פרוטוקול זה מיועד למיצוי וריכוז של חלבון ו-DNA מביומסה מיקרוביאלית שנאספה ממי ים, ולאחר מכן יצירת פפטידים טריפטיים המתאימים לניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה טנדם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם
במאמר זה
סיכום
תקציר
טכנולוגיות מטא-אומיות כגון מטגנומיקה, מטא-טרנסקריפטומיקה ומטא-פרוטאומיקה יכולות לסייע בהבנת מבנה הקהילה המיקרוביאלית וחילוף החומרים. למרות עוצמתה, מטגנומיקה לבדה יכולה רק להבהיר את הפוטנציאל התפקודי. מצד שני, מטא-פרוטאומיקה מאפשרת לתאר את חילוף החומרים והתפקוד המתבטא באתרה של קהילה. כאן אנו מתארים פרוטוקול לליזה של תאים, בידוד חלבונים ו-DNA, כמו גם עיכול ומיצוי פפטידים מתאים מיקרוביאליים ימיים שנאספו על יחידת מסנן מחסנית (כגון יחידת המסנן Sterivex) ונשמרים בתמיסת ייצוב RNA (כמו RNAlater). במחקרי פרוטאומיקה מבוססי ספקטרומטריית מסה, זיהוי פפטידים וחלבונים מתבצע על ידי השוואת ספקטרום מסה טנדם פפטיד למסד נתונים של רצפי נוקלאוטידים מתורגמים. הכללת המטאגנום של דגימה במסד הנתונים של החיפוש מגדילה את מספר הפפטידים והחלבונים שניתן לזהות מספקטרום המסה. לפיכך, בפרוטוקול זה ה-DNA מבודד מאותו מסנן, שניתן להשתמש בו לאחר מכן לניתוח מטאגנומי.
מבוא
מיקרואורגניזמים נמצאים בכל מקום ולשחק תפקידים חיוניים במחזורי biogeochemical של כדור הארץ 1. נכון לעכשיו, יש גישות מולקולריות רבות זמינות לאפיון מבנה קהילת חיידקים ותפקוד. הנפוץ ביותר הוא הניתוח של גן 16S rRNA רצפי PCR-מוגבר מ- DNA הסביבתי 2 - 4. חסרון של ניתוח גנטי 16S rRNA הוא שזה רק מספק מידע על זהות פילוגנטי ומבנה קהילה, עם מעט מידע על תפקוד מטבולים. לעומת זאת, גישות כגון metagenomics, metatranscriptomics וmetaproteomics לספק מידע על מבנה קהילה וחילוף חומרים. Metagenomics, או הניתוח של תוכן הגן של מכלול של אורגניזמים, מספק מידע על המבנה ואת הפוטנציאל התפקודי של הקהילה 5 - 8. למרות עוצמה, פוט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכן ריאגנטים
- הכן פתרון SDS-חילוץ: 0.1 M טריס- HCl pH 7.5, גליצרול 5%, 10 mM EDTA ו -1% SDS. מסנן לעקר באמצעות מסנן וחנות 0.22 מיקרומטר על 4 מעלות צלזיוס.
- הכן ריאגנטים מניות דרושים לג'ל polyacrylamide.
- הכן 1.5 M טריס-HCl pH 8.8. מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת חדר.
- 0.5 M טריס-HCl pH 6.8. מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כהפגנה, שבצענו את הפרוטוקול בשתי דגימות מי ים שנאספו מפני השטח ומקסימום כלורופיל של אוקיינוס החוף בצפון קנדה. בעוד בים, 6-7 ליטר של מי ים עבר דרך prefilter / GF D 3 מיקרומטר, אז תאי חיידקים נאספו על יחידת מסנן מחסנית 0.22 מיקרומטר הבא הפרוטוקול של et al וולש. 20. תאים אוחסנו באופן מיידי בפתרון ייצוב RNA עד עיבוד נוסף. לאחר חזרתו למעבדה, ביצענו הפרוטוקול כפי שהוא מוצג כאן. Lysate התא המרוכז היה מחולק; חלבון זירז מ -90% מהנפח, ואילו ה- DNA היה זירז משאר 10% מהה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שימור דגימה הוא מפתח ללימודי metaproteomic והעבודה קודמת הוכיחה כי פתרון ייצוב RNA הוא חיץ אחסון שימושי לאחסון תאים לפני מיצוי חלבון 28. באופן אידיאלי, דגימות תישמרנה באתר לשלול משמרות בביטוי חלבון במהלך טיפול 33,34. למעשה, באתר טכנולוגיות דגימה וקיבעון פותחו, המאפשרות לאוסף האוטונומי והשימור של דגימות על ידי מכשירים לפרוס ספינה. עם זאת, גישה לטכנולוגיות אלה היא לא תמיד אפשרית. במקרה השכיח שזה לא, יש לשמר דגימות בהקדם האפשרי לאחר איסוף.
.......הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מבקשים להודות למרקוס די פאלקו על מומחיותו ועצותיו בהכנת הדגימות עבור ננו-LC MS/MS וכן לד"ר זוראן מיניק מאוניברסיטת רג'ינה לניתוח LC MS/MS. עבודה זו נתמכה על ידי מימון NSERC (DG402214-2011) ו-CRC (950-221184). וושינגטון נתמכה על ידי מכון קונקורדיה למים, אנרגיה ומערכות בנות קיימא ו-FQRNT.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Sterivex -GP 0.22 μ m יחידת סינון | Millipore | SVGP01050 | דגימה |
| RNAlater פתרון ייצוב | אמביון | AM7021 | דגימה |
| Tris | ביו בייסיק | 77-86-1 או TB0196-500G | מיצוי חלבון / SDS PAGE ג'ל |
| DTT | סיגמא-אולדריץ' | D0632-1G | מיצוי חלבון |
| SDS | ביו בייסיק | 15-21-3 | מיצוי חלבון / SDS PAGE ג'ל |
| EDTA | Bio Basic | 6381-92-6 | מיצוי חלבון |
| גליצרול | פישר סיינטיפיק | 56-81-5 | מיצוי |
| חלבון10K מסנן אמיקון | Millipore | UFC801024 | מיצוי חלבון |
| מתנול | סיגמא-אולדריץ' | 179337-4L | משקעי חלבון |
| אצטון | פישר סיינטיפיק | 67-64-1 | משקעי חלבון |
| MPC מגיב משקעים חלבון | Epicenter | mmP03750 | משקעי DNA |
| 2-פרופנול | פישר סיינטיפיק | 67-63-0 | משקעי DNA |
| ערכת בדיקת Qubit dsDNA BR | Life Technologies | Q32850 | כימות DNA |
| ערכת בדיקת חלבון קיוביט | Life Technologies | Q33211 | כימות חלבון |
| סוכרוז | ביו בייסיק | 57-50-1 | SDS PAGE ג'ל |
| TEMED | Bio Rad | 161-0800 | SDS PAGE ג'ל |
| APS | Bio Rad | 161-0700 | SDS PAGE ג'ל |
| 30% אקרילאמיד | ביו ראד | 161-0158 | SDS PAGE ג'ל |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | SDS PAGE ג'ל |
| גליצין | ביו ראד | 161-0718 | SDS PAGE ג'ל |
| B-מרקפטואתנול | ביו בייסיק | 60-24-2 | SDS PAGE ג'ל |
| Laemmli מאגר מדגם | ביו ראד | 161-0737 | SDS PAGE ג'ל |
| דיוק פלוס חלבון קליידוסקופ סולם | ביו ראד | 161-0375EDU | SDS PAGE ג'ל |
| אצטוניטריל | VWR | CABDH6044-4 | ג'ל טריפסין לעיכול |
| NH4HCO3 | ביו בייסיק | 1066-33-7 | בג'ל טריפסין לעכל |
| DTT | סיגמא-אולדריץ' | D0632-1G | בג'ל טריפסין לעכל |
| חומצה פורמית | סיגמא-אולדריץ' | F0507-500 מ"ל | ג'ל טריפסין לעכל |
| HPLC כיתה H2O | Sigma-Aldrich | 270733-4L | בג'ל טריפסין לעכל |
| יודואצטמיד | ביו בייסיק | 144-48-9 | בג'ל טריפסין לעכל טריפסין |
| פרומגה | V5111 | בג'ל טריפסין לעכל | |
| חלבון LoBind 1.5 מ"ל | אפנדורף | 22431081 | בתוך ג'ל טריפסין לעכל |
| 2 מ"ל בקבוקון ROBO 9 מ"מ | Candian Life Science | VT009/C395SB | עיכול טריפסין בג'ל |
| תוספת PP BM, ללא קפיץ | Candian Life Science | 4025P-631 | עיכול טריפסין בג'ל |
מקורות
- Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
- El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasona....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
