הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

12.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52803

⸱

25 ביוני 2015

 ,  ,  , 
1Laboratory of Emerging Viruses, Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology

במאמר זה

סיכום

יש חוסר ידע כללי על אופן פעולת החיסונים. כאן אנו מציעים שימוש משולב בגנטיקה הפוכה ועכברים כימריים של מח עצם כדי לקבל תובנה לגבי התגובות החיסוניות המוקדמות של המארח לחיסונים עם דגש מיוחד על תאים דנדריטיים וחסינות תאי T.

תקציר

חיסונים הם אחד ההישגים הגדולים ביותר של האנושות, והצילו את חייהם של מיליוני אנשים במאה האחרונה. באופן פרדוקסלי, מעט ידוע על המנגנונים הפיזיולוגיים המתווכים תגובות חיסוניות לחיסונים, אולי בשל ההצלחה הכוללת של החיסון, שהפחית את העניין במנגנונים המולקולריים והפיזיולוגיים של חסינות החיסונים. עם זאת, מספר פתוגנים אנושיים חשובים, כולל נגיף השפעת, עדיין מהווים אתגר לחיסון, ועשויים להפיק תועלת מאסטרטגיות מבוססות חיסון.

למרות שגנטיקה הפוכה של שפעת יושמה בהצלחה ליצירת חיסוני שפעת חיים מוחלשים (LAIVs), הוספת כלים מולקולריים בתכשירי חיסון כגון רכיבי מעקב למעקב אחר הקינטיקה של חיסון in vivo, לא טופלה. בנוסף, הדור האחרון של מודלים עכבריים המאפשרים דלדול ספציפי של לויקוציטים במהלך מחקרים קינטיים פתח חלון הזדמנויות להבין את המנגנונים החיסוניים הבסיסיים העומדים בבסיס ההגנה הנגרמת על ידי חיסון. כאן, אנו מתארים כיצד השילוב של גנטיקה הפוכה ומודלים של עכברים כימריים עשוי לסייע לספק תובנות חדשות לגבי האופן שבו חיסונים פועלים ברמות פיזיולוגיות ומולקולריות, תוך שימוש כדוגמה בחיסון שפעת רקומביננטי, מותאם לקור ומוחלש חי (LAIV). השתמשנו ב-LAIVs שנוצרו במעבדה המכילים עוקבי תאים כמו גם כימרות מח עצם תחרותיות (BMCs) כדי לקבוע את הקינטיקה המוקדמת של חסינות החיסון ואת המנגנונים הפיזיולוגיים העיקריים האחראים להתחלת חסינות אדפטיבית ספציפית לחיסון. בנוסף, אנו מראים כיצד טכניקה זו עשויה להקל על מחקרי תפקוד גנים בבעלי חיים בודדים במהלך תגובות חיסוניות לחיסונים. אנו מציעים שניתן ליישם טכניקה זו כדי לשפר את האסטרטגיות המניעתיות הנוכחיות נגד פתוגנים שעבורם יש צורך באמצעי נגד רפואיים דחופים, למשל שפעת, HIV, פלסמודיום ונגיפי קדחת דימומית כגון נגיף האבולה.

מבוא

הדור של זיכרון חיסוני בהעדר המחלה הוא הבסיס הפיזיולוגי של חיסון יעיל 1. לאחרונה, מערכות גישות מבוססות ביולוגיה חשפו כי חיסונים מוצלחים כגון חיסון הקדחת הצהוב, לגרום לאינדוקציה חזקה של תגובות חיסוניות מולדים והפעלה של מספר תת קבוצות של תאים דנדריטים (DCS), אשר בתורו, להוביל לmultilineage הפעלה של אנטיגן תאי T ספציפיים 2,3. מאז DCs הוא אוכלוסיית תאים חיסונית רק עם היכולת להפעיל תאי T הנאיביים אנטיגן ספציפי 4, חקר תפקודם במהלך החיסון הוא קריטי להבנת תגובות חיסוניות לחיסונים ולעצב אסטרטגיות עתידיות נגד פתוגנים מאתגרים.

מערכת מאפשרת מעקב של תת DCs שונה במהלך תגובה חיסונית לחיסונים תהיה רצויה כדי להקים קינטיקה מדויקת של הגירת DC לרקמות הלימפה, ולכן כדי לספקתובנה המנגנונים הפיסיולוגיים אחראים על הייזום של חסינות אדפטיבית חיסון ספציפי. הפוך גנטיקה מבוססת גישות מציעות האפשרות ליצירת שינוי, חיסונים-מוחלש חיים, שניתן להשתמש בניסוי עם מטרה זו. מאז יישומה על מחקר שפעת, גנטיקה הפוכה מבוסס פלסמיד הועסקה נרחבת כדי ליצור זני שפעת רקומביננטי כולל LAIVs. פרוטוקולים סטנדרטיים להצלת נגיפי שפעת רקומביננטי דורשים רב-transfection של קווי transfectable מאוד תא עם פלסמידים ambisense (הפקת שני RNA תחושה חיובי והשלילי) המכילים את הקטעים נגיפיים שפעת שמונה, כמו גם הגברה במערכת מתירנית כגון כליות כלבי מדין-דארבי ( תאי MDCK) ו / או ביצי תרנגולת embryonated 5. עם זאת, היישום של גנטיקה הפוכה כדי ליצור כלים מולקולריים כדי ללמוד את מנגנוני החיסון של חיסון נשאר נחקר.

הדורמודלים עכבר חדשים המאפשרים דלדול ספציפי של תת תא חיסון, כולל DCS, פתח אפשרויות חדשות כדי להבין את מנגנוני חיסון הבסיסיים שבבסיס הגנה-שהושרו חיסון. ההשוואה בין פונקציות משנה DC בעכברים ובבני האדם גילתה כי, במידה רבה, עכבר וDCs האנושי הם פונקציונלי הומולוגי 6,7, ממצאים אלה, ממליץ בחום שפיתוח המודלים עכבר מאפשר דלדול ספציפי של DCs במצב היציב ובמהלך המצבים דלקתיים, יכול לשמש כדי להבין את הפיסיולוגיה של תגובות DC בבני אדם. בשנים האחרונות מספר המודלים עכבר כבר נוצר נושא transgenes מבטא את הקולטן רעלן דיפתריה הקופי (DT) (DTR) תחת שליטתו של אזור האמרגן של גן של 8,9 עניין. מאז רקמות עכבר לא באופן טבעי להביע DTR, מודלים אלה מאפשרים דלדול מותנה של תת תא נושא את הגן הממוקד של עניין על חיסון עכבר עם DT. לפיכך, abili שלנוטאי לרוקן DCs הספציפי ולויקוציטים האחר in vivo בתהליכים פיסיולוגיים, שופר באופן משמעותי על ידי הפיתוח של ro מבוסס DTR. עם זאת, בעוד שדגמי העכבר מהונדסים אלה היו בשימוש נרחב כדי להבין את ontogeny של מערכת החיסון, היישום שלהם לפיתוח חיסון נבדק בקושי. כאן, על ידי שילוב של גנטיקה הפוכה שפעת ומפלצות מח עצם תחרותיות מבוססות DTR, אנו מציעים שיטה ללמוד קינטיקה של חסינות חיסון, כמו גם תפקוד גן בודד במהלך תגובה חיסונית לחיסוני in vivo. היישום של טכנולוגיה זו להערכה פרה-קלינית של חיסונים חדשים כנגד מחלות זיהומיות מאתגרות יכול לעזור לתרץ עיצוב חיסון ולבחון מועמדי חיסון in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים נערכו על פי פרוטוקולים שאושרו ובהתאם להנחיותיו של חוק ההגנה על בעלי חיים הגרמני. כל צוות ביצוע ניסויים בבעלי החיים עבר הכשרות על פי הקטגוריה B או C של הפדרציה של איגודים אירופיים מדע בעלי חיים מעבדה.

1. דור של רקומביננטי חי מוחלש שפעת חיסונים על ידי היפוך גנטיקה

הערה: הפרוטוקול מפורט עבור הדור של נגיפי שפעת רקומביננטי על ידי גנטיקה הפוכה שתוארה על ידי מחקרים קודמים 5 ונמצאת מחוץ להיקף של דו"ח זה. בקצרה, הצלה של חיסונים מותאמים קרים שפעת (CAV) נעשה בממשלה בכיתה השנייה בטיחות ביולוגית ברמת בטיחות ביולוגית 2 בלימה (BSL2), וכרוכה בצעדים שיפורטו להלן. פרוטוקול transfection והזיהום נובע כי ב מרטינז-Sobrido et al. 5.

  1. צור שפעת מותאמת קרה reassortantחיסון באמצעות כרקע המתח / אן ארבור מותאם הקר / 6/60 (H2N2), כמו גם את hemagglutinin (HA) וneuraminidase שונה (NA) של יחסי הציבור / 8/34 הזן / (H1N1) ( איור 1 א). השינוי בגן NA מורכב של החלפת PCR מבוססת של רצף נשמר בגבעול החלבון (שאריות 65-72) על ידי רצף cDNA קצר קידוד ovalbumin עוף (OVA) פפטיד -derived SIINFEKL (איור 1). פפטיד SIINFEKL הוא פפטיד immunodominant רב בהקשר של מעמד MHC H-2B-מוגבל אני תגובה של עכברי C57BL / 6 12.
  2. צלחת 10 6 293T תאים לכל גם ב6-גם צלחות באמצעות סרום 10% DMEM שור עוברי (FBS) בתוספת 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / E).
  3. הכן תערובת transfection פלסמיד: הוסף 1 מיקרוגרם של כל אחד מפלסמידים קידוד cDNAs לPB2, PB1, הרשות הפלסטינית, NP, M, NS משפעת A / אן ארבור / 6 זן / 60 ו 1 מיקרוגרם של פלסמידים קידוד לNA -SIINFEKL וHA מ/ יחסי ציבור שפעת / 8/34. הוסף חימם מראש OptiMEM (15 μl עבור נפח סופי של 100 μl / טוב).
  4. דגירה תערובת transfection למשך 30 דקות ב RT.
  5. הוספת 100 μl של תערובת transfection / היטב דגירה במשך 16 שעות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  6. שינוי תקשורת סלולארי על ידי DMEM 0.3% BSA 1% P / E ב33 ° C ו 5% CO 2 למשך 5 שעות.
  7. להוסיף תאי MDCK מתירנית 10 6 שפעת בDMSO המכיל 1 מיקרוגרם / מיליליטר של טריפסין מלבלב שור שטופל בקיטון chloromethyl L-1-Tosylamide-2-phenylethyl (TPCK-טריפסין). לשמור על שיתוף תרבויות 293T-MDCK עבור 2 - 3 ימים ב 33 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  8. לאסוף supernatants של שיתוף תרביות תאי MDCK-293T וברור על ידי צנטריפוגה ב 260 XG במשך 5 דקות.
  9. לחסן 9 - ביצי embryonated עוף 10 יום-ישן בתנאים סטריליים. כדי לעשות זאת, לעשות חור בחלק העליון של קליפת הביצה כפי שצוין על ידי אח מרטינז-Sobrido אל. 5.
  10. מכסה את שנינות קליפת הביצהh נמס שעווה באמצעות מקלון צמר גפן ולדגור על ביצי העוף מחוסנת במשך 3 ימים ב 33 מעלות צלזיוס.
  11. לקצור את נוזל allantoic מהנגוע ביצי embryonated: לשטוף את קליפות ביצים עם אתנול 70%. פתח את הביצה עם הסדק מאוד בעדינות בחלק העליון ולהסיר את קרום allantoic באמצעות מלקחיים סטרילית. השתמש פיפטה 10 מיליליטר לאסוף כמה שיותר נוזלים ככל האפשר (בדרך כלל 6 - 10 מיליליטר). צנטריפוגה ב 260 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את נוזל allantoic פינה לצינורות חדשים.

חסינות 2. מעקב חיסון ספציפית

  1. איתור של תאים דנדריטים נושאות פפטיד (DCS)
    1. לחיסון עכבר, להרדים עכברים עם isoflurane 5% בחמצן באמצעות אידוי דיוק. השתמש פיפטה 200 μl לנהל 50 μl של PBS המכיל 10 יחידות 3 יוצרי פלאק (pfu) של החיסון המבטא את הפפטיד SIINFEKL באמצעות טיפות ישירות לנחירי העכבר.
    2. שלושה ימים לאחר חיסון-, euthanizעכברי דואר באמצעות ההרדמה isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם.
    3. הרם את עור העכבר על קו האמצע ממש מתחת לבית החזה עם מלקחיים ולחתוך חתך קטן דרך העור עם מספריים. מנקודת החתך, לעשות 3-5 סנטימטר לחתוך ארוך דרך העור לשני את הראש וזנב, אז שני חתכים 2 סנטימטר מקו האמצע רוחבי מכל קצה. לקלף את העור כדי לחשוף את חללי הצפק ובית חזה. בזהירות לחתוך דרך הקרומים המקיפים את הצפק לחשוף את בית החזה.
    4. כדי לגשת למדיאסטינום לחתוך diafragma והחלק התחתון של צלעות הכלוב. מצא ולהסיר 2 בלוטות לימפה mediastinal (mLNs), מעט גב ורוחבי בסמוך לבלוטת התימוס, מדיאלית סמוכה לעורק brachiocephalic, ליד הצד הגחוני של קנה הנשימה.
    5. למסוק mLNs להשתמש במלקחיים מעוקלים. מניחים מלקחיים מתחת לבלוטות הלימפה ולמשוך אותם בעדינות. הנח בלוטות לימפה בצלחת 6 היטב המכילה 1 מיליליטר של DMEM ולהסיר כל connectiיש או רקמת שומן המקיפה את הצומת.
      1. להקניט כל דגימה ביסודיות עם שתי 26 מחטי G מצורפים 1 מיליליטר מזרקים. להקניט את בלוטות לימפה, להחזיק אותו למטה עם מחט אחת תוך שבירה פתוחה הבלוטה לימפה עם המחט אחרת. כאשר זה נעשה בצורה נכונה, תאים מרוכזים מתפוצצים מהבלוטה לימפה הם נצפו בקלות בתקשורת. להעביר את כל חומר הרקמה דרך מסנן ניילון 70 מיקרומטר להשיג השעיות תא בודדות.
    6. השעיות צנטריפוגה תא בודדות במשך 10 דקות ב 260 XG בצנטריפוגה בקירור. Resuspend התא גלולה ב 2 מיליליטר של תאי דם אדומים lysing (RBCL) מאגר לlyse תאי דם אדומים. לאפשר תמוגה כדי להמשיך במשך 3 דקות ב RT.
    7. לנטרל חיץ RBCL באמצעות צנטריפוגה וresuspension תא 2 מיליליטר של PBS קר כקרח.
    8. תאי צלחת בצורת U 96-גם צלחות בריכוז של 10 7 תאים / מיליליטר בנפח סופי של 100 μl.
    9. לניתוח cytometry זרימה, FC-קולטני תא לחסום באמצעות1 מיקרוגרם של נוגדני CD16 / CD32-העכבר אנטי לכל 10 6 תאים במשך 15 דקות על קרח.
    10. צלחות ולהשליך צנטריפוגה supernatants ידי מצליף צלחת. דגירה בארות בודדות עם שילוב נוגדן פני השטח של בחירה. בדרך כלל לזיהוי של תאים דנדריטים בבלוטות הלימפה, קוקטייל הנוגדנים צריך לכלול: 0.25 מיקרוגרם של אנטי-CD11c, 0.25 מיקרוגרם של CD11b, 0.5 מיקרוגרם של כיתת MHC II, 0.25 מיקרוגרם של CD103 ו0.15 מיקרוגרם של CD8α בנפח סופי של 100 μl.
    11. לgating השלילי, להוסיף 0.25 מיקרוגרם של אנטי-CD3, CD19, NK1.1 או קוקטייל שושלת (איור 2 א). ניתן למצוא אסטרטגיות gating אלטרנטיביות כמו גם פרוטוקולים לפיצוי הולם של צבעי ניאון מרובים באתר האינטרנט של פרויקט הגנום החיסוני. בנוסף לסמנים של בחירת המשטח, להוסיף 1 מיקרוגרם של נוגדנים נגד H-2K ב חייב SIINFEKL לקוקטייל. נוגדן זמין מסחרי זה יאפשר להדמיה של DCs אניn שפפטיד SIINFEKL קשור אל פני השטח I. כיתת MHC
    12. דגירה תאים עם נוגדני משטח למשך 30 דקות על קרח. הגן על צלחת מהאור. צלחות צנטריפוגה ב 260 XG במשך 5 דקות ולשטוף עם 2 מיליליטר של PBS פעמיים. העברת תאי cytometry זרימת צינורות לניתוח.
  2. הערכה של התפשטות תאי T חיסון הספציפי
    1. להשיג תאי T תורם מעכברי TCR-מהונדסים זמינים מסחרי (OT-עכברים) (C57BL / 6-Tg (TCR aTcrb) 1100Mjb / י) שבו כל תאי CD8 T שנוצרו הם ספציפיים לפפטיד SIINFEKL. להרדים עכברים על ידי ההרדמה isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם. קציר טחול על ידי ביצוע חתך בחלל הבטן. הנח טחול / s ב 2 מיליליטר של DMEM / טחול ולהסיר רקמת חיבור ושומן.
    2. צור השעיות תא בודדות מטחול בעקבות ההליך המתואר ב2.1.2 ו2.1.3.
    3. כדי להעשיר את ההשעיה התא בודדת על תאי T נוסף, תחול פרוטוקולי הפרדת חרוז מגנטיאו באמצעות הליכי בחירה חיוביים או שליליים 12. להבדיל מתורם תאי נמען, להשתמש בעכברי congenic כך שלמשל עכברי נמען להביע CD45.1 סמן יקוציט תוך תאי T התורם להביע 12 CD45.2.
    4. לתייג תאי T, דגירתם ב 1 מיליליטר של PBS המכיל 5 מיקרומטר של succinimidyl אסתר carboxyfluorescein (CFSE) בצפיפות תאים אופטימלית של 5 x 10 6 תאים / מיליליטר. דגירה תאים במשך 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס מוגנות מהחשיפה לאור. לאחר דגירה, תאי צנטריפוגות ב 260 XG ל5 דקות, supernatant פסולת, ותאי resuspend ב 3 מיליליטר בסרום שור עוברי (FBS) כדי לנטרל CFSE.
    5. תאי צנטריפוגה ב 260 XG במהלך 10 דקות וגלולות בנפח מספק של PBS, כך שפתרון של 100 μl מכיל 2 x 10 6 תאים. להשרות עכברי congenic נמען עם 2 x 10 6 תאים / עכבר באמצעות הזרקת סינוס רטרו מסלולית 13.
    6. להרדים עכברי נמען ב -3 ימים, 4 ו -5 שלאחרחיסון באמצעות הרדמה isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם. קציר בלוטות לימפה mediastinal ולהכין השעיות תא בודדות לcytometry זרימה כפי שצוין ב2.1.2-2.1.5.
    7. לזהות תאי תורם על ידי צביעת השעיות תא בודדות מקוקטייל נוגדנים המכיל 100 μl: 0.25 מיקרוגרם של אנטי עכבר CD3, CD4 ו CD8 נוגדנים; 0.5 מיקרוגרם של אנטי עכבר CD45.1 או נוגדן CD45.2 (תלוי בהפנוטיפ של תאי תורם). השאר את ערוץ FL-1 של cytometer הזרימה הפתוח (FITC) כדי לקבוע את פרופיל הדילול של CFSE 12 (איור 2).

3. עכברים כימרי לנתח תגובות חיסון גן ספציפי

הערה: הדור של מפלצות מח עצם תחרותיות באמצעות מודלים עכבר מבוסס DTR מאפשרת האפליה של פונקציות תא ספציפי בתגובה חיסונית לחיסונים. כאן אנו מראים אסטרטגיה נוספת שבו שילוב של DTR-להביע תורם גאמות עם תאים מעכברי היתרי נוקאאוט ללמוד פונקציות ספציפיות גנים במהלך חסינות בתאי תא ספציפיים. בדוגמא שאנחנו מייצרים עכברים עם מחיקה ספציפית של קולט חיוג כמו 3 (TLR3) בLangerin + CD103 + DCs.

  1. הכנת תאי תורם מח העצם
    1. לעבוד תחת ממשלת רמת בטיחות ביולוגית השנייה. למנוע זיהום על ידי שימוש במכשירי autoclaved באופן בלעדי.
    2. כדי ליצור עכברי chimeric מח עצם, להשתמש CD45.1 congenic + C57BL / 6 נקבות עכברים כמקבלים, ולהשתמש TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP, או עכברי WT להביע CD45.2 + כתורמים. שימוש בעכברי תורם והמקבל congenic מאפשר ההתמיינות של תאי תורם והמקבל באמצעות cytometry זרימה וזה מאפשר קליטתם כדי להיות מוערכת.
    3. להשיג תאי מח עצם תורם, להרדים עכברי תורם עם ההרדמה isoflurane ואחריו נקע בצוואר הרחם. עם מספריים חדים לבצע חתכים סביב הקרסוליים כך שמ 'שרירי שבית חשופים.
    4. מלקחיים בוטים באמצעות למשוך עור ופרווה עכבר בעדינות מהקרסול לכיוון הירכיים כך ששרירי הרגליים גלויים.
    5. עם מספריים חדים לחתוך את הרגליים עכבר בגובה של הירכיים ומעל לראש של עצם הירך.
    6. הנח את הרגליים על צלחת פטרי ועל קרח. לעבוד מהר ולהסיר את כל השרירים כדי לחשוף את העצמות.
    7. עצמות ירך נפרדות וtibiae. מניחים את עצמות בפתרון של 70% אתנול למשך 5 דקות כדי להסיר חיידקים אפשריים ולמקם אותם באופן מיידי על עוד צלחת פטרי המכילה 5 מיליליטר של סרום ללא DMEM. עצם לחתוך מסתיים באמצעות מספריים חדים ולשטוף את מוח העצם לDMEM. כדי לעשות זאת, 1 מיליליטר הסומק של DMEM לתוך העצם על ידי החדרת מחט 26 G מצורפת מזרק 5 מיליליטר. ודא העצמות נראו לבנות (ריק) לאחר שטיפה.
    8. לאסוף את כל תאי מח עצם מעכברי תורם ב 10 מיליליטר של DMEM. צור השעיות תא בודדות מתאי מח עצם על ידי העברת הקציר דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
    9. Clמתלי אוזן תא בודדים של תאי מח עצם על ידי צנטריפוגה ב 260 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה בקירור. גלולה תא הגלול ב 10 מיליליטר של PBS. רוקן תאי דם אדומים באמצעות פתרון RBCL כפי שמתואר ב2.1.3 ו2.1.4.
    10. ספירת תאי מח עצם או באמצעות hemocytometer או דלפק תא אוטומטי. להעריך את כדאיויות תא על ידי קביעת תאים מתים באמצעות צביעת trypan הכחולה 13. בצורה אופטימלית, תשואות חיה אחת סביב 3 x 10 7 תאי דם לבנים / עכבר עם יכולת קיום של לפחות 80%.
    11. במקרה של כוללת מפלצות מח עצם, להכין TLR-3 - תאים או תורם WT - /. ריכוז התא האופטימלי הוא 2 x 10 7 תאים / מיליליטר מאז 2 x 10 6 תאים בשל PBS 100 μl ישמשו להשתלה. אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, לשמר תאי תורם ב -80 ° C תוך שימוש בטכניקות הקפאה איטיות וFBS עם 10% DMSO. למודל chimeric המעורב, לערבב תאים וLangerin-DTR-תורם TLR3 - / - תאי תורם ביחס 75:25. להכין תערובת של 75: 25 Langerin-DTR: WT תאי מח העצם לייצר עכברי שליטה.
  2. הקרנת עכבר והשתלה
    1. מכשיר את נקבות עכברים בין 6-8 שבועות של גיל בirradiator מקור צסיום -137. תן עכברים שתי מנות של 550 שעות לגזרים rad 4. הקרנת פיצול ממזערת רעילות בכבד חריפה ולכן מקטינה קטלני עכבר בשל פרוטוקול ההקרנה.
    2. לאחר הקרנה, לשמור על עכברים תחת טיפול באנטיביוטיקה במשך שבועיים. תן אנטיביוטיקה עם מי שתייה ב2.5-5 מ"ג של Baytril / קילוגרם.
    3. 2 - 4 שעות לאחר ההקרנה השנייה, עכברי השתלת תאי מח עצם תורם לוריד. לבצע ההזרקה של תאי תורם באמצעות הזרקת סינוס רטרו מסלולית 13 ותחת ההרדמה isoflurane באמצעות נפח מרבי של 100 של PBS μl המכיל 2 x 10 6 תאים.
    4. ארבעה שבועות לאחר ההשתלה, להעריך engraftment במדגם של 100μl של דם היקפי באמצעות cytometry זרימה באמצעות מכונה מסוגלת לקרוא לפחות שני צבעים. להבחין בין התורם ומקבל תאי רדיו עמיד, להשתמש CD45.1 ונוגדנים אנטי עכבר CD45.2 באמצעות דילולים בין 1/100 ו1/200 שכותרתו fluorescently הזמינות מסחרי. engraftment האופטימלית של תאי תורם צריכה להיות לפחות 80% מתאי hematopoietic הכולל בדם היקפי.
  3. דלדול חיסון וממוקד
    1. לחסן עכברים עם חיסון שפעת מוחלש חי רקומביננטי באמצעות intranasal. לחיסון עכבר, להרדים עכברים עם isoflurane 5% בחמצן באמצעות אידוי דיוק. השתמש פיפטה 200 μl לנהל 50 μl של PBS המכיל 10 יחידות 3 יוצרי פלאק (pfu) של החיסון.
    2. על מנת ליצור את מודל העכבר הסופי, טיפול בעכברים עם 50 ng של DT המדולל ב -50 μl של PBS intranasally. לנהל DT טיפה אחר טיפה ישירות לנחיריים של עכברים מורדמים, כמתואר ב3.3.1. מיל פינוקCe עם מינון יומי התחלת טיפול ביום -2 לפני החיסון עד יום 2 לאחר חיסון (איור 3).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דור של חיסונים לשפעת חיים-מוחלשים רקומביננטי יכול להיות מושגת על ידי transfection של פלסמידים קידוד שמונה המקטעים של נגיף שפעת בשליטת יזמים דו-כיוונית 5. חיסון נגד שפעת מותאמת קר בדרך כלל מכיל שישה מקטעים של זן מותאם קר, כמו גם את HA ו NA של זן השפעת של בחירה (למשל, H1N1) (איור 1 א). העיקרון קר-ההסתגלות מבוסס על שכפול וירוס מוגבל ב 33 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה של דרכי נשימה העליונה (אגד) בעכברים ובבני אדם 14. לכן, החיסון יכול לשכפל באג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה אנו מתארים כיצד הפוכים גנטיקה ומודלים של עכברים chimeric יכול להיות מנוצלים כדי להבהיר את המנגנונים הפיזיולוגיים ומולקולריים של חסינות שנוצר עקב חיסון. גנטיקה הפוכה שפעת הוקמה במעבדות רבות ומלאה תפקיד ראשי בהבנת הפתוגנזה שפעת, שכפול והעברה 17. נקודת מפתח בפרוטוקול שלנו היא הצלה של חיסונים לשפעת מותאם קרים להביע epitopes הזרה. בעוד האסטרטגיה של החדרת cDNAs הקצר לגבעול של neuraminidase תוארה על ידי קבוצות רבות, החוקר צריך לוודא ששום מוטציות נוספות הציגו במהלך ייצ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לסרג'יו גומז-מדינה על התמיכה הטכנית המצוינת בניסויים בעכברים. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מאגודת לייבניץ ומרכז לייבניץ לזיהום. א.ל. הוא זוכה מלגת קדם-דוקטורט מבית הספר לתארים מתקדמים ע"ש לייבניץ.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דולבקו וחריף; s Modified Eagle Medium (DMEM 1x)Gibco RL-Life Technologies41965-039
OptiMEMGibco RL-Life Technologies31985-047
Lipofectamine 2000Invitrogen-Life Technologies11668-027
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/ml)PAAp11-010
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ'A2153
ביציות עובריותValo biomedia Gmbh
PBS (1x)Sigma-AldrichD8537
70 μ מסנני ניילון MGreiner-Biorad542-070
מאגר ליסינג של תאי דם אדומים (RBCL) 10xBD Bioscience555899
CD16/CD32 עכבר BD FC בלוק (2.4G2)BD Pharmigen553142
APC-Anti-Mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)Biolegend141605
PE-Anti-Mouse CD11c (HLA3)BD Biosciences553802
eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)eBioscience48-5321-82
Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)Biolegend101216-PerCp
/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)Biolegend
CD45.1 (A20)eBioscience12-0453-82
V500-Anti-Mouse CD45.2 (1O4)BD Bioscience562130
PerCp-eFluor710 -נגד עכבר CD8a (53-6.7)eBioscience46-0081-80
APC-Cy7-נגד עכבר CD3ε (145-2611)Biolegend100325
eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)eBioscience48-0041-80
CFSE Proliferation dyeeBioscience65-0850-85
Baytril 2.5%Bayer65-0850-85
דימטיל-סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Ovalbumin בדיקות מולקולריות O23020
דיפטריה טוקסין (DT)סיגמא-אולדריץ'D0564
טריפסין-TPCKסיגמא-אולדריץ'T1426
BD FACsCanto II ציטומטר זרימהBD Biosciences
FlowJo תוכנת ניתוח תאים 9.5Flowjo inc.
כתם כחול טריפן (0.4%) Life TechnologiesT10282
Countess מונה תאים אוטומטיInvitrogen-Life TechnologiesC10227
121416-PE-Anti-mouse

מקורות

  1. Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
  2. Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
  3. Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
  4. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  5. Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
  6. Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
  7. Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
  8. Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
  9. Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
  10. Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
  11. Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
  12. Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
  13. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
  14. Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
  15. Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

T CD8
Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.