מאמר שיטה

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

DOI:

10.3791/52823

⸱

14 במאי 2015

 , 
1Division of Cancer Research, College of Medicine, Dentistry and Nursing, University of Dundee

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את השיטה ליצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בשיטה חד-שכבתית נטולת סרום. ניתן להשתמש באבות אלה כדי לגזור סוגי תאים עצביים בוגרים או לחקור את תהליך המפרט העצבי והם ניתנים לקנה מידה של פורמט מרובה בארות עבור סינון מורכב.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת להבחין בתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) לאבות עצביים מאפשרת המחקר של מנגנוני שליטה מפרט עצבי, כמו גם את הדור של סוגי תאים עצביים בוגרים למחקר נוסף. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לבידול של ESC לאבות עצביים באמצעות, תרבות monolayer סרום ללא. השיטה היא מדרגי, יעילה וגורמת לייצור של תאים עצביים ~ 70% בתוך 4-6 ימים. זה יכול להיות מיושם על ESC מזנים שונים גדלו תחת מגוון רחב של תנאים. יכולים להיות מותר אבות עצביים להבחין נוספת לנוירונים וגליה או ניתח תפקודיים על ידי מיקרוסקופ, cytometry זרימה או מולקולרי טכניקות. תהליך ההתמיינות ניתנים למיקרוסקופיה זמן לשגות ויכול להיות משולב עם השימוש בקווי כתב כדי לפקח על תהליך המפרט העצבי. אנו מספקים הוראות מפורטות על הכנת תקשורת וצפיפות תאי אופטימיזציה כדי לאפשר את התהליך לbהדואר חל על רוב קווי ESC ומגוון כלי תרבית תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע עובריים הם תאי pluripotent נגזרו מהעובר המוקדם עם היכולת להתרבות ללא הגבלת זמן במבחנה תוך השמירה על היכולת להתמיין לכל סוגי התאים בוגרים הבאים השבה לעובר בשלב מתאים (על ידי יצירת חזיון תעתועים), הזרקה למארחי syngeneic או מדוכאי חיסון (על ידי יצירת תפלצת) או בנושא המבחנה 1 רמזים מתאימים. הבידול במבחנה של תאי גזע העובריים של עכבר לשושלות עצביות תואר לראשונה בשנת 1995 ומעורב ההיווצרות של אגרגטים השעיה תאיים (גופי embryoid, EBS) בתקשורת סרום המכיל תוספת החומצה רטינואית מורפוגן 2-4. מאז מגוון רחב של פרוטוקולים פותחו כדי לאפשר בידול עצבי 5. רב עדיין לנצל צבירה, אחרים תרבות משותפים עם גרימת סוגי תאים וכמה כרוכים בשימוש בסרום ללא מדיה. כל הפרוטוקולים יתרונותND חסרונות ואת האופי המדויק של עצבי או תאים עצביים המיוצרים גם משתנים בהתאם לפרוטוקול בשימוש.

הפרוטוקול האידיאלי יהיה חזק, ניתן להרחבה ולעשות שימוש באמצעי תקשורת ומצעים מוגדרים באופן מלא, להיות נוח לניטור לא פולשני של תהליך הבידול ולגרום לדור של אוכלוסיות טהורות של אבות עצביים יכול להיות בדוגמת ידי רמזים חיצוניים ולהבדיל לכל תת עצבי וגליה עם יעילות גבוהה ותשואה בזמן קצר יחסית. בעשרות השנים האחרונות שכבר משתמשים בשיטה ליצירת אבות עצביים ותאי עצב מהעכבר ESC בצפיפות נמוכה, תרבות monolayer חסיד סרום ללא 6-10. פרוטוקול זה ממלא רב של הקריטריונים המפורטים לעיל: בידיים שלנו את היעילות של בידול כבר די עקבית לאורך שנים רבות ומגוון של שורות תאים, וניתן לשנות אותו או למטה (אנו משתמשים בהצלחה כלי מ96-גם צלחות ל די קוטר 15 סנטימטריםshes) והתקשורת משמשת הם מוגדר היטב. התהליך ניתנים למיקרוסקופיה בהילוך איטי לניטור של הבידול ומגוון של רמזי דפוסים ניתן להוסיף כדי לגרום לדור של סוגים שונים של תת עצביים (למשל, ששש וFgf8 לנוירונים דופאמין 6).

עם זאת, יש כמה אתגרים ליישום המוצלח של פרוטוקול זה. אחד ההיבטים המרכזיים הוא הכנה קפדנית של התקשורת. אנחנו תמיד להכין את התקשורת בבית למרות זמינותן של חלופות מסחריות. יש שינויים על תקן גרסאות זמינות מסחרי, אחד התוספים המשמשים (ראה פרוטוקול N2). לבסוף, אחד הצעדים החשובים ביותר ליישום מוצלח של שיטה זו היא צפיפות התאים האופטימלית בציפוי. זה בעיקר בגלל זמן שטבע autocrine של אחד מאותות התרמה (Fgf4 11) דורש כי תאים מספיקים נוכחים כדי לאפשר viabil האופטימליity ובידול, בבידול צפיפויות גבוהות מדי הנו פגום (אולי בחלק בשל ייצור autocrine של 12 LIF). לכן חשוב שהכנת שתי התקשורת וציפוי תא מבוצעות בזהירות ובעקביות כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת מדיה

הערה: הפרוטוקול מסתמך על השימוש בשילוב של שני כלי התקשורת נפרד: DMEM / F12 בתוספת תוסף שונה N2 וNeurobasal השלים עם תוסף B27, בדרך כלל בביחס של 1: 1.

  1. הכן את תוספת N2 שונה על ידי ערבוב הרכיבים בשפופרת 15 מיליליטר. לא מערבולת או לסנן זה; מערבב על ידי היפוך הצינור עד הפתרון הוא ברור.
    1. התחל על ידי pipetting 7.2 מיליליטר של DMEM / F12, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של 25 מ"ג / מיליליטר אינסולין (המורכב ב0.01 M HCl) ומערבבים היטב על ידי צינור היפוך. זה לוקח כמה דקות עד שהפתרון הוא ברור.
    2. הוסף 1 מיליליטר של 100 מ"ג / מיליליטר apo-transferrin (מורכב במים), 33 μl של 0.6 מ"ג / מיליליטר progesternone (מורכב באתנול), של 160 מ"ג / מיליליטר (1 מ ') פוטרסין 100 μl (מורכב במים ), 10 μl של 3 מ"מ הסלניום נתרן (מורכבים במים) וμl 666 של 7.5% אלבומין בסרום שור ומערבבים היטב הצינור. Aliquot לתוך 2.5 מ"ל ולאחסן ב -20 °C עד 2 חודשים.
  2. הכן את התקשורת.
    1. 250 מיליליטר של DMEM / F12 להוסיף 2.5 מיליליטר של N2. מערבבים היטב, אבל לא ללחוץ או מסנן.
    2. 250 מיליליטר של Neurobasal תקשורת להוסיף 5 מיליליטר של תוסף B27. מערבבים היטב, אבל לא ללחוץ או מסנן.
    3. מערבבים את התקשורת מ1.2.1 צעדים ו1.2.2 ביחס של 1: 1. בחלק מהמקרים 1: ייתכן שתידרש 3 תערובת (בתוספת כ1: תערובת 1 בצעד 1.2.4).
    4. לתערובת להוסיף 0.5 מיליליטר של L-גלוטמין (ריכוז סופי 0.2 מ"מ) ושל 3.5 μl של 2-mercaptoethanol (ריכוז סופי 0.1 מ"מ) ומערבבים היטב בלי ללחוץ. אחסן את המדיה ב- C ° 4 עד 3 שבועות ולהימנע מחשיפה לאור. מיקס סופי זה נקרא N2B27.
  3. הכן את פתרון ג'לטין.
    1. הכן פתרון ג'לטין 1% במי ultrapure וחיטוי ב 121 ° C, 15 psi, במשך 15 דקות. חשוב שהבקבוק משמש לכך הוא נקי לחלוטין מחומרי ניקוי או חומרי חיטוי, ולכן מומלץ שבקבוק חדש הואמשמש לזה ואי זה רק לשטוף במי ultrapure בין שימושים. Aliquot פתרון 1% ל -50 aliquots מיליליטר ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
    2. לחמם aliquot של ג'לטין 1% באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה ולהוסיף 500 מיליליטר של תמיסת מלח חם שנאגרו פוספט (PBS). מערבבים היטב וpipet מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של כל טוב או צלחת. לאפשר את הג'לטין למעייל המשטח לפחות 30 דקות.

2. ציפוי התאים

הערה: פרוטוקול זה חל באופן שווה על ESC העכבר גדל בסרום% 10 עם גורם מעכב לוקמיה (LIF), החלפת סרום עם LIF או סרום ללא מדיה עם חלבון LIF והמוךפו"גנטי עצם 4 (BMP4) או מעכבי MEK וGSK3 (תקשורת 2i) עם או בלי LIF. עם זאת, העיתוי והיעילות של הבידול עשוי להשתנות בהתאם לתקשורת ותאים (ראה דיון). לניסויים המוצגים כאן השתמשנו בקו 46C עכבר ESC (שיש לו כתב EGFP דפק לone של אללים Sox1 אנדוגני), גדל בGMEM עם סרום 10% וLIF. לקבלת תוצאות אופטימליות חשוב שהתאים הם ניתקו וreplated בתקשורת N2B27; פשוט המשתנה של תקשורת מGMEM / סרום / LIF לN2B27 תמיד תוצאות ביעילות בידול מופחתת בהשוואה לreplating התאים.

  1. לגדול התאים בGMEM עם סרום 10%, פירובט נתרן 1 מ"מ, חומצות אמינו לא חיוניות 1x, 0.1 מ '2-mercaptoethanol, ו 100 יחידות / מיליליטר LIF 13. כדי לקבל תרבות subconfluent של העכבר ESC, צלחת 1 x 10 6 תאים לבקבוק תרבות T25 שייקח 2-3 ימים.
  2. שים לב תאים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. כאשר התאים subconfluent ומוכנים למעבר, לשטוף אותם פעמים PBS. הוסף 1 מיליליטר של מגיב תא דיסוציאציה ולחזור לחממה עבור 2-5 דקות. למרות טריפסין ואנזימים אחרים יכולים לשמש גם לתא דיסוציאציה, הם יכולים להיות השפעה שלילית על קובץ מצורף תא כך צפיפות הציפוי צריכה להיות adjusted.
  3. ברגע שהתאים מתחילים להרים מהצלחת, הקש על הכלי כדי לסלק אותם להשעית תא בודדת. לאסוף את התאים לסכום כולל של 10 מיליליטר של תקשורת ותא דיסוציאציה מגיב וpipet לתוך צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר.
  4. ספין התאים ב XG 300 דקות 3 ב RT.
  5. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מיליליטר של N2B27 מראש חימם על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-5 פעמים. כאשר pipetting ההשעיה למטה, pipet נגד הצד של הצינור, כדי למנוע יצירת בועות. ספירת התאים עם דלפק תא אוטומטי או haemocytometer ולהקליט את הריכוז.
  6. כן השעיה תא המכילה את המספר הרצוי של תאים ליחידת הנפח להיות מצופה בכל טוב בN2B27 מראש חימם. צפיפות של 10,500 תאים לכל 2 סנטימטר בצלחת 6 היטב (כלומר, 1 x 10 5 תאים לכל גם מנה 6 היטב) הוא אופטימלית. ראה טבלת 1 למספר הציע של תאים לכל 2 סנטימטר וPLAכרכי תקשורת טינג עבור מגוון רחב של כלי תרבית תאים.
  7. לשאוב ג'לטין מכלי התרבות וצלחת ההשעיה התא לפי הצפיפות הציעה ונפח בטבלה 1. אל מערבולת הצלחות כמו זה להתרכז התאים למרכז. מניחים את התרבויות בחממה לחה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  8. לשנות תקשורת כל 1-2 ימים על ידי החלפת כל התקשורת עם N2B27 הטרי. פיפטה בעדינות כמו שטיפת התאים עשויים להשפיע על צפיפות ולהפחית את יעילות בידול בימים הבאים. איפה כדאיות ראשונית לאחר הציפוי היא עניה, צלחת התאים ב1: 3 שילוב של תקשורת N2 ותוספת-B27 ולשנות את זה לN2B27 אחרי היומיים הראשונים. תאים יתחילו להבחין וצריכה להראות ביטוי Sox1 (גלוי על ידי הקרינה ירוקה של הכתב בקו 46C התא משמש כאן) בתוך 4-6 ימים.

3. Immunofluorescent מכתים

NOTE: הפרוטוקול יכול להיות מיושם על כל סוג כלי. הנפח של כל מגיב מתואר בכל טוב של 6-גם צלחת וניתן לשנותם לכל שטח פנים. Replating אינו מומלץ בשל הכדאיות הנמוכה לאחר מכן.

  1. הסר בינוני בידול ולתקן את התאים על ידי הוספת 500 μl של 4% (V / V) paraformaldehyde, להשאיר במשך 15 דקות.
  2. לשטוף וpermeabilize התאים עם 2 מיליליטר של PBS-T (שנאגרו מלוח פוספט עם 0.5% (V / V) tween-20) פעמיים. יכולים להיות כל הזמן בתאים PBS-T של עד 2 חודשים ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. החלף PBS-T עם 1 מיליליטר של PBS-T עם 10% (V / V) בסרום (מאותו המין כמו נוגדנים משני). דגירה שעה 1 בנדנדת הצלחת ב RT לחסום כל מחייב שאינו ספציפית.
  4. אחרי שעה 1, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מיליליטר של PBS-T, והדגירה בIgG עכבר 500 μl נגד βIII טובולין (בדילול 1: 1,000 ב PBS-T עם סרום 10%). לשים על הנדנדה הצלחת, ולהשאיר O / N ב 4 ° C.
  5. מהצעד הזה, תמיד להגן על כלי השיטמהאור. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS-T, ולאחר מכן להוסיף 500 μl של נוגדן שכותרת הקרינה אנטי העכבר IgG (בדילול 2 מיקרוגרם / מיליליטר PBS-T עם סרום 10%). שים את זה על הנדנדה הצלחת עבור שעה 1 ב RT.
  6. יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS-T, ולאחר מכן להוסיף 500 μl של DAPI (בדילול 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ב PBS-T) ולהשאיר למשך 5 דקות.
  7. לשטוף את התאים שוב ולשמור אותם בPBS-T. תאים מוכנים להצטלם ויכולים להישמר לתקופה של עד 2 שבועות על 4 מעלות צלזיוס. שים לב שאות ה- GFP מתעמעמת עם זמן, כך אין זה ראוי להשוות את עוצמת ה- GFP של תאים קבועים וחיים או של תאים קבועים בזמנים שונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניסוי זה, השתמשנו בקו תא 46C 14, תאי גזע עובריים של עכבר עם כתב Sox1-GFP אנדוגני, כדי לעקוב אחר בידול עצבי. באמצעות קו זה תא, ביטוי של Sox1, סמן עצבי, יכול להיות מזוהה על ידי הקרינה ירוקה. ציפוי צפיפות מהווה גורם קריטי להשגת בידול עצבי. תאי גזע עוברי של עכבר היו מצופים בצלחת 6-גם בצפיפויות שונות משתנות מ10,500 ל88,500 תאים / 2 סנטימטר. איור 1 א מציג את יעילות בידול מושגת על ידי צפיפות ציפוי שונה בצלחת 6 היטב. ביום 6 של בידול, תאים היו קבועים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול הבידול העצבי monolayer כבר בשימוש במשך יותר מעשור 6. הפרוטוקול הוא יעיל ביותר, מורכב מבינוני מוגדרים, ונעשה במערכת monolayer מה שהופך את המערכת מתאימה יותר לפרה-קליני (למשל, הקרנת סמים) משתמשת. עם זאת, ישנם כמה גורמים קריטיים הקובעים את יעילות בידול. מאמר זה מצביע על גורמים אלה והפתרון לכל מכשול.

צפיפות של התאים לאחר ציפוי במצב הבידול היא אולי הגורם הקריטי ביותר. ציפוי התאים בצפיפות ג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה מומנה על ידי מלגת פיתוח וקידום מדע וטכנולוגיה ממשרד החינוך התאילנדי ל-W.W. ומענקים מ-Tenovus ו-Anonymous Trust ל-M.P.S.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סרום בקר עובריLife Technologies10270-106
DMEM/F12Life Technologies11320-074
Neurobasal mediumLife Technologies21103-049
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentLife TechnologiesA11105-01
B-27 תוסף, Life Technologies ללא סרום17504-044
אינסוליןסיגמאI6634להרכיב מחדש עם סטרילי 0.01 M HCl
אפו-טרנספריןסיגמאT1147להרכיב מחדש עם מים סטריליים
פרוגסטרוןסיגמאP8783להרכיב מחדש עם אתנול
פוטרסיןסיגמאP5780להרכיב מחדש עם מים סטריליים
נתרן סלניטסיגמאS5261להרכיב מחדש במים סטריליים
שבר אלבומין בקר VLife Technologies15260-037
L-GlutamineLife Technologies25030-081ודא שהוא מומס לחלוטין לפני השימוש מכיוון שגלוטמין בדרך כלל משקע
ג'לטיןסיגמאG1890
צלחת תרבית רקמות 6 בארותThermo Scientific140675
צלחת תרבית רקמות 24 בארותתרמו Scientific142475
צלחת תרבית רקמות 96 בארותThermo Scientific167008
GMEMLife Technologies11710-035
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניותLife Technologies11140-050
נתרן פירובטLife Technologies11360-070
2-מרקפטואתנולסיגמאM7522
גורם מעכב לוקמיהשהוכן בבית כמו ב- Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20SigmaP1379
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)SigmaD9542הגן מפני
אור עכבר אנטי ובטא; III טובולין נוגדן IgGCovanceMMS-435P
IgG נגד עכבר עם תווית פלואורסצנטיתLife TechnologiesA31571הגן מפני
אור 25 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמותThermo Scientific156367
נוגדן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
  2. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  3. Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
  4. Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
  5. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
  6. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
  7. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  8. Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
  9. Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
  10. Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
  11. Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
  12. Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
  13. Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
  14. Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
  15. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
  16. Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SOX1 GFP ReporterBeta III Tubulin

מאמרים קשורים