתי שתל 12. בהתחשב בשיקולים שפורט לעיל, חשוב לשקול את Questi פתולוגיעל נבחן בעת ​​בחירת הסוג של חוסר התאמת אנטיגן בשימוש במודל חציצת אב העורקים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להשתלת חציצת אב העורקים בעכברים. אנו מתארים השתלת חציצה בין עכברי MHC-תואמים מלאים אבל באותו הפרוטוקול משמש להשתלה על פני זני עכבר אחרים אנטיגן תואמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת סיימון פרייזר. השימוש BALB / cYJ (ד H2) עכברי תורם ו / 6 עכברי נמען (H2 ב) C57Bl לבחון תגובות אלוגנאית. עכברים המשמשים לניסויים בגילאי 8 עד 12 שבועות. השתמש עכברים או נקבה או זכר. בקרות syngeneic מורכבות ממגזרי אב העורקים מC57Bl / 6 תורמים לC57Bl / 6 נמענים.

1. תורם ומקבל הכנה

הערה: שני התורם והמקבל מורדמים ומוכן לפני הניתוח כדי למזער איסכמיה של השתל. הרדמה בזריקות המשמשות בפרוטוקול כדי למנוע חסימה של בעלי החיים על ידי ציוד הדרוש עבור המשלוח של חומרי הרדמה בשאיפה. עם זאת, אם תרצה בכך, הרדמה בשאיפה היא חלופה מתאימה. מההזרקה הראשונית של ההרדמה, ההליך כולו אורך כ 90 דקות כדי להשלים. זמן איסכמי של השתל הוא פחות than 30 דקות.

  1. להרדים את העכבר עם זריקות intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם; 10 מ"ג / מיליליטר) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם; 1 מ"ג / מיליליטר). העכבר יהיה מסומם בתוך 10 עד 15 דקות. להעריך את עומק ההרדמה על ידי צובט את החלק השומני של כרית כף רגל בעלי החיים. לנהל 1/3 מהמינון המקורי של קוקטייל ההרדמה, לפי צורך, עד שהחיה אינה התערוכה רפלקס נסיגה. צג קצב הנשימה מקרוב אחרי כל קוקטייל מנוהל. במהלך ניתוח, להעריך את רמת ההרדמה כל 15 דקות על ידי צובט את דופן הבטן הקדמית עם זוג המלקחיים. העכברים צריכים להישאר מורדמים עמוק 60 עד 90 דקות.
  2. לשמן את עיניו של העכבר עם משחת עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
  3. לגלח את השיער קרוב לעור ככל האפשר על אזור בטן הגחון מאמצע בית החזה-לחיק. היזהר שלא במיוחד לניק כל עור. אין להשתמש בקרם מקריח כי זה יכול להיספג אניn כדי העור ויכול להיות דלקתי.
  4. מניחים את החיה במצב שכיבה במגבת מעל שולחן החימום או כרית.
  5. נקה את האתר כירורגית עם לשפשף ראשוני עם chlorohexidine 2%. הכן שטח עבודה גדול על מנת למקסם את שדה הניתוח. התחל קרצוף במרכז האתר כירורגית ולעבור למחוץ בצורה ליניארית או עגולה. השלך את הגזה. חזור על תהליך זה 5 יותר לפחות פעמים. החל משטח הכנת אלכוהול לאותו האזור. ברגע שהאלכוהול הוא יבש, להכין את השטח הנקי עם תמיסת פולידין ווילון עם גזה סטרילית.

2. מקצה לקצה השקה נוהל

  1. מבצע תורם
    1. לשמור על טכניקת aseptic בכל הפעולה. לנקות את כל משטחי השיש ושולחן כירורגית עם 0.5% פתרון מי חמצן מואץ לפני השימוש. לעטוף וחיטוי כל מכשירים, מלמלה, וילונות כירורגית ושמלות לפני השימוש. ודא סטריליות של המכשירים עם קיטוררצועת מחוון מעקר להציב בכל חבילה. כפפות מנתחים סטרילית משמשות ומסולקות בין ניתוחים. לניתוחים מרובים, לעקר את מכשירי הניתוח בין שימושים עם מעקר חרוז זכוכית החם.
    2. מניחים את עכבר התורם במצב שכיבה על לוח נקי, דק פרספקס עטוף בוילון סטרילי תחת מיקרוסקופ בהגדלה ההפעלה 8-30X.
    3. לאחר הבטחת הרדמה כירורגית נאותה כפי שתואר בסעיף 1.1, להמשיך בניתוח.
    4. בעזרת המספריים סטרילי, לעשות חתך בבטן אורך קו האמצע אחת נמוך יותר, מהחיק לתהליך xyphoid.
    5. באמצעות מפשק קטן, פתח את קירות הבטן לחשוף את החלל.
    6. השימוש בצמר גפן סטרילי הטה החלת, בעדינות לחזור המעיים superiorly לבעלי החיים של שמאל ולכסות עם הגזה טבולה בתמיסת מלח. הזז את איברי הרבייה inferiorly ולאתר את אב העורקים infrarenal ונחות הווריד הנבוב (IVC). מואיזעשר רקמות חשופות מעת לעת עם תמיסת מלח.
    7. באמצעות 5 המלקחיים מס 'הרפואי, להפריד את אב העורקים מIVC, מהרמה של עורק הכליה השמאלי להסתעפות. השתמש 10-0 תפרי monofilament פוליאמיד ולקשור את הענפים הקטנים ליד אב העורקים.
    8. ברגע שאב העורקים של התורם הופרד מIVC, להרוות את הכלי עם מי מלח, לכסות את החלל החשוף עם גזה לחה ולהגדיר את התורם בצד על אזור סטרילי. בדוק את מצבו של התורם (נשימה ותפקוד לב וכלי דם, ועומק ההרדמה) כל 15 דקות. להתחיל לפעול על הנמען, בידוד אב העורקים כמתואר להלן (שלבי 2.2.1 ל2.2.7).
    9. ברגע שאב עורקי הנמען הופרד מIVC ומניחים בצד, להחזיר את התורם מתחת למיקרוסקופ. מהדק צלב (פרוקסימלי ודיסטלי למגזר של ריבית) אב העורקים התורם, כ 5 גזרי מ"מ, עם שני 4 מ"מ מהדק כלי דם.
    10. שימוש microscissors Vannas-טובינגן,תחצה קטע קטן שתל (3 עד 4 מ"מ אורך) של אב העורקים בבטן.
    11. שימוש במחט 25 G 5/8 מצורפת מזרק, לשטוף את אב העורקים נכרת עם heparinized (100 U / ml) תמיסת מלח. ודא קצה המחט אינו בא במגע עם הכלי.
    12. אב העורקים מקום בheparinized (100 U / ml) תמיסת מלח על קרח ומניח בצד. אמנם עדיין תחת הרדמה עמוקה, לשחרר את מהדק כלי הדם. להרדים את התורם על ידי exsanguination.
    13. שתל כלי התורם בתוך 30 דקות של כריתה. למרות שניתן להשתמש בכלי תורם אחד למספר נמענים על ידי כריתת אורך גדול יותר של אב העורקים, לשמור על זמן איסכמי פחות מ 30 דקות.
  2. מבצע נמען
    1. לשמור על טכניקת aseptic בכל הפעולה, כמו במבצע תורם.
    2. מניחים את עכבר הנמען במצב שכיבה על לוח פרספקס דק עטוף בוילון סטרילי תחת מיקרוסקופ בהגדלה ההפעלה 8-30X.
    3. אפter להבטיח הרדמה נאותה, להמשיך בניתוח כאשר בעלי החיים אינו תערוכה רפלקס נסיגה.
    4. בעזרת המספריים סטרילי, לעשות חתך בבטן אורך קו האמצע אחת נמוך יותר, מהחיק לתהליך xyphoid.
    5. באמצעות מפשק קטן, פתח את קירות הבטן לחשוף את החלל.
    6. השימוש בצמר גפן סטרילי הטה החלת, בעדינות לחזור המעיים superiorly לבעלי החיים של שמאל ולכסות עם הגזה טבולה בתמיסת מלח. הזז את איברי הרבייה inferiorly ולאתר את אב העורקים infrarenal וIVC. להרטיב את הרקמות החשופות מעת לעת עם תמיסת מלח.
    7. הפרד את אב העורקים מIVC, מהרמה של עורק הכליה השמאלי להסתעפות. במידת צורך, להשתמש 10-0 תפרי monofilament פוליאמיד ולקשור את הענפים הקטנים ליד אב העורקים.
    8. מהדק צלב (פרוקסימלי ודיסטלי למגזר של ריבית) אב העורקים, כ 5 גזרי מ"מ, עם שני 4 מ"מ מהדק כלי דם.
    9. שימוש microscissors Vannas-טובינגן, לעשות aortotomy אופקי אחת ולכרות קטע קטן (לא יותר מ 0.5 מ"מ) של אב העורקים בבטן כדי להתאים את שתל אב העורקים התורם.
    10. לשטוף את אב העורקים נכרת עם heparinized (100 U / ml) תמיסת מלח. שתל אב העורקים התורם צריך להיות באורך המתאים כדי להתחבר קצות אב העורקים transected של הנמען.
    11. מניחים את שתל אב העורקים התורם בעמדת orthotopic וanastomose סוף השתל של התורם לסוף של הנמען, את הכיוון אנטומיים השתל המתאים לזה של נמען התאמה.
    12. בעדינות לתפוס פנימית וחיצוני Tunica של כלי השיט ואוורט אותו מעט באמצעות המלקחיים No.5 הרפואיים. שימוש במלקחיים, לנהוג המחט מחוברת לתפר monofilament 10-0 פוליאמיד דרך העובי המלא של קיר הכלי כדי להבטיח את שתל אב העורקים תורם לכלי resected של הנמען. תשמור על מנת להבטיח כי פתיחת הכלי לא סגורה לא בשלo תפרים מכוונים של הקיר האחורי של הספינה.
    13. לתפרים רציפים, למקם את תפרי שהות בשעה 9 בשני הקצוות העליונים ותחתונים של השתל. החל בקצה העליון של השתל מ03:00, anastomose קצות כריתה עם 2 תפרי ריצה ולהבטיח את התפר לתפר השהייה.
      1. הפוך את השתל מעל ולהמשיך תפר הריצה להגבה חלק מכלי השיט, עמידה בתפר שהות מוצא. Secure ללא הפעלת לחץ רב על הספינה. חזור על התפירה להשקה נמוכה יותר.
        הערה: תפרי קטע מתחילים באותה צורה כמו התפר הרציף עם היוצא מן הכלל שהכלי הוא anastomosed עם שלושה תפרים מופרדים בין תפרי השהייה. זמן השקה הוא בדרך כלל 20 דקות.
    14. ברגע ההשקה היא מלאה, לשחרר את מהדק כלי דם דיסטלי כדי לאפשר דם מדרדר לזרום ולבדוק דליפה של אתרי anastomosed. אם יש דליפה, immediately מקום תפר לסגור את האתר הפגום. אם אין דימום באתרים, ולאחר מכן שחרר את המהדק הפרוקסימלי.
    15. בדוק את ההשתלה ולבדוק שאין חסימת דם בשתל, והפרוקסימלי וחלק הדיסטלי של הכלי של הנמען. דפוס דופק נמרץ בכלי של שני התורם והמקבל של אינדיקציה ראשונית שהדם זורם בחופשיות. שימוש בזוג מלקחיים, בעדינות לתפוס קצה אחד של תפרי שהייה ומעט אוורט הכלי לבדוק את הקיר האחורי של הספינה.
      הערה: לא צריך להיות שום כיווץ של כלי הקיר בשני הקצוות של אתרי anastomosed. זרימת דם לקויה לאחר הסרת מהדק היא סימן של פקקת.
    16. באמצעות החלת כותנה הטתה, להחזיר את המעיים לתוך חלל הבטן.
    17. עם בעל מחט Castroviejo ומלקחיים גרפה, לסגור את דופן הבטן עם 5-0 תפרי פוליפרופילן באמצעות תפרים רציפים. סגור את שכבת העור עם אותותפרים באמצעות סגירת subcuticular.
    18. לנהל Torbugesic im (1 מ"ג / קילוגרם) מייד עם סיום ההשתלה.
    19. תן מייד, בצו, Atipamezole (1 מ"ג / קילוגרם), ketoprofen (5 מ"ג / קילוגרם) וחימם תת עורי הפתרון של Lactated רינגר.
    20. מייד לאחר ניתוח, מקום עכברים בכלוב מחומם מתחת לשמיכת מים למשך הלילה (12 שעות). במהלך תקופת הרדמה-ההתאוששות, למקם את החיות לבד באזור נקי, יבש בלא הפרעה. קו הכלוב (autoclaved) עם מגבות נייר נקיות ולהתאים את הטמפרטורה של המים לשמיכה כ 20-22 מעלות צלזיוס. לספק kibbles היבש ורטוב כרצונך על רצפת הכלוב.
      הערה: מרכיב חשוב בטיפול לאחר ניתוח הוא ההתבוננות בבעלי החיים וההתערבות מתאימה, כנדרש, במהלך התאוששות מן ההרדמה וניתוח. עוצמת הצורך של ניטור תשתנה עם בעלי החיים והוא עשוי להיות גדול יותר בתקופת התאוששות ההרדמה המיידית כשיתוףmpared להמשך התאוששות לאחר ניתוח.
    21. הרף לפקח בעלי חיים שיש הרדמה עברה במעקב עד שהם להתאושש לחלוטין. בעלי החיים חייבים להיות מסוגלים לשמור על כיבית sternal ללא עזרה וזה חייב להיראות רגוע וחופשי מכאב לפני שניתן יהיה השאירו אותו ללא השגחה.
    22. תן עצירות (0.1 מ"ג / קילוגרם BID) וketoprofen (5 מ"ג / קילוגרם SID) לתקופה של שלושה ימים, שני תת עורי.
    23. לפקח לב וכלי דם ותפקוד נשימה, טמפרטורת גוף, וכאב שלאחר ניתוח או אי נוחות במהלך התאוששות מהרדמה למינימום של שלושה ימים. ייתכן שיידרש טיפול נוסף, כגון ניהול של משככי כאבים ותרופות אחרות, ונוזלי parenteral כדי להקטין את איבוד התייבשות ואלקטרוליטים.
    24. להעריך את ההצלחה של הניתוח להשתלה על ידי התבוננות בתפקוד המוטורי של הגפיים האחורי. הצלחה מלאה של ההשתלה כרוכה בזרימת דם בלא הפרעה לגפיים האחוריות וזנב, שאמורה להיות מיידי על התאוששות של עניםאל, והחלמה מלאה ללא שיתוק של הגפיים האחוריות ביום השני

אוסף 3. רקמות

הערה: נקודות קצה שנקבעו מראש נעות 3-60 ימים בהתאם לסוג של הניתוח הרצוי והטבע של חוסר התאמת אנטיגן. בדרך כלל, עיבוי intimal הוא חזק ביום 30 לאחר השתלה על פני זני עכבר תואם מלאים MHC.

  1. להרדים את העכבר עם זריקות intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם; 10 מ"ג / מיליליטר) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם; 1 מ"ג / מיליליטר). להעריך את עומק ההרדמה על ידי צובט את החלק השומני של כרית כף רגל בעלי החיים. להמשיך בניתוח כאשר בעלי החיים אינו תערוכה רפלקס נסיגה.
  2. נקה את האתר כירורגית עם מים וכלה באלכוהול 70%.
  3. מניחים את החיה במצב שכיבה על מגש מרופד במשטח סופג.
  4. פתח את חלל הבטן עם חתך אורכי קו האמצע גדול. הנח מפשק שמירה עצמית לחשוף את החלל, IVCד אב העורקים בבטן.
  5. בעדינות להפריד את קטע אב העורקים תורם הושתל מIVC השכן באמצעות זוג מס '5 מלקחיים רפואיים. להיות זהיר במיוחד לא להתפשט adventitia של כלי השיט המושתל.
  6. לחשוף את חלל בית החזה על ידי חיתוך דרך הצלעות לאורך שני צידי עמוד השדרה החזי כל הדרך לכניסת בית החזה. משקף את קיר החזה הקדמי superiorly לחשוף את קרום הלב ולאבטח את בית החזה עם זוג hemostat.
  7. ברגע שהלב חשוף, להכניס מחט 25 G 5/8 (מצורפת מזרק) לתוך החדר השמאלי ולשטוף עם 0.1 מיליליטר של תמיסת מלח heparinized (100 U / ml).
  8. שימוש במספריים, להסיר את העלייה הימנית כדי לאפשר לדם, מלוח heparinized, ומקבע לעזוב את הגוף במהלך זלוף. Perfuse את החיה עם 5 מיליליטר של paraformaldehyde 4% או עד ריצות הנוזל צלולים. הסר את הלב על מנת להבטיח המתת חסד.
  9. בלו מושתל מגזר כלי ולטבול בסעיף 4%פורמלדהיד לא יותר משעה. הגדר את הכלי המושתל באוקטובר (טמפרטורה אופטימלית חיתוך) מטריצה ​​ובזק הקפאה. סעיף הכלי תחת cryostat נקבע על 8 עובי אום. סעיפי כתם עם Haematoxylin & Eosin ו / או Verhoeff-אן Gieson (אן Gieson) כתם אלסטי.

4. ניתוח מורפולוגי של תל

הערה: ת"א מאופיינת בעיבוי intimal 13. במודל זה, עיבוי intimal והפחתת תוצאה בגודל של לומן הם שיקוף של חומרת פגיעה בכלי הדם בתיווך חיסונית. בקרות Syngraft משמשות כדי לקבוע את המאפיינים הבסיסיים של כלי שיט בהעדר תגובה חיסונית אלוגנאית. בקרות אלה גם מאפשרות הערכה של נזק עורקים המתרחש כתוצאה מההליך כירורגי. לא צריך להיות שום עיבוי intimal בsyngrafts.

  1. כדי לבחון עיבוי intimal וחסימת luminal, למדוד את השטח בתוך התא אנדותלשכבה, lamina הפנימי אלסטי (IEL) וlamina החיצוני אלסטי (צלופח) במגזרי עורק מוכתם אלסטי ואן Gieson עם תוכנת ניתוח תמונה. הפרמטרים להלן יכולים לשמש כדי לקבוע שינויי עורקים רעיוני של ת"א.
    1. למדוד את שטח intimal המוחלט: אזור בתוך lamina האלסטיות הפנימי - האזור בתוך שכבת תאי האנדותל. זה מספק מדידה מוחלטת של התרחבות intimal, המהווה את סימן ההיכר של ת"א.
    2. למדוד את השטח המוחלט המדיאלי: אזור בתוך lamina האלסטיות החיצוני - אזור בתוך lamina האלסטיות הפנימי. זה מספק מדידה מוחלטת של השפלה המדיאלי או צמיחה, שלעתים יכול להתרחש כתוצאה משינויים בתיווך חיסוני לאזור זה של קיר הכלי.
    3. למדוד את השטח הכולל כלי כמו האזור בתוך lamina האלסטיות החיצוני. זה מספק מדידה של שיפוץ כלי שיט הכוללת התרחבות או התכווצות של עורק כתוצאה מניזק חיסוני.
    4. מדד/ (אזור בתוך lamina האלסטיות החיצוני - אזור בתוך lamina האלסטיות הפנימי) - (אזור בתוך שכבת תאי האנדותל אזור בתוך lamina האלסטיות הפנימי): אינטימה / מדיה. זה מספק מדד יחסי של הרחבת intimal ומנרמל להבדלים בגודל כלי.
    5. מדוד את צמצום Luminal%: [(אזור בתוך lamina האלסטיות הפנימי - אזור בתוך שכבת תאי האנדותל) / אזור עם lamina האלסטיות הפנימי)] * 100. זה מספק מדד של היקף חסימת luminal, הנובע משילוב של הרחבת intimal ושיפוץ (פנימה או החוצה) של קיר הכלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במודל זה, אב העורקים בבטן מעכבר BALB / cYJ הוא התערב לאב עורקי infrarenal של נמען C57Bl / 6. זה מאפשר הערכה מקיפה של alloimmune תגובות כי יעד עורקי שתל. פציעה של כלי דם בתיווך חיסוני במודל זה יוזמת תגובות מתקן כלי דם שמגיעות לשיא בעיבוי intimal, צמצום luminal וגיוס של תאים חיסוניים (איורים 1 ו -2). אז קריטריונים אלו משמשים כקריאה החוצה לחומרת alloimmune תגובות, דחייה של כלי דם, ות"א. הצלחה של ההליך ניתן להעריך על ידי הפיתוח של עיבוי intimal ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש לנו תיארנו פרוטוקול לחציצת אב העורקים השתלה בעכברים שהם שימושי ללימוד דחייה של כלי דם בתיווך חיסוני ות"א. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את הסיבות לת"א, כמו גם את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות. זה כבר נעשה שימוש בעבר להקים תפקיד חיוני של חסינות אדפטיבית, תגובות תא T ציטוטוקסי, תגובות מפעיל תאי CD4 T בתיווך ציטוקינים, ונזק שתל בתיווך נוגדנים בת"א 14,17-21. השתלת עורק בעכברים קשה בשל הגודל הקטן הברור של בעלי החיים; עם זאת, עם תרגול ובדיקה נאות, יכולי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הקנדי לבריאות מחקר ולב ושבץ קרן של BC ויוקון (JCC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
C57BL/6J (H-2b)מעבדות ג'קסון, בר הרבור MEStrain# 000664
Balb/cBYJJackson Laboratories, בר הרבור MEStrain# 001026
הזרקת קטמין הידרוכלוריד USP 100 מ"ג/מ"לKetaleanDIN 00612316
הזרקת קסילזין 20 מ"ג/מ"לRompumDIN 02169592
הזרקת קטופרופן 100 מ"ג/מ"לאנאפןDIN 01938126
בורטורפנול טרטרט  הזרקה 10 מ"ג/מ"לTorbugesicDIN 008450000
הזרקת בופרנורפין 0.3 מ"ג/מ"לרקיטבנקיזר B.N. 5241
תמיסה סטרילית להזרקה אנטיפמזול הידרוכלורידAntisedanDIN 02237744
Heparin הזרקת נתרן, USP, 1,000 יחידות/מ"לMcKesson Distribution DIN02264315
Tears טבעי משחת עינייםAlconDIN 02082519
סטריאומיקרוסקופLeicaM80
0.9% נתרן כלורי, סטריליBaxter Corporation
Lactated Ringer' s Solution, סטריליתBaxter Corporation
0.9% הזרקת נתרן כלורי, סטרילית, 10 מ"לBaxter Corporation
לוריס
פובידון יודבטדין
כלורוהקסדין גלוקונאט 4% w/vGermi-Stat
שחור פוליאמיד מונופילמנטAROSurgical מכשיריםT4A10Q07
תפרים, תפר 10-0, תפר מונופילמנט כחול 70 מיקרון5-0
, מחט P3Ethicon8698G
1 מ"ל מזרקBDREF 309659
10 מ"ל מזרקBDREF 309604
מזרק אינסולין 1 סמ"ק TB עם 28 גרם 1/2BDREF 309309
25 גרם 7/8, מחט היפודרמיתBDREF 305124
27 גרם 1/2, מחט היפודרמיתBDREF 305109
מפסק קוליברי- 1.5 ס"מ מפוזר 4 ס"מFine Science Tools17000-04
S& T CAF-4 קליפ מריחת מלקחיים, ללא נעילהFine Science Tools00072-14
מלקחיים Supergrip, S& TFine Science Tools00632-11
מלקחיים רפואיים מס' 5כלי מדע עדינים11253-20
מספריים לתינוקות של Lexerכלי מדע עדינים14078-10
מלקחיים מיקרו אדסון משונניםכלי מדע עדינים11018-12
Vannas-Tubingen מיקרו-מספרייםמדע עדינים15003-08
מהדקי מיקרו, b-1; 3.5 מ"מ x 1 מ"מ; אורך 7 מ"מFine Science Tools00396-01
מלקחיים של Graefe, 10 ס"מ 1x2 שינייםFine Science Tools11054-10
Castroviejo עם מנעול ולסתות טונגסטןFine Science Tools12565-14
מעקר חרוזי זכוכית חמהInotech 250IS-250 - Steri-250
גזה לא ארוגיםProgene
Cotton Tippped אפליקטוריםפוריטני
Wahl
כרית חימוםSunbeam
רפידות הכנה לאלכוהול של כלי גוזם זקן

מקורות

  1. Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
  2. Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
  3. Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
  4. Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
  5. Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
  6. Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
  7. Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
  8. Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
  9. Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
  10. Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
  11. Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
  12. Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
  13. Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
  14. Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
  15. Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
  16. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
  17. Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
  18. Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
  19. Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
  20. Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
  21. Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
  22. Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
  23. Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
  24. Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
  25. Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Aortic InterpositionTransplant

מאמרים קשורים