יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

סיכום

assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי צמוד אנזים משמש כמדד לתגובות זיכרון מרכזיים וקורלציה עם תגובות חיסון נגד mycobacterial מגן. עם assay זה, תאי דם היקפי mononuclear הם מגורה עם אנטיגנים mycobacterial וinterleukin-2 במשך 14 ימים, מה שמאפשר בידול והתרחבות של תאי T הזיכרון מרכזיים.

תקציר

תאי מפעיל וT הזיכרון נוצרים באמצעות תיכנות ההתפתחותי של תאים נאיביים הבאות הכרת אנטיגן. אם הזיהום נשלט עד 95% מתאי T שנוצרו בשלב ההרחבה בוטלו (כלומר., שלב התכווצות) ותאי T הזיכרון יישארו, לפעמים לכל חיים. בבני אדם, שני תת תפקודי שונים של תאי T זיכרון תוארו מבוססת על הביטוי של קולטנים ביות בלוטה לימפה. תאי T זיכרון מרכזי לבטא קולט CC chemokine 7 וCD45RO וממוקמים בעיקר באזורי T-cell של איברי הלימפה משניים. תאי T זיכרון מפעיל להביע CD45RO, חסרים קולטני CCR7 ותצוגה הקשורים ביות הלימפוציטים לרקמות היקפית או מודלקות. תאי מפעיל T אינם מבטאים גם CCR7 או CD45RO אלא על מפגש עם ציטוקינים מפעיל תוצרת אנטיגן, כגון אינטרפרון-γ. מבחני שחרור אינטרפרון-γ משמשים לאבחון של שור ושחפת אדם ולזהות בעיקר מפעיל ותגובות תא T זיכרון מפעיל. תגובות תא T הזיכרון מרכזית על ידי תאי CD4 ⁺ T כדי חיסון, לעומת זאת, ניתן להשתמש כדי לחזות את יעילות חיסון, כפי שהודגמו עם זיהום קופי וירוס הכשל החיסוני של קופים שאינם בני אדם, שחפת בעכברים, ומלריה בבני אדם. מספר מחקרים בעכברים ובבני אדם, כמו גם נתונים שלא פורסמו בבקר, הוכיחו כי מבחני ELISPOT אינטרפרון-γ למדוד תגובות תא T זיכרון מרכזי. עם assay זה, תאי הדם היקפיים mononuclear בתרבית בהפחתת ריכוז של אנטיגן במשך 10 עד 14 ימים (לטווח ארוך תרבות), המאפשר תגובות מפעיל לשיא ולדעוך; הקלת תאי T הזיכרון מרכזיים לבדל ולהרחיב בתוך התרבות.

מבוא

תאי מפעיל וT הזיכרון נוצרים באמצעות תיכנות ההתפתחותי של תאי CD4 + T הנאיביים לאחר הכרת אנטיגן. התמיינות של תאי CD4 + T הנאיביים לתאי ציטוקינים הפקה דורשת הכרת הפתוגן על ידי תאי מערכת חיסון מולדים, הצגת אנטיגן לתאי T, שיתוף גירוי ושינויי תעתיק וכתוצאה מכך ייצור ציטוקינים מקוטב. לדוגמא: תאי הצגת אנטיגן לייצר אינטרלוקין (IL) -12 בתגובה לפתוגנים תאיים, אשר, יחד עם הכרת אנטיגן, מקדם התמיינות של תאי T לעוזר T 1 תאים (Th1) ^1,2 על ידי איתות באמצעות מתמר אות ומפעיל של שעתוק 4 (STAT4) ו- T-תיבה לידי ביטוי בתאי T (T-הימור), שמוביל להפעלת תא, IL-2 ייצור, הרחבה משובט ואינטרפרון (IFN) ייצור -γ ^3,4. אם הזיהום נשלט, עד 95% מתאי T שנוצרו בשלב ההרחבה בוטלו (כלומר, התכווצותתאי שלב) וT הזיכרון יישארו, לפעמים לכל חיים ^5. Sallusto et al. ^6, חשפו שני תת תפקודי שונים של תאי T זיכרון בבני אדם המבוססים על הביטוי של קולטנים ביות בלוטה לימפה. תאי T הזיכרון מרכזי (TCM) להביע את קולט chemokine CC (CCR) -7 וCD45RO וממוקמים בעיקר באזורי T-cell של איברי הלימפה משניים. TCM מוגבל תפקוד מפעיל, סף הפעלה נמוך ולשמור על ייצור IL-2 גבוה ויכולת שגשוג. תאי T זיכרון מפעיל (TEM) להביע CD45RO, חסרים קולטני CCR7 ותצוגה לביות לרקמות היקפיים או מודלקות. תאי מפעיל אינם מבטאים גם CCR7 או CD45RO אבל מייד לייצר ציטוקינים מפעיל, כגון IFN-γ, בעת הכרת אנטיגן.

מבחני שחרור IFN-γ (IGRA) משמשים לאבחון של שור ושחפת אדם ^7. Mycobacterium וביס הוא הסוכן העיקרי של שחפת הבקר (BTB) תוך CA האנושיSES של שחפת נגרמים בעיקר על ידי שחפת Mycobacterium. עם בדיקות אלה, כל דם או תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMC) מומרצים עם אנטיגנים mycobacterial ל16-24 שעות וייצור IFN-γ בתוך supernatant נמדד על ידי ELISA או באמצעות זיהוי של תאים מייצרים IFN-γ תוך שימוש בטכניקות ELISPOT. כתוצאה מתקופת הגירוי הקצרה (כלומר., 16 עד 24 שעות) וייצור ציטוקינים מהיר, מבחני vivo לשעבר לזהות בעיקר תגובות מפעיל וTEM. זה אושר על ידי ניתוח התזרים cytometric של אוכלוסיות תאים בתרבויות אלה ^8-10.

Vivo לשעבר תגובות IFN-γ כלולים באופן שיגרתי בהערכת פנל תגובה החיסונית של חיסוני שחפת, לרבות אלה המשמשים להערכת תגובות על ידי בקר. רוב חיסוני שחפת הבקר יעילים לעורר תגובת IFN-γ ספציפי, אך לא את כל החיסונים שגורמים לתגובות IFN-γ הם protectivדואר. כמו כן, הרמות של IFN-γ שהושרו על ידי חיסון, כפי שנמדד לפני הזיהום, לא בהכרח תואמות את ההגנה. לדוגמא, ייתכן שיש לי זני BCG שונים יכולות שונות כדי לגרום לvivo לשעבר תגובת IFN-γ, למרות רמות הגנה דומות ^11. לפיכך, vivo לשעבר IGRAs הם בעלי ערך לאבחון שחפת ולגישה חיסוני חיסון; עם זאת, השימוש בם כמנבאים של יעילות חיסון הוא מוגבל. תגובות TCM לחיסון, לעומת זאת, ניתן להשתמש כדי לחזות את יעילות חיסון, כפי שהודגמו עם זיהום בנגיף הכשל החיסוני סימיאן (SIV) בפרימטים לא אנושיים ^12,13, שחפת בעכברי ¹⁴ ומלריה בבני האדם ^15,16.

לאחר תגובה חיסונית יעילה וכתוצאה מכך אישור הפתוגן, TCM נשמרים ולספק הגנה לזיהום שני סופו של דבר על ידי אותו הסוכן. יוצא דופן בולטת לתרחיש זה היא מ ' infe שחפתסיפורת של בני אדם שבו חולים שקבלו טיפול אנטי-mycobacterial מרפא רגישות לזיהום מחדש ^17,18. בנוסף, אירועים המסדירים זיכרון חיסוני במהלך זיהומים כרוניים, שבו גירוי אנטיגני נמשך, אינם מובנות היטב ^19. במהלך זיהומים כרוניים, כגון בוירוס כשל חיסוני אנושי (HIV) ושחפת, תגובת Trinidad & משמעותית קשורה לתוצאה חיובית (לדוגמא, חביון עם שחפת ותת-קליניים עם HIV) ^20,21. מספר מחקרים בעכברים ובבני אדם הראו כי מבחני ELISPOT לטווח ארוך בתרבית IFN-γ למדוד תגובות Trinidad & ^16,20-22. עם assay זה, PBMCs בתרבית בהפחתת ריכוז של אנטיגן במשך 10 עד 14 ימים, ומאפשר תגובות מפעיל לשיא ולדעוך; הקלת Trinidad & לבדל ולהרחיב בתוך התרבות.

מבחני ELISPOT לטווח ארוך בתרבית IFN-γ יש גם שימשו בוטרינריםמחקר, עדיין הפנוטיפ של תאים להגיב כבר קשה להעריך בשל חוסר של חומרים כימיים קריטיים, במיוחד נוגדן לCCR7. חיסוני שחפת הבקר יעילים [למשל. באמצעות מנה אחת של מ ' בוביס Bacille Calmette גרן (BCG), BCG אחרי חיסון-וקטורים נגיפיים Antigen 85A מקטע, או M מוחלש. וביס ΔRD1] לעורר תגובה לטווח ארוך בתרבית γ-IFN ELISPOT הבאה חיסון המתואמים עם הגנה (כלומר, נטל mycobacterial נמוך וירידה ב הפתולוגיה הקשורים TB) נגד האתגר הבא עם מ 'הארסי בוביס ^23,24. יתר על כן, מספרם של תאי IFN-γ-מפריש אנטיגן הספציפי בתוך תרבויות PBMC לטווח ארוך הם גבוהים יותר בגיל 12 חודשים, אך להקטין ב 24 חודשים לאחר חיסון BCG של עגלים בילוד, מקשר עם התואר של פוסט זיהוי הגנה מ ' אתגר בוביס ^25. בתרחיש זה, IFN-γ ELISPOT התרבותית היאכלי חשוב n לניבוי יעילות חיסון, מתן אמצעים כדי לתעדף מועמדי חיסון לניסויי יעילות עלות גבוהה. בנוסף, ניתן להתאים טכניקות ELISPOT תרבותית עבור מארחים, פתוגנים וציטוקינים שונים על ידי שינוי אנטיגנים או נוגדנים למגוון רחב של מטרות בתחומי מחקר שונים.

פרוטוקול

1. מכין את הפתרונות הבאים

1. הכן RPMI המלא (cRMPI) על ידי הוספת סרום שור עוברי (FBS) לריכוז של 10% (נפח / נפח), גלוטמין (2 מיקרומטר), פירובט נתרן (1 מיקרומטר), חומצות אמינו לא חיוניות (0.1 מיקרומטר), פניצילין -streptomycin (100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו 0.1 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין) ו- 2-mercaptoethanol (50 מ"מ) לRPMI 1640.
2. הכן 2 X דקסטרוז ציטרט החומצה, על ידי ערבוב נתרן ציטרט (77 מיקרומטר), חומצת לימון (38 מיקרומטר), ודקסטרוז (122 מיקרומטר), במים מזוקקים.
3. הכן Ca ^{2 +} Mg ^{2 +} נאגר מלוח פוספט החופשי (PBS) pH 7.2: NaCl (137 מ"מ), KCl (2.7 מ"מ), Na _{2 4} HPO (dibasic, 10 מ"מ), KH ₂ PO ₄ (monobasic, 2 מ"מ) במים מזוקקים; להתאים את ה- pH 7.2.
4. הכן PBS 1% (1% BSA PBS) על ידי הוספת אלבומין בסרום השור לPBS (נפח / משקל, 1G / 100 מיליליטר של PBS).
5. הכן PBS tween + 0.05% 20(PBST) על ידי הוספה של 0.05% tween 20 לPBS (נפח / נפח, 500 μl של tween 20 L / 1 של PBS).
6. הכן 100 מ"מ טריס חיץ HCl pH 8.2 ידי ערבוב טריס (100 מ"מ), HCl (0.50 מ"מ) במים מזוקקים.
7. הכן 35% אתנול פתרון על ידי דילול אתיל אלכוהול (טוהר% ≥99.5) במים מזוקקים (נפח / נפח, 35 מיליליטר של אתיל אלכוהול / מים מזוקקים 100 מיליליטר).
8. סנן לעקר cRPMI, 2 x דקסטרוז ציטרט חומצה, PBS, PBS BSA 1% באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים.

2. תאים בתרבית לטווח ארוך (14 יום פרוטוקול)

(יום אחד)

1. הכן את פתרונות אנטיגן בפעמי הריכוז הסופי בcRPMI. בחירת אנטיגן היא קריטית וצריכה להיות מותאמת למטרת המחקר.
2. לדלל מ רקומביננטי שחפת אנטיגנים Ag85A TB10.4 ואנטיגן 2 מיקרוגרם / מיליליטר (של כל אנטיגן; הריכוז הסופי הוא 1 מיקרוגרם / מיליליטר).
3. לדלל מ ' נגזר חלבון מטוהר בוביס(PPD-B, Prionics Ag) עד 10 מיקרוגרם / מיליליטר (הריכוז הסופי הוא 5 מיקרוגרם / מיליליטר).
4. לדלל את יעד רקומביננטי המוקדם הפרשת אנטיגני 6 (ESAT-6) וחלבון תסנין תרבות 10 (CFP-10) חלבון היתוך (rESAT-6: CFP10) 2 מיקרוגרם / מיליליטר (ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מיליליטר).
   הערה: אנטיגנים אלה הם IFN-γ immunodominant התרמה אנטיגנים של mycobacteria שחפת ועשויים להיכלל כדי לעורר PBMC ממ ' בוביס נגוע בעלי חיים. BCG או מ ' בוביס ΔRD1 חוסנו בעלי חיים אינם מגיבים לrESAT-6: CFP10, כאזור קידוד אנטיגנים אלה (כלומר, RD1) נמחק בזנים אלה. rESAT-6: CFP10 ששמש במחקר אלה היה מתנת סוג של ד"ר ג מיניון, אוניברסיטת איווה סטייט. TB10.4 וAg85A אנטיגן הם אנטיגנים immunodominant הנוכחיים במ ארסי וחיסון בוביס זני ^37. PPDB, כנגזרת של חלבון מטוהרת, הוא קומפלקס של כמה אנטיגנים כוללים אנטיגנים משותפים עם mycobacteria שאינה שחפת. Infecבעלי החיים טד פוטנציאליים יגיבו לכל אנטיגנים (כלומר: TB10.4, Ag 85A, rESAT-6: CFP10 וPPDb), ואילו בעלי חיים מחוסנים לא צריכים להגיב לrESAT -6: ¹¹ CFP10.
5. μl צלחת 500 / היטב פתרון אנטיגן בquadruplicates עבור כל חיה בצלחת גם 24. לפרוטוקול זה, להשתמש אנטיגנים כברכה; כך להשתמש בכל הבארות מכילות את כל אנטיגנים ולא שולט (כגון, null או mitogen) שלב זה. דגירה צלחת ב 39 ° C / 5% CO _2. הטמפרטורה הנורמלית של הבקר היא 39 מעלות צלזיוס; כך, כמה חוקרים לנצל 39 מעלות צלזיוס במשך התרבות של תאי שור. כמו כן, במקרים מסוימים עם תאים אנושיים, תרבות תאים ב 39 מעלות צלזיוס מספקת יתרון נוסף ^26,30.
6. מזרקים טרום עומס בשילוב עם 16 או 18 מחטי מזרק G עם 6 מיליליטר של 2 X חומצה-ציטרט דקסטרוז; ולאסוף 60 מיליליטר של דם שור על ידי venipuncture הצוואר.
7. לבודד PBMC ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סטנדרטית של השברים מעיל באפי דם ההיקפי התאמת ריכוז תא 4 X 10 ⁶ תאים / מיליליטר כפי שתואר על ידי et al Maue. ²⁷
8. להוסיף תאים (500 μl / טוב) לאנטיגן שנטען מראש 24 צלחת גם, בארבעה העתקים לכל חיה (שלב 2.5). דגירה צלחת ב 39 ° C / 5% CO _2.

(ימים שלושה ושבע)

9. באמצעות טכניקה סטרילית, להסיר בזהירות 500 μl של supernatant מכל טוב מבלי להפריע את שכבת התאים.
10. לחדש נפח גם על ידי הוספת 500 μl / היטב cRPMI מכיל IL-2 (30 U / μl, כלומר, 15 U / טובה; IL-2 האנושי רקומביננטי Sigma I7908). דגירה צלחת ב 39 ° C / 5% CO _2.

(ימים 10 ו -12)

11. באמצעות טכניקה סטרילית, להסיר 750 μl של supernatant מכל טוב. לחדש את הנפח עם 750 μl / היטב cRPMI (ללא IL-2). דגירה צלחת ב 39 ° C / 5% CO _2.

class = "jove_title"> 3. ELISPOT Assay (שלושה ימים פרוטוקול)

(יום אחד (12 יום ^ה של פרוטוקול תרבות לטווח ארוך))

1. תווית צלחת ELISPOT כראוי עבור כל קבוצה של דגימות, כדי למנוע טעויות בעת תאי ציפוי: תאים לטווח ארוך בתוספת תאי הצגת אנטיגן (נגמ"שים), תאים לטווח ארוך ללא נגמ"שים ולשעבר תאים / לטווח קצר vivo (איור 1). משכפל עבור כל טיפול (כלומר גירוי אנטיגני) צריך להיעשות לפחות בשני עותקים.
2. הכן פתרון נוגדן ללכוד על ידי דילול עכבר אנטי-שור נוגדן IFN-γ (MCA2112, CC330 שיבוט) בPBS (8 מיקרוגרם / מיליליטר).
3. באמצעות pipettor רב ערוצי מראש להרטיב את הבארות של צלחת ELISPOT עם 15 μl / טוב של 35% אתנול דקות 1. כדי למנוע נזק קרום, לא לגעת בחלק התחתון של בארות עם טיפים פיפטה בכל נקודה במהלך assay.
4. צלחת לשטוף שש פעמים עם 300 μl / טוב של PBS. לשטוף נוזל צריך להיות מושלך על ידי היפוך צלחת. צריך להיעשות במהירות שוטפת, לא מאפשר בארות צלחת לייבוש.
5. פיפטה 100 μl / טוב של נוגדן אנטי IFN-γ לכידה (משלב 1 לעיל). דגירה על 4 מעלות CO / N (לשמור את הצלחת בתוך שקית אחסון רוכסן).

(יום שני (13 יום ^ה של פרוטוקול התרבות לטווח הארוך))

6. הכן את פתרונות אנטיגן בפעמי הריכוז הסופי. טיפולים הם: אין גירוי (cRPMI), PPD-B (מיליליטר 20 מיקרוגרם /, ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם / מיליליטר), קוקטייל חלבון של TB10.4 וAg85A (2 מיקרוגרם / מיליליטר של כל חלבון, ריכוז סופי: 1 מיקרוגרם / מיליליטר של כל חלבון), rESAT-6: CFP10 (לזיהום M. בוביס, 2 מיקרוגרם / מיליליטר, ריכוז סופי: 1 מיקרוגרם / מיליליטר), וביקורת חיובית, כגון (20 מיקרוגרם / מיליליטר פיטולקה, ריכוז סופי: 10 מיקרוגרם / מיליליטר). mitogen אחר, ניתן להשתמש במקום PWM (למשל, concanavalin).
   הערה: בשלב זה אנטיגנים להלחין ארבעה טיפולים שונים וnot משמש כברכה (כמו בשלב 2.5). ארבעה טיפולים: NS, PPDb, קוקטייל חלבון (TB10.4 וAg85A מהווים טיפול אחד) וPWM.

תרבית תאי 4. לטווח קצר ותא חסיד בידוד (נגמ"שים)

1. לאסוף 60 מיליליטר דם מאותו בעלי החיים דיממו ביום 1 (תחת: תרבות לטווח ארוכה, פרוטוקול יום 14) ולבודד PBMCs כמו קודם.
2. התאם ריכוז תא 2 X 10 ⁶ תאים / מיליליטר. צינורות תווית ברורים כדי למנוע הקצאה שגויה כאשר תאי ציפוי. תאים אלה ישמשו לבידוד נגמ"שים וגם כתרבית תאים לטווח קצר (שלב 6.5). צינורות תווית עם שני מספר בעלי החיים והסוג של התרבות (במקרה זה: vivo לשעבר, לטווח קצר או תאים טריים).
3. הסר נוגדן ללכוד עודף מELISPOT על ידי היפוך צלחת. לשטוף צלחות 6 פעמים עם PBST 300 μl.
4. להסיר כמה שיותר PBST ככל האפשר. פיפטה 50 μl של מתלי תא לבארות שכותרתו תאים לטווח ארוך בתוספת נגמ"שים. wel האחר הבלוקLS עם 200 μl / היטב cRPMI. דגירה 90 דקות באו 39 ^{מעלות צלסיוס} או C טרום חמים cRPMI ל -39 ^מעלות (הכרחי לשלבים הבאים). PBMCs טרי שאינו משמש לתא חסיד בידוד (נגמ"שים) יהיה צורך בצעדים הבאים וצריך להיות מאוחסן.

5. תאים בתרבית

1. במהלך הדגירה 90 דקות (שלב 4.4, תרבות לטווח קצר וצעד בידוד תא חסיד), תאים בתרבית לטווח ארוך קציר.
2. באמצעות 5 או 10 טפטפות μl, תקשורת פיפטה עם תאים למעלה ולמטה כדי לנתק תאים, לשלב הארבעה הפעמים משכפל מכל חיה לתוך צינור 15 מיליליטר אחד. צנטריפוגה הצינורות במשך 5 דקות ב 400 גרם.
3. לאחר צנטריפוגה, לבטל את supernatant על ידי היפוך צינור. לסלק תא גלולה. הוסף 5 מיליליטר של PBS, בעדינות מחדש להשעות גלולה, במידת צורך. חזור על צנטריפוגה. חזור על שלב הכביסה פעמיים. בטל supernatant על ידי היפוך צינור בעדינות מחדש להשעות תאים ב1ml cRPMI. התאם ריכוז תא2 X 10 ⁵ תאים / מיליליטר.

6. ציפוי טרי וPBMCs מתורבת

1. לאחר הדגירה 90 דקות, לנער צלחות על שייקר צלחת למשך 30 שניות. הסרת תאים שאינם חסיד ידי היפוך צלחת. פיפטה μl 150 / היטב cRPMI החם (משלב 4, תחת: תאים לזמן קצר וצעד בידוד תא חסיד (נגמ"שים)).
2. לנער צלחות ולהשליך לשטוף נוזל. חזור על לשטוף 3 פעמים. הוספת 100 μl / טוב של כל אנטיגן לתוך בארות מתאימות (שכותרתו מראש).
3. לתאי צלחת, פיפטה 100 μl / טוב של השעיה לטווח ארוך בתרבית תאים (2 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר) לתוך הבארות שכותרתו תאים לטווח ארוך בתוספת נגמ"שים. ודא שהתאים לטווח הארוך הוסיפו בשלב זה הם מאותו בעלי החיים כמו APC כבר בבאר. אין לערבב תאים בתרבית של APC וארוך טווח מבעלי חיים שונים.
4. פיפטה 100 μl / היטב ההשעיה תא בתרבית לטווח הארוך (2 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר) לתוך בארות ללא APCים להערכת דרישת APC לתגובת התרבות לטווח הארוך.
5. הוספה 100 μl / גם של תאים לטווח קצר (מבודדים טרי ומותאם ל2 x 10 ⁶ תאים / מיליליטר) לvivo לשעבר הערכת תגובה. דגירה צלחות O / N ב 39 ^° C / 5% CO ₂ באינקובטור. ודא שצלחות שוכבות ולא לערום צלחות.
   הערה: אם הניתוח של פנוטיפ התא רצוי, cytometry זרימה יכול להתבצע כassay נלווה. תאים מצופה ב96 צלחות גם U תחתון (במקום ELISPOT צלחות) כפי שתוארו עבור assay ELISPOT. ספיחת נוגדן ללכוד (שלבים 3.4-3.5) יש לדלג עליו. לאחר מכן תאים מודגרת O / N ב 39 ° C / 5% CO2 ופרוטוקול מכתים תא סטנדרטי שבוצע. ריאגנטים מכתים תא כלולים בטבלת חומרים כימיים.

יום שלושה (14 יום ^ה של פרוטוקול התרבות לטווח הארוך)

6. לדלל נוגדן זיהוי (IFN-γ עכבר אנטי-שור, CC3 שיבוט02) 5 מיקרוגרם / מיליליטר בBSA 1% PBS. בטל נוזלים מבארות ולשטוף צלחות: שש פעמים עם PBST (μl 300 / טוב), הצבה על שייקר בכל פעם במשך 10 שניות לפני ומה שבין שוטף, פעם אחת עם DH ₂ O (μl 300 / טוב), נוספת 6 פעמים פעמים עם PBST (300 μl / טוב) ושני עם PBS (300 μl / טוב). לאחר התאים יוסרו מהצלחות, ואם אין חששות בטיחות ביולוגית חלים, נהלים עשויות להתבצע מחוץ ארונות בטיחות ביולוגיים.
7. נוזל שטיפת מחק. להסיר כמה שיותר נוזל שטיפה ככל האפשר על ידי הקשה צלחת על מגבות נייר. הוסף נוגדן זיהוי (100 μl / טוב).
8. דגירה צלחות במשך 120 דקות באו 39 ^{מעלות צלסיוס} במהלך שלב דגירה זה, להכין את פתרון phosphatase אלקליין הבא הוראות היצרן. שלושים דקות לפני השימוש (כלומר, 90 דקות אחרי תוספת של נוגדן איתור לבארות) לדלל מגיב בPBST. להפוך את הצינור בעדינות לתערובת חומרים כימיים וטופחו על RT.
9. לאחר 120 דגירה דקות, להשליך נוגדן זיהוי עודף על ידי היפוך צלחת. צלחת לשטוף 6 פעמים עם PBST (300 μl / טוב). להסיר כמה שיותר נוזל שטיפה ככל האפשר על ידי הקשה צלחת על מגבות נייר.
10. הוספת 100 μl / היטב פתרון phosphatase אלקליין (מהשלב 3 לעיל). דגירה צלחות במשך 45 דקות ב RT. בטל נוזל ולשטוף כל צלחת 6 פעמים עם PBST (300 μl / טוב).
11. הכן את פתרון המצע הבא הוראות היצרנים (מצע וקטור הכחול AP III): לדלל ריאגנטים ב100 מ"מ טריס חיץ HCl pH 8.2. פיפטה μl 50 / טוב של פתרון המצע.
12. לדגור על RT עד צבע כחול מתחיל לפתח (כ -30 דקות). בטל נוזל ולשטוף צלחות עם כמויות עצומות של DH ₂ א ' הסר את הצלחת תחתונה לחשוף קרום, לשטוף אחורי של בארות ולאפשר צלחת לייבוש באוויר.
13. קראו צלחות על מנתח Immunospot תמונה או ELISPOT קורא (טבלה 1), או באופן ידני, באמצעות סטראו. לחלופין, לשמור צלחותבחושך ב RT עד קריאה. בגלל היציבות הגבוהה של מצע התגובה, איכות נשמרה במשך כמה שנים.
    הערה: תאים וריכוזי אנטיגן היו מותאמים כדי למנוע בארות עם כתמים אינספור ^23,24,27,37. יתכן שהיווצרות כתמים אינספור להתרחש בהגדרות שונות או בשל וריאציה ביולוגית. אם זה המקרה, ריכוז תא צריך להיות מותאם כך תגובת ספירת נקודה קריא מתקבלת.

7. צלחות קריאה וניתוח נתונים

1. ביצוע ניתוח לפי המדריך הסלולרי הטכנולוגיה בע"מ (CTL) צלחת ELISPOT קורא (טבלת 1). לאחר ספירת הנקודות מתקבלת לכל אחת מהבארות, לחשב את הממוצע בין כפילויות. התגובה החיסונית הספציפית לכל גירוי אנטיגני מחושבת על ידי הפחתת המספר הממוצע של כתמים בבארות שאינן מגורות מזה של בארות-מגורה אנטיגן.

תוצאות

כ זיהום פוסט-תרסיס של חודש אחד עם מ ' בוביס (10 ⁴ יחידות מושבה יוצרים), PBMCs מנגוע (n = 8) ובעלי חיים ביקורת (n = 8) היו בתרבית בנוכחות של אנטיגנים וIL-2 במשך 13 ימים. פיתוח של תגובות Trinidad & לאחר ההדבקה נקבע באמצעות assay ELISPOT IFN-γ. נציג TCM (בנוכחות או עדר של נגמ"שים) לשעבר vivo IFN-γ תגובות ELISPOT מבעלי חיים נגועים (שלושה בעלי חיים) ושאינם נגועים בבעלי חיים (בעלי חיים אחד) מוצגים באיור 1. IFN-γ מוצלח לטווח ארוך תוצאות ELISPOT assay בתאי ייצור IFN-γ (ספוט-יצירת תאים, SFC) בתנאי מגורה וליד העדר תגובה מבעלי חיים הנגועים שאינם ובתנאים שאינם מגורה. כמו כן, תגובה של תאי T חזק צריכה להתרחש בתגובה לPWM. מענה ספציפי למ ' בוביס הוערך על ידי PPD-B או rESAT-6: גירוי אנטיגני CFP10. כפי שניתן לראות באיור 1, TCM חזק וvivo לשעבר תגובות לPPD-B וrESAT-6: CFP10 אותרו מכל שלוש מ ' בוביס -infected בעלי חיים. מינימאלי ללא TCM ותגובות vivo לשעבר התגלו מחית השליטה. כמו כן, הנוכחות של נגמ"שים נדרשה לתגובות Trinidad & אופטימליות על ידי בעלי חיים נגועים, כפי שהודגמה על ידי תגובות מופחתות במידה ניכרת על ידי תאים בתרבית לטווח ארוך, בהעדר נגמ"שים אוטולוגית. תגובת IFN-γ על ידי PBMCs ממ ' בוביס נגוע ובעלי חיים נגועים שאינם מוצגים באיור 2. מספר SFCs מכל חיה חושב כממוצע של SFCs בדגימות כפולות בתגובה לPPD-B מינוס התגובה המתאימה לתקשורת בלבד. תגובות נאמדו עבור 10 ⁶ תאים. תגובות שונות (P <0.05) המבוסס על זיהום מעמד, נוכחות או עדר של נגמ"שים ומשך התרבות (, לעומת vivo לשעבר תרבות תרבות לטווח ארוך כלומר.).

רכישת תמונה של צלחות
1.	הפעל מכונה
2.	פתוח "לכידת חיסונית" תוכנת גרסת 6.3.
3.	שלב 1: סוג צלחת נבחרת.
4.	שלב 2: צלחת עומס.
5.	שלב 3: בחר אפשרויות סריקה.
6.	שלב 4: להתחיל בסריקה.
7.	להשיג תמונת סקירה של צלחת.
8.	הוצא צלחת.
9.	צא תוכנה "לכידת החיסוני".
ספירת יחידות הנקודה להרכיב
1.	פתח "לכידת ספוט החיסוני" תוכנת גרסת 5.0.
2.	objec בחר סוג T: רגיל.
3.	מודול בחר ספירה: ספירה חכמה.
4.	שלב 1: צלחת עומס.
5.	שלב 2: להגדיר פרמטרים ספירה: דיוק בדיקה של הכרת נקודה על בארות עם כתמים שונים.
6.	התחל לספור אוטומטי.
בקרת איכות
1.	פתוח "לכידת Immunospot" תוכנת גרסת 5.0.
2.	מודול בחר ספירה: בקרת איכות.
3.	שלב 1: צלחת עומס.
4.	שלב 2: לנתח בארות מסומנת בנפרד.
5.	לסיים בקרת איכות.

= Cellspacing "0" ז = "0">

טבלת 1 - רכישת תמונת קורא AutoImmun Diagnostika ELISPOT ותא ספירת הליך.

ove_content "FO: לשמור-together.within עמודים =" תמיד ">
תמונת 1. איור של בארות מIFN- תרבותית ארוך טווח γ assay ELISPOT. Assay ELISPOT γ-IFN מתורבת בוצעה חודש לאחר approximatelyone אתגר עם מ 'הארסי בוביס (שלושה בעלי חיים). בעלי חיים שאינם נגועים נכללו כביקורת (חיה אחת) שורות תאים לטווח ארוך נוצרו על ידי גירוי PBMC עם קוקטייל של Ag85A רקומביננטי (1 מיקרוגרם / מיליליטר), TB10.4 (1 מיקרוגרם / מיליליטר), rESAT-6.: CFP10 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) וPPD-B (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 13 ימים ואחריו העברה לצלחות ELISPOT בנוכחות או עדר של APC אוטולוגית. תאים לזמן קצר כללו PBMC מבודד ביום 13 ומצופה ישירות לתוך צלחות ELISPOT. תאים לטווח ארוך וטווח קצר היו מגורה עם PPD-B, rESAT-6 (10 מיקרוגרם / מיליליטר): CFP10 (1 מיקרוגרם / מיליליטר), mitogen בינוני לבד או פיטולקה (5 &# 956; ג '/ מיליליטר) במשך 24 שעות.

איור 2. תוצאות נציגת IFN- תרבותית ארוך טווח γ תגובת ELISPOT למ ' נגזר חלבון מטוהר בוביס (PPD-B). assay מתורבת IFN-γELISPOT בוצע חודש לאחר approximatelyone אתגר עם מ 'הארסי בוביס (שמונה בעלי חיים). בעלי חיים שאינם נגועים נכללו כביקורת (תאי שמונה בעלי חיים לטווח ארוך נוצרו על ידי גירוי PBMC עם קוקטייל של Ag85A רקומביננטי (1 מיקרוגרם / מיליליטר), TB10.4 (1 מיקרוגרם / מיליליטר), rESAT-6: CFP10 (1 מיקרוגרם / מיליליטר) וPPD-B (5 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך 13 ימים ואחריו העברה לצלחות ELISPOT בנוכחות או עדר של נגמ"שים אוטולוגית. תאים לזמן קצר כללו PBMC מבודד ביום 13 ומצופה ישירות לתוך צלחת ELISPOT . לטווח ארוך וshoתאי RT-טווח היו מגורה עם PPD-B (10 מיקרוגרם / מיליליטר) או בינוני לבד במשך 24 שעות. תגובות ספציפיות מכל חיה (SFC / 10 ⁶ תאים) מוצגות כתגובה לPPD-B (ממוצע של דגימות כפולות) מינוס התגובה לתקשורת בלבד.

דיון

ייצור IFN-γ במבחני ELISPOT תרבותיים לטווח הארוך הוא בדרך כלל עקב Trinidad & בבני אדם, אבל איך תגובה זו מתפתחת בתרבות הוא הבין היטב. אם Trinidad & נמצא במחזור ולהרחיב במבחנה, או אם תגובות Trinidad & נובעות מבידול של מפעיל ותאי Tem לTrinidad & בתרבות אינו ידוע. עם זאת, מחקרים עם דגימות מבני האדם מצאו כי יש תאי CD4 ⁺ T מvivo לשעבר ומבחני ELISPOT IFN-γ התרבותי ארוך טווח ספציפיות epitope שאינן קשורות, רומזים כי תגובות Trinidad & לא לפתח מתאי מפעיל ^28. ברור, את משך התגובה עשוי להשתנות, אבל אם אישור הפתוגן מושגת, סופו של דבר שניהם vivo לשעבר ותגובות Trinidad & לרדת. כמו כן, תגובות של תרבויות ארוכת טווח שנמדדו בתחילת וזמן רב לאחר תחול אנטיגני (כאשר תגובת מפעיל היא נמוכה יותר) מוצג לתאם, המציין כי במחזור אוכלוסיות Trinidad & המוקדם וארוך לאחר אנטיתחול genic נשאר קשור in vivo. מצד שני, עוצמת תגובת vivo לשעבר אינה מופיעה להיות קשורה לעוצמת תגובת הזיכרון ^29. תוצאות אלו מצביעות על כך שתגובות γ-IFN תרבותיים לטווח ארוך כתוצאה מהתרחבות ELISPOT במבחנה של TCM ודעיכה קשורה של תגובות מפעיל במדגם, ולא ההתמיינות של תאי מפעיל לפנוטיפ TCM.

עם הבקר, את התרומה היחסית של תת מפעיל וזיכרון לתגובות זוהתה על ידי מבחני ELISPOT IFN-γ לטווח הארוך אינה ידועה. מחקרים שנעשה לאחרונה מצביעים על מתאם בין החיסון עורר תגובות לטווח ארוך בתרבית γ-IFN ELISPOT והגנה מפני זיהום הניסיון הבא עם מ ' בוביס ^23-24. זה כבר דווח כי תגובות חלשות לטווח ארוך IFN-γ ELISPOT לחיסון קשורים להיעדר ההגנה ^30. שניהם חיים ולהרוגחיסוני אד לגרום תגובות ELISPOT vivo IFN-γ דומות לשעבר, אבל חיסון BCG עם החיה מעורר תגובות חזקות לטווח ארוך בתרבית γ-IFN ELISPOT מאשר לעשות הכנות חיסון נהרגו. מעניין לציין, חיסונים חיים הם הגנה תוך ניסוחים נהרגו אינם מספקים הגנה מפני אתגר עם mycobacteria הארסית שחפת ^{31-32, 33.}

הערכה של תגובות Trinidad & היא גם אפשרית על ידי מיון תאים אלה מPBMC. העשרה ישירה של TCM מPBMC, לעומת זאת, דורשת מכשירים יקרים, מאומנים אישי וקשה כמו תאים אלה אינם רבים בזרם הדם. תרבות לטווח הארוך של PBMC מספקת העשרה של TCM על TEM ותאי מפעיל ללא מכשירים יקרים; עם זאת, מכיוון שאוכלוסיות תאי T אלה הרחיבו במבחנה הם עשויים להיות פחות נציג של תגובות זיכרון in vivo. אפשר לגשת לתגובות זיכרון IFN-γ (באמצעות התרבות לטווח הארוך או סוג Trinidad &ing אסטרטגיות) על ידי מבחני אחרים מאשר ELISPOT כגון: ELISAs ציטוקינים ^34, מערכי חרוז ציטוקינים (CBA), מכתים תאיים (ICS), או מערכי חלבון ציטוקינים (רו"ח). שיטות אלה; עם זאת, בדרך כלל פחות רגישים מאשר ELISPOT מבחני ^35.

יתרון של ELISPOT הוא היכולת שלה לזהות את הלכידה המיידית של ציטוקינים זמן קצר לאחר שחרורו מניעת דילול בsupernatant והשפלה על ידי מחשוף האנזימטית או ספיגת ציטוקינים על ידי תאים אחרים. מבחני ELISPOT לזהות תאים בודדים ייצור ציטוקינים לספק תוצאות מדויקות אפילו באות נמוכה לתרחישי רעש (כלומר, תגובות ספציפיות נמוכות) ^35. כמו כן, עם ICS, זיהוי של ציטוקינים לפני השחרור עלול לגרום לזיהוי מוטעה של תאים מייצרים ציטוקינים (למשל., בשל אפנון לאחר translational לפני או במהלך תהליך ההפרשה) ^34. מעכבי התחבורה מועסקים במבחני ICS כדי למזער הפרשת ציטוקיניםבמהלך גירוי אנטיגן (המכונה חלבוני תחנת Golgi) להגביל את משך הזמן של גירוי תא בשל רעילות התא של חלבונים אלה סופו של דבר משפיעים על ייצור ציטוקינים ^35.

עם זאת אמרה - CBA, רו"ח וICS טכניקות שימושיות למדידת ציטוקינים מרובים בו זמנית ו / או לקביעת ביטוי סמן תא שטח (כלומר, עם ICS.). לכן, שיטות אלה יכולים לשמש בשילוב עם assay ELISPOT γ-IFN ^36. בעוד שמחקרי יעילות חיסון שחפת הבקר קודמים נמדדו תגובות Trinidad & באמצעות assay ELISPOT, זיהוי של תגובות Trinidad & על ידי טכניקות אחרות צפוי להניב תוצאות דומות. חשוב לציין, assay ELISPOT הוא פחות יקר ופשוטה לביצוע מאשר CBA, טכניקות רו"ח וניתוח ICS ^34. ספירה ידנית של SFC היא אלטרנטיבה לספירה אוטומטית, וניתן לאחסן צלחות ELISPOT ב RT לתקופה ארוכה של זמן עם אובדן איכות מינימאלי, לפני או אחרי הנקודה גounting ^37.

תגובת γ-IFN התרבותית ארוך טווח ELISPOT יושמה להעריך תגובות זיכרון על ידי אדם, ובקר בעת הערכת תגובות חיסון שחפת ^{14-16,31-32,33.} תגובות TCM גם הם הניחו לשחק תפקידים משמעותיים בתגובות מארח לכמה סוכנים אחרים זיהומיות של בקר, כגון:. mycoides Mycoplasma mycoides subsp ^42, Anaplasma marginale ³⁸ ווירוס syncytial נשימה שור ^39. פוטנציאלי, assay ELISPOT לטווח הארוך עשוי להיות מותאם לבעלי חי מינים, ציטוקינים וזיהומים אחרים. יישומים רחבים יותר אלה יהיו שימושיים במיוחד עבור יישומי אימונולוגיה וטרינרים בשל זמינות מוגבלת של חומרים כימיים מסוימים.

תגובות TCM הן חיוניות להגנה מפני זיהומים כמה, אבל מדידה אותם מוקדם לאחר הדבקה / חיסון (לחיזוי תוצאת מחלה או יעילות חיסון) may להיות מסורבל. ניתוח של התגובה החיסונית תחת vivo לשעבר ותנאי גירוי אנטיגני קצרים יותר לעתים קרובות מייצג תגובות מפעיל, בשל החפיפה של תגובות וזכרון מפעיל, במיוחד בתחילת היווצרות זיכרון חיסונית. בהקשר של מחלות כרוניות שבעומס אנטיגן הוא מתמשך, תגובות vivo לשעבר תהיה להעריך תגובות תא מפעיל או שילוב של תגובות זיכרון ותא מפעיל. Assay γ-IFN התרבותי ארוך טווח ELISPOT, שתואר כאן, סביר להניח מאפשר המדידה של תגובות Trinidad & ולא תא T מפעיל או תגובות של תאי CD4 ⁺ בשילוב. לסיכום, assay γ-IFN התרבותי ארוך טווח ELISPOT מספק גישה רבת ערך להערכת תגובות זיכרון תא T וכבר מועסק בהצלחה על מנת להעריך את תגובות של כמה מיני זיכרון למגוון רחב של סוכני זיהומים ^{12-16, 20-25,29 , 31,33,34,38,39.}

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן ציטראט (דיהידרט)
(מונוהידרט)	שונים
צלחת ELISPOT PVDF	שונים
שונים Vectastain ABC – AP KIT Standard	Vector Laboratories	AK-5000
וקטור כחול אלקליין פוספטאז ערכת מצע	Vector Laboratories	SK-5300
Ag85A	Lionex	LRP-0004.3	23, 24, 25, 37
TB 10.4	Lionex	LRP-0061.6	23, 24, 25, 37
PPDb	Prionics AG	7600055
rESAT-6:CFP10	מתנה חביבה ד"ר. Minion, Iastate		23, 24, 25, 27,  37
עכבר אנטי-בקר IFN-γ שיבוט CC302	Serotec	MCA1783B	23, 24, 25, 27,  37
עכבר אנטי בקר IFN-γ שיבוט ביוטינילציה CC330	Serotec	MCA2112	23, 24, 25, 27,  37
עכבר אנטי בקר CD4 שיבוט CC8	Serotec	MCA1653GA
עכבר אנטי בקר CD45RO שיבוט IL116A	Serotec	MCA2434GA
חולדה אנטי אנושי CCR7 שיבוט 3D12	Abcam	ab95665
עכבר אנטי בקר IFN-γ-Pe שיבוט CC302	Serotec	MCA1783PE
עיזים נגד עכבר IgG2a- Alexa Fluor 350	Invitrogen	A-21130
עיזים נגד עכבר IgG3 APC-CY7	SouthernBiotechnology	1080-193
עז נגד חולדות IgG-APC	Invitrogen	A10540
BD ציטופיקס/ציטופרם&סחר;	BD Biosciences	554714
BrefeldinA	Sigma-Aldrich	B7651
Pokeweed Mitogen	Sigma-Aldrich	L8777
Recombinat Human Interleukin 2	Sigma-Aldrich	I7908