Method Article

שיטות כדי להגדיל את הרגישות של רזולוציה גבוהה התכה יחידה נוקלאוטיד פולימורפיזם Genotyping במלריה

DOI:

10.3791/52839

⸱

November 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Organismic and Evolutionary Biology, Harvard University, 2Department of Immunology and Infectious Diseases, Harvard T.H. Chan School of Public Health, 3Faculty of Medicine and Pharmacy, Cheikh Anta Diop University, 4School of Nursing and Health Sciences, Simmons College, 5Institute of Infectious Diseases, Broad Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה מציע את היכולת להבחין בין פולימורפיזם של נוקלאוטיד הבודד באוכלוסייה הטרוגנית, הטיה ההגברה אלל מוטנטי יכולה להגדיל את יכולתה לזהות אללים נוכחים באחוזים נמוכים יחסית בתוך מדגם. פרוטוקול זה מתאר שיפורים המשפרים את הרגישות של ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות עשרות שנים של מאמצי מיגור, מלריה נשארה נטל עולמי. עניין מחודש אחרון בחיסול אזורי ומיגור הגלובלי כבר מלווה במידע גנומי עלה על מיני Plasmodium טפיל מלריה אחראים ל, כוללים מאפיינים של אוכלוסיות גיאוגרפיות כמו גם וריאציות הקשורים רגישות מופחתת לתרופות נגד מלריה.

וריאציה אחת משותפת גנטית, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNPs), מציעה יעדים אטרקטיביים לgenotyping טפיל. סמנים אלה הם שימושיים לא רק למעקב אחר סמני עמידות לתרופות, אלא גם למעקב אחר אוכלוסיות טפילות באמצעות סמנים לא תחת סמים או לחצים סלקטיביים אחרים.

שיטות genotyping SNP מציעות את היכולת לעקוב אחר עמידות לתרופות, כמו גם לטביעות אצבעות טפילי פרט למעקב אוכלוסייה, במיוחד בתגובה למאמצי שליטת מלריה באזורים מתקרבים eliminatמעמד יון.

בעוד SNPs אינפורמטיבי זוהה כי הם אגנוסטי לטכנולוגיות genotyping ספציפיים, ניתוח ברזולוציה גבוהה נמס (HRM) מתאים במיוחד מחקרים מבוססי שדה. בהשוואה לשיטות ניאון בדיקה סטנדרטית מבוססות הדורשות SNPs הבודד בבדיקה שכותרתו יחידה ומציעים רגישות במקרה הטוב 10% כדי לזהות SNPs בדגימות המכילות גנומים מרובים (polygenomic), HRM מציע רגישות 2-5%. שינויים HRM, כגון בדיקות חסומות וריכוזי פריימר סימטריים כמו גם אופטימיזציה של טמפרטורות חישול הגברה להטיה כלפי PCR הגברה של אלל הקטין, להגביר עוד יותר את הרגישות של HRM. בעוד שיפור הרגישות תלוי בassay הספציפי, הגדלנו רגישויות זיהוי פחות מ 1% מאלל הקטין.

באזורים מתקרבים מיגור מלריה, גילוי המוקדם של מתעוררים או עמידות לתרופות מיובאות הוא חיוני ליחסי ציבורתגובת ompt. כמו כן, את היכולת לזהות זיהומי polygenomic ולהבדיל סוגים טפילים מיובאים ממאגרים מקומיים נסתרים יכולה להודיע ​​תוכניות בקרה.

כתב יד זה מתאר שינויים טכנולוגית התכה ברזולוציה גבוהה המגבירים עוד יותר את הרגישות שלו לזהות זיהומי polygenomic בדגימות מטופל.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות התעניינות מחודשת בשליטת מלריה ומיגור, מלריה נשארה נטל בעולם, עם כמעט מחצית מאוכלוסיית העולם של בסיכון לזיהום ויותר מ 550,000 מקרי מוות בשנה, ילדים במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה 1.

תוכניות בקרה ומיגור החדשות אלה נתמכים על ידי הרנסנס הגנומי, עם מספר גדול של טפילי מלריה רצף וניתחו למוטציות הקשורות לרגישות מופחתת סמים, אלימות מוגברת, ולמאפייני אוכלוסייה 2,3. פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד (SNPs) הוא בין וריאנטים הגנטיים הנפוצה ביותר שזוהו 4-7.

שיטות genotyping SNP ניידים מציעות באתר ומעקב אוכלוסייה בזמן אמת ומעקב 8. בנוסף לטביעת אצבע טפילים בודדים, "ברקוד המולקולרי 'משמש גם לזהות שינויים זמניים דרמטיים בתדירות אללכמו גם גודל שונות יעיל אוכלוסייה ומורכבות של זיהום 9.

בעוד זו קבוצה של SNPs אינפורמטיבי מותאמת בקלות לפלטפורמות genotyping רבות, ברזולוציה גבוהה נמסה (HRM) הניתוח מתאים במיוחד היטב לשדה מבוסס מחקרים, שבו פעולה וזיהוי של מוטציות רומן בעלויות נמוכות רגישות ופשוטה בהשוואה לרצף ואחר גישות הן אטרקטיביות בהגדרות משאבים לעניים.

HRM מתחיל עם תגובת פולימראז הסטנדרטי שרשרת (PCR) שמשלב צבע ניאון. ההודעה-PCR ניתוח המסת קובע את טמפרטורת התכת amplicon שיא; הבדל יחיד SNP בamplicon קצר יכול לגרום לטמפרטורת התכת שיא המשמעותית הבדלים (TM).

כמה חידודים לשיטה זו מציעים רזולוציה genotyping טוב יותר להבחין SNPs כולל בכיתה ד (AT) SNPs, ולזהות אללים מוטציה קלים בדגימות עם אללים מרובים הנוכחיים (polygזיהומי enomic). ראשית, מבחני לשלב בדיקות קצרות מרוכזות על אזור SNP בנוסף לקדימה הפוך פריימרים שנמצאים בריכוזים שונים. בדיקות אלה אינן חסומים מוגברים במהלך PCR, אבל להיקשר לגדיל מיוצר בעודף עקב ריכוזי פריימר סימטריים שלהגדיל את הייצור של מוצר הבדיקה התבנית. amplicons פעמיים תקועים הנפרד אלה בהיקף של הבדיקה קשורה לגדיל התבנית העודף הן ~ 20-30 נ"ב; שלהם ירדו באופן משמעותי בהשוואה לאורך כל amplicon העופרת (80-150 נ"ב) להבדלי Tm הרבה יותר גדולים הקשורים לבדיקת תבנית בסיס בודד או מרובה חוסר ההתאמה 10.

שנית, ההטיה אלל מוטנטי הגברה (MAAB) מורידה את טמפרטורת חישול התגובה להטיה כלפי תגובת אללים מוטציה הנוכחיות ביחסים נמוכים בזיהומי polygenomic. חישול בטמפרטורה מוגדרת בין Tms של התאמה מושלמת (wild-type) והבדיקה תואמת (מוטציה)ים. בטמפרטורה זו, מחייב אלל wild-type הוא יציב מספיק ההגברה שמתעכבת בהשוואה למקבילתה אי התאמה, ובכך הטיית ההגברה לאלל מוטנטי כאשר שניהם נמצאים במדגם יחיד 10.

עם חידודי HRM אלה, טכנולוגיה זו אפשרה מעקב של מקורות וזהות של טפילים הקשורים זיהומי מגיפה בדרום אמריקה 11 וזיהוי של מוטציות חדשות, בידול של SNPs מרובה ממוקם מייד ליד שני ברצף, ומוטציות קיימים בפחות מ 1 % מאללים בדגימות polygenomic 10.

רגישות מוגברת היא חשובה במיוחד באזורים מתקרבים מצב טרום-חיסול ואלו בסיכון לעמידות לתרופות מתעוררים. היכולת לזהות במהירות ובקלות טפילים מיובאים וSNPs קשורים ברגישות מופחתת באתר מודיעה מאמצי מעקב ותוכניות בקרה עלהיעילות של היישומים שלהם ונקודות חמות מזהה למאמצי מיגור מלריה וחיסול מוגברים. פרוטוקול זה מתאר שיטות לחסומות-בדיקה מבוססת וMAAB לרגישות genotyping HRM מוגבר.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה כולל כרכים וריכוזים ל96-גם צלחת, רצועות 8-צינור, ומערכות המבוססות על נימים (10 μl נפח תגובה); עם זאת, יכול גם להתבצע HRM במערכות המבוססת על צלחת 384 גם עם 5 μl נפח תגובה על ידי קנה מידה כל הכרכים בהתאם. מגוון של גילוי עבור רוב המערכות הוא 10 עמ 'לתבנית ה- DNA 10 ng.

1. הכינו תבניות

  1. להשיג דגימות Plasmodium falciparum ישירות מהדם שהתקבל מחולים שהשתתפו במחקרי שדה ואתר מאוחסן ככולו דם, תאי דם אדומים pelleted, או על נייר סינון.
    הערה: דוגמאות יכולות להיות גם לגדול במבחנה מותאמת תרבות; כמה זני מעבדה סטנדרטיים לניתוח ניתן להזמין ממלרית המחקר ועיון מגיב מרכז משאבים (MR4, ניתן להשתמש בדוגמאות ישירות מתאי דם אדום pelleted או תרבות או מופקים מהדם כל, תאי דם אדומים, או נייר סינון.
  2. ה- DNA שחולץ מנייר סינון או זנים מותאמים תרבות
    הערה: HRM הוא רגיש לריכוז מלח; הבדלי ריכוז בשל שיטות חילוץ משתנים יכולים להשפיע באופן משמעותי לטמפרטורת היתוך. בעוד מאגרים סופיים ספציפיים אינם גורם משמעותי להצלחה, להשתמש חיץ סטנדרטי נפוץ elution או resuspension (כלומר, מים, 1x טה ['טה הנמוך' או 'חיץ ההשעיה DNA': 10 מ"מ טריס-Cl, 0.10 mM EDTA] או 1x TE [10 מ"מ טריס-Cl, 1 mM EDTA]) עבור כל הדגימות כדי למנוע עיקולים להמיס חריגים או בלתי עקביים.
    1. הכן דילולים תבנית של 10 עמ -10 ng לμl בTe הסטנדרטי, TE, או מים לכל תגובת 10 μl.
  3. הגברה ישירה מתאי דם אדומים pelleted
    1. לקבוע parasitemia של תאי דם אדומים באמצעות מיקרוסקופ דק למרוח
      הערה: שיטות לקביעת parasitemia של תאי דם אדומים נגועים זמינות מהמרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC): http: //www.cdc.gov/dpdx/diagnosticProcedures/blood/microexam.html
    2. לדלל parasitemias מעל 0.5% 1: 400 בכיתת PCR מים, TE, או טה. להשתמש 3 μl לכל תגובת μl 5 10.
  4. בקרה
    הערה: HRM יכול לשמש לסריקה גנטית כדי לזהות רצף גרסאות באוכלוסייה 12; עם זאת, genotyping מדויק דורש החקירה סטנדרטים להכיל SNP-מאומת רצף. בונה או מלריה פלסמיד מבודדת עם ניתן להשתמש גנוטיפים ידועים. עבור מרבית היישומים, 3D7 (MR4 MRA-151) משמש כביקורת wild-type. בשל שונות בין-הטווח, תמיד כוללים בקרות חיוביות ושליליות.
    1. בקרות חיוביות: הכן 10 עמ '- 10 ng לדילולי 1 μl של פלסמיד או סטנדרטים עם גנוטיפים SNP-מאומת רצף.
    2. שליטה שלילית: מים כיתה השתמש PCR כביקורת לא-תבנית (NTC) לתגובות ההגברה.

ve_title "> 2. PCR הגברה

  1. הכן תערובת תגובה
    1. שכבת שמן מינרלים (אופציונליים). הערה: מערכות HRM חלקם פלטפורמות היתוך עצמאיות ואין לי מכסה מחומם כדי למנוע עיבוי ואידוי מוצר בהגברה.
      1. להוסיף שמן מינרלי אור 20 μl לכל צלחת היטב לפני טעינת תערובת התגובה.
    2. הכן 10x מניות עבודה של כל מבחני
      1. עיין בטבלה 1 ל10x ריכוזים מומלצים לעבוד המניה, כמו גם ריכוזים סופיים לgenotyping HRM מבוסס חסומה-בדיקה.
    3. הכן תערובת תגובה
      1. לכל אחד גם בצלחת או צינור, להוסיף 1 μl 10x עובד המניה קדימה הפוך פריימרים ובדיקות, 4.0 - תערובת 5.0 μl 2.5x או 2.0x HRM ראשי, תבנית μl 1, ומים כיתה PCR עבור הסכום כולל נפח תגובה של 10 μl .
    4. אטמי או צינורות
      1. השתמש של צלחת אופטיתeals להגברה מבוסס צלחת, כובעים אופטיים למערכות רצועה-מבוססת שפופרת, וכובעי פלסטיק למערכות המבוססות על נימים. הכיסוי בטוח להיות שלם וצלחות וכובעים אטומות לחלוטין ומאובטחים כדי למנוע אידוי בהגברה.
    5. דגימות ספין
      1. צלחות ספין 3 דקות ב1,800 XG כדי להסיר בועות אוויר ולהפריד שלבי נפט ומימיים אם נעשה שימוש בשמן מינרלים.
  2. פרוטוקול הגברה
    1. הנח צלחות תגובה או צינורות בCycler תרמית. פרוטוקולים סטנדרטיים לרוץ הגברה החסומה-בדיקה או MAAB (לוחות 2 ו -3, בהתאמה). שים לב להבדלים בטמפרטורת חישול בין שיטות אלה.

ניתוח 3. HRM

  1. לְהַמִיס
    1. לאחר ההגברה PCR, להמשיך להמסת ניתוח. למערכות עצמאיות היתוך שאינו מובנים בהגברה (למשל., מערכות BioFire ביטחון LightScanner), מחדשלהעביר צלחת מוגברת מCycler תרמית והמקום במכשיר HRM. מממשק תוכנת מערכת, להמס את הצלחת 40-80 מעלות צלזיוס כדי לייצר שתי פסגות היתוך הבדיקה וamplicon.
      הערה: כדי לחסוך זמן היתוך וניתוח, חלון ההיתוך יכול להתקצר כדי לכסות טווחי טמפרטורה רק לחקור או אזורי היתוך amplicon. לאחר התכה, יכולים להיות מחדש נמסו צלחות וצינורות במידת צורך ומאוחסן ב -20 ° C או 4 מעלות צלזיוס. צינורות זכוכית חנות רק ב 4 ° C כדי למנוע מצינורות פיצוח.
  2. ניתוח להמיס
    1. הסר דגימות שליליות
      1. בתוך תוכנת הניתוח, להסיר מדגימות ניתוח נוספות שלא להגביר או שיש לי פסגות משוננות היתוך. שים לב: לאחר בחירת המצב של ניתוח לקובץ הפעלה בודד, המכשיר באופן אוטומטי קבוצות דגימות החיוביות ושליליות. לפני genotyping כל תת-קבוצה, המשתמש יכול לשנות באופן ידני את השיחות.
        1. משני ההיתוךעקומה או שיא היתוך תצוגה, לחץ לחיצה ימנית על העקומות ליוסרה כדי לבחור אותם. לאחר בחירת הדגימות סווגו כהלכה, ללכת "ניו שיחה," בחר בקיבוץ המתאים, ולחץ על "החל שינוי."
    2. לנרמל
      1. מנגזר השלילית של הקרינה מנורמלת ביחס לטמפרטורת תצוגה (-dF / DT) ("Curves הבדל"), להעביר את הברים נורמליזציה להקיף את הבדיקה להמס אזור.
        הערה: הבדיקה להמס אזור הוא הטמפרטורה נמוכה יותר של אזורי שני ההיתוך. הברים הנורמליזציה צריכים להיות בבסיס של הפסגות להמיס.
    3. לחשב קבוצות
      1. לאחר נורמליזציה, להקצות קבוצות חישוב "בחרו באופן אוטומטי דגימות לקבוצות.
        במידת צורך, מחדש להקצות באופן ידני דגימות לקבוצות ספציפיות.
        הערה: יש תוכנת ניתוח חלק ספי רגישות גבוהות שלא ניתן לשנות; במקרים אלה, שלoftware עשוי להקצות דגימות לקבוצות שונות שויזואלית שייכת לאחר.
    4. הקצאת גנוטיפים
      1. הקצאת גנוטיפים לכל קבוצה המבוססת על סטנדרטים (בקרות חיוביות).
        1. לאחר שהמשתמש מאשר כי הקבוצות ממוחשבת נכונות (אם לא, כי שינויים נכונים נעשו תחת לשונית הקיבוץ על ידי בחירת דגימות סווגו כהלכה ובחירת הקבוצה הנכונה מתפריט התיבה ליד "ניו שיחה"), בחר באפשרות "שמות קבוצת עריכה "תחת" כרטיסיית הקיבוץ ".
        2. הזן את גנוטיפים של הסטנדרטים לתיבה בצבע המתאים (לדוגמא, אם יש 3d7 הסטנדרטי ידוע גנוטיפ והוא בקבוצה האדומה, הקבוצה האדומה יש גנוטיפ). לחץ על "אישור" ולשמור את התוצאות.
    5. תוצאות יצוא
      1. גנוטיפ היצוא קורא כגיליון אלקטרוני לניתוח אוכלוסיית מדגם נוסף.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן דמיינו נתונים במספר דרכים שונות, בהתאם לתוכנת הניתוח והמכשיר. בדרך כלל, עלילה של הנגזר השלילי של הקרינה מנורמלת ביחס לטמפרטורה (-dF / DT) נגד תוצאות טמפרטורה היא פשוטה ביותר המאפשר הדמיה פסגות היתוך וקביעת גנוטיפים.

חלון התכה מלא (40 ° C-80 ° C) יגרום לשני אזורי amplicon והתכת בדיקה. איור 1 מציג דוגמא של פסגות היתוך מנורמלות לשני האזורים. הגדרת חלון הניתוח רק את תוצאות בדיקה באזור בידול ברור של הפסגות המתאימות SNPs הספציפי (איור 2).

ניתוח מבוסס בדיקה מראה בבירור את נוכחותם של שני אללים כמו פסגות בודדות עם טמפרטורות התכה התואמות את הפסגות הומוזיגוטים SNP (איור 3).

איור 4 מראה progressi ש vely הפחתת טמפרטורת חישול בהגברת תוצאות (MAAB) בהטיה כלפי אלל מוטנטי (השיא בצד שמאל) (איור 4 א), וכתוצאה מכך הרגישות מוגברת לאלל מוטנטי באוכלוסייה של אללים מעורבים (איור 4).

figure-results-1

1. אזורי איור בדיקה והתכת amplicon. שרטוט הנגזר השלילית של הקרינה המנורמלת ביחס לטמפרטורה מעל תוצאות חלון היתוך רחבות בשתי הבדיקה (הטמפרטורה נמוכה יותר) ופסגות היתוך amplicon שניתן לנתח. (מעובד מתוך דניאלס et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

> figure-results-2
פסגות איור 2. בדיקה היתוך. התאמות מושלמת (בדרך כלל אללים wild-type) לגרום לפסגות גבוהות יותר התכה (אדום), בעוד שחוסר ההתאמה SNP טמפרטורות התכה נמוכות (אפורות). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3. Polygenomic נמס פסגות. כאשר שני אללים נמצאים במדגם, ניתוח HRM מבוסס בדיקה מייצג שני אללים כמו עקומות שני-שיא (כתום) עם פסגות התואמות את הדגימות בודדות אלל (אדום ואפור). (מעובד מתוך דניאלס et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) אנא לחץ כאן לצפייה בV גדול יותרersion של נתון זה.

figure-results-4
איור 4. הטיה ההגברה אלל מוטנטי (MAAB). א בהדרגה הורדת טמפרטורת חישול ההגברה הטיות תגובת שיא ההיתוך לשיא מקביל לאלל מוטנטי (טמפרטורה נמוכה יותר) במדגם polygenomic או polyallelic. ב MAAB תוצאות ברגישות HRM כדי לזהות אללים קטין נוכחים בפחות מ -1% בדגימות polygenomic או polyallelic. (חלק ב 'מותאם מדניאלס et al DOI:. 10.1128 / AAC.05737-11) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הטבלה 1. סט-אפ של תגובות הגברה היתוך ברזולוציה גבוהה המבוסס על בדיקה.

רְכִיב נפח למחדשפעולה (96-גם צלחת וצינור נימים) נפח לכל תגובה (384 גם צלחת) ריכוז סופי
HRM מיקס מאסטר 4-5 μl 2-2.5 μl 1 x
10 x פריימר העודף 1 μl 0.5 μl 0.50 מיקרומטר
10 x פריימר אחר 1 μl 0.5μl 0.1 מיקרומטר
10x Probe 1 μl 0.5 μl 0.40 מיקרומטר
מים בדרגת PCR 1-2 μl 0.5-1 μl
תבנית ה- DNA 1 μl 0.5 μl .01-10 Ng / μl
10 μl 5 μl

טבלה 2. standarתנאי הגברה היתוך ד ברזולוציה גבוהה.

טֶמפֶּרָטוּרָה זְמַן
לְהַחזִיק 95 מעלות צלזיוס 120 שניות
45 מחזורים 95 מעלות צלזיוס 30 שניות
C ° 68 * 30 שניות
מחזור 1 95 מעלות צלזיוס 30 שניות
28 מעלות צלזיוס 30 שניות

* טמפרטורה זו היא amplicon תלוי

טבלה 3. תנאי הגברה להטית ההגברה אלל מוטנטי.

טֶמפֶּרָטוּרָה זְמַן מחזורים שיעור רמפה מצב רכישה מצב ניתוח
לְפַגֵל 95 מעלות צלזיוס 30 שניות 1 20 אַף לֹא אֶחָד
מַחזוֹר 95 מעלות צלזיוס 2 שניות 55 20 אַף לֹא אֶחָד קְבִיעַת כָּמוּת
C ° 56 * 15 שניות 20 אֶחָד
לְהַמִיס 40 מעלות צלזיוס 0 שניות 0.3 אַף לֹא אֶחָד אַף לֹא אֶחָד
C ° 45 * 0 שניות רציף לְהַמִיס
C ° 90 * 0 שניות
אַף לֹא אֶחָד

* טמפרטורה זו היא amplicon תלוי ותופחת בעת ביצוע MAAB

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רציף HRM הוא צעד ניתוח פוסט-PCR; לכן, לדוגמא והתקנת assay דומה לפרוטוקולים PCR סטנדרטיים, עם שילוב נוסף של צבע intercalating פלורסנט המשמש למעקב אחר המעבר לדנ"א חד-גדילים במהלך שלב ההתכה ברזולוציה הגבוהה פעמיים תקועים. הגורם החשוב ביותר לניתוח HRM מוצלח הוא מוצר PCR חזק. עיצוב assay הוא מפתח, וכמה כלים מותאמים לעיצוב assay HRM זמינים מסחרי והאינטרנט 13. אורכי amplicon של 80-150 זוגות בסיסים עם נלווה ~ 20 זוג בסיס חסום בדיקות מרוכזות על SNP או SNPs עבודת אינטרס להבדיל SNPs כמו גם haplotypes של SNPs מרובה באזור הבדיקה. ניתן לחסום בדיקות או באמצעות "spacer C3 או אי-התאמת 2 בסיס זוג ב3 '3 סוף, המונעת הרחבה בהגברה. יכולות להיות מתוכננות בדיקות כדי להתאים את גדיל התבנית ווטסון או קריק; הבחירהתלוי בבדיקות אמפיריות כדי לקבוע שבדיקת עיצוב מייצרת פסגות היתוך מקובלות. פריימרים עודפים קדימה או לאחור משמשים לייצור מוצר הגברה חד-גדילים שanneals לבדיקות החסומות. אם הבדיקה מכילה את רצף הגדיל קדימה, אז לאחור תחל משמש בעודף, בדרך כלל ביחס של 1: 5, ולהיפך לבדיקות התואמות את הגדיל ההפוך.

באופן דומה, HRM עובד הכי טוב עם מוצר ה- PCR מספיק וחזק. אופטימיזציה תגובת PCR דורשת ג'לי PCR וagarose שיפוע או ניתוח Bioanalyzer כדי לקבוע טמפרטורות חישול אופטימליות. ריכוז תבנית יכול להיות מוגבר באמצעות שיטות כגון מראש הגברה, הגברה מרובבת מוטה של כל המטרות באמצעות ריכוז פריימר נמוך ומספרי מחזור להגדיל את ריכוז תבנית 13.

רק קומץ של מכשירים תואמים MAAB. תכונות התרמיות של צינורות זכוכית נימים משמשות in מערכות אלה להקל בשיטה זו. הקוטר הקטן הפנים של הנימים כמו גם העברת החום המהירה דרך הזכוכית מציעה בקרת טמפרטורה מחמירה יותר מאשר plasticware PCR הסטנדרטי, שבו יש שיעורי מעבר איטיים בין מחזורי חישול וdenaturation בשל תכונות בידוד התרמית של הפלסטיק. בשיטה זו, ניתן להפחית רגישויות זיהוי בין 2-5% בפחות מ 1% מאלל מוטנטי בתערובת של wild-type ואללים מוטציה 10.

HRM הוא כלי קליל, יעיל, וחסכוני עבור genotyping SNP במגוון רחב של הגדרות ויישומים רבים, ממעקב מחלה מדבק לסריקה ולריאנטים גנטיים לסרטן. כמה מכשירים אחרים, כגון ננו רוש ומערכות LightCycler (480 ו -96), כמו גם את הצעת מערכת PCR HRM בזמן אמת אקו בנוסף להגברה סטנדרטית, בזמן אמת, ופונקציונליות עותק-מספר. באמצעות מכונות גבוהה יותר תפוקה, barcoding HRM עולה lesים מ $ 0.50 לכל assay בידיים שלנו, הכולל את כל חומרים כימיים וחומרים מתכלה.

בהקשר המתואר כאן, יישומים מבוססים-שדה לאפשר מעקב אוכלוסייה בזמן אמת לשינויים הקשורים למאמצי שליטת מלריה, כוללים מגוון מופחת אוכלוסייה, זיהוי של סוגים מיובאים טפילים, ואת המראה ואת ההתפשטות של SNPs קשור ברגישות תרופה מופחתת. חידודים לשיטה להציע רגישות נוספת שימושית עבור ליידע התקדמות לקראת חיסול מלריה ומיגור.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים ביל ומלינדה גייטס לתמיכתה של התפתחות טכנולוגיה והכשרה.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
LightScanner Master MixBioFire DefenseHRLS-ASY-0003
שמן מינרלי קלSigmaM5904למערכות HRM מבוססות צלחת BioFire
Defense TETeknovaT0226
TeTeknovaT0221TE מאגר עם מים מופחתים
בדרגת EDTA PCRTeknovaW3330
פלסמודיום תקני falciparumMR4MRA-151, 156, 205, 330MR4.org מציע בחינם DNA
אור סורק אור גנומי פריימר תוכנה לעיצובBioFire Defenseתוכנה מסחרית לעיצוב בדיקת HRM
LightCycler 480 ברזולוציה גבוהה התכה מאסטר מיקסRoche4909631001לשימוש ב-LightCycler-480, -96 וננו. ריכוז 2x
ביואנלייזרAgilentG2938AAgilent 2100 bioanalyzer
LightCycler 2.0Roche3531414001מערכת מבוססת נימים עבור MAAB
LightCycler NanoRoche6407773001 Strip HRM והגברה
LightCycler 96Roche5815916001Strip-tube ו-Plate-based HRM והגברה
LightCycler 480Roche5015278001HRM מבוסס צלחת (96 ו-384- לוחות באר) והגברה
LightScanner-96BioFire DefenseLSCN-ASY-0011HRM מבוסס צלחת (96-well) 
LightScanner-384BioFire DefenseLSCN-ASY-0001HRM מבוסס צלחות (96 בארות)
צלחות 96 בארותRoche4729692001צלחות 96 בארות עבור HRM (צלחות LightCycler
384 בארותRoche4729749001384 בארות עבור HRM (LightCycler)
צלחות 96 בארותBio-RadHSP-9665 לוחות 96 בארות עבור HRM (LightScanner)
צלחות 384 בארותBio-RadHSP-3865 לוחות 384 בארות עבור HRM (LightScanner)
רצועות LightCycler 8 צינורות (שקופות)6327672001 של Rocheעבור HRM (Light Cycler 96 ו-Light Cycler Nano)
נימים LightCycler (20 μ l)נימים של Roche4929292001עבור HRM
אטמי צלחת אופטיתRoche4729757001מותגים אחרים עובדים גם הם
צינורות רצועות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization report 2013. , 1-286 (2013).
  2. Hayton, K., Su, X. -Z. Drug resistance and genetic mapping in Plasmodium falciparum. Current genetics. 54 (5), (2008).
  3. Neafsey, D. E., et al. Genome-wide SNP genotyping highlights the role of natural selection in Plasmodium falciparum population divergence. Genome biology. 9 (12), R171(2008).
  4. Volkman, S. K., et al. A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum. Nature. 39 (1), 113-119 (2007).
  5. Volkman, S. K., Neafsey, D. E., Schaffner, S. F., Park, D. J., Wirth, D. F. Harnessing genomics and genome biology to understand malaria biology. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 315-328 (2012).
  6. Manske, M., et al. Analysis of Plasmodium falciparum diversity in natural infections by deep sequencing. Nature. 487 (7407), 375-379 (2012).
  7. Auburn, S., et al. Characterization of within-host Plasmodium falciparum diversity using next-generation sequence data. PLoS ONE. 7 (2), e32891(2012).
  8. Daniels, R., et al. A general SNP-based molecular barcode for Plasmodium falciparum identification and tracking. Malaria Journal. 7, 223(2008).
  9. Daniels, R., et al. Genetic surveillance detects both clonal and epidemic transmission of malaria following enhanced intervention in Senegal. PLoS ONE. 8 (4), e60780(2013).
  10. Daniels, R. R., et al. field-deployable method for genotyping and discovery of single-nucleotide polymorphisms associated with drug resistance in Plasmodium falciparum. Antimicrobial agents and chemotherapy. 56 (6), 2976-2986 (2012).
  11. Olbadia, N., et al. Clonal outbreak of Plasmodium falciparum in eastern Panama. The Journal of infectious diseases. , (2014).
  12. Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R., Zhou, L. Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis. Nature protocols. 2 (1), 59-66 (2007).
  13. Mharakurwa, S., Daniels, R., Scott, A., Wirth, D. F., Thuma, P., Volkman, S. K. Pre-amplification methods for tracking low-grade Plasmodium falciparum populations during scaled-up interventions in Southern Zambia. Malaria Journal. 13, 89(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Resolution MeltingSNP GenotypingMalaria ParasiteAsymmetric Primer ConcentrationBlocked Probe HRMMutant Allele Amplification BiasPlasmodium FalciparumDrug Resistance MarkersPolygenomic Infection DetectionLow Concentration Allele Detection

Related Articles