Method Article

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

DOI:

10.3791/52840

⸱

August 16th, 2015

 , 
1Centre for Cancer Research, Westmead Millennium Institute for Medical Research and University of Sydney

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בbromodeoxyuridine ספיגה (BrdU) כדי לאפשר המעקב הזמני של תאים שהיו בשלב S בנקודה מסוימת בזמן. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדן מאפשרת ניתוח מפורט של גורלם של התאים בשלב S בתקופות מאוחרות יותר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה המאפשרת מעקב אחר תאים לאורך מחזור התא מבלי לדרוש סנכרון של התאים. השגת סנכרון תאים יכולה להיות קשה עבור מערכות תאים רבות. הנוהג המקובל הוא לחסום את התקדמות מחזור התא בשלב מסוים ולאחר מכן לשחרר את התאים המצטברים המייצרים גל של תאים המתקדמים במחזור ביחד. עם זאת, סוגי תאים מסוימים מוצאים את החסימה הזו רעילה וכתוצאה מכך מחזור תאים לא תקין, או אפילו מוות המוני. ניתן להשתמש בספיגת ברומודוקסיורידין (BrdU) כדי לעקוב אחר שלב מחזור התא של תאים בודדים. תאים משלבים אנלוגי תימידין סינתטי זה, תוך סינתזה של DNA חדש בשלב S. על ידי מתן BrdU לתקופה קצרה אפשר לסמן מאגר של תאים שהיו בשלב S בזמן שה-BrdU היה נוכח. לאחר מכן ניתן לעקוב אחר תאים אלה לאורך שארית מחזור התא ולתוך סבב השכפול הבא, מה שמאפשר לקבוע את משך שלבי מחזור התא ללא צורך לגרום לחסימת מחזור תא שעלולה להיות רעילה. ניתן גם לקבוע ולתאם את הביטוי של חלבונים פנימיים וחיצוניים כאחד בשלבים הבאים של מחזור התא. ניתן להשתמש בהם כדי לחדד עוד יותר את הקצאת שלב מחזור התא או להעריך את ההשפעות על תפקודים תאיים אחרים כגון הפעלת מחסום או מוות תאי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההערכה של תכונות מחזור תא ושינויים המתרחשים בתאים במהלך התקדמות מחזור התא היא יסוד להבנת היבטים רבים של ביולוגיה, במיוחד ביולוגיה של הסרטן. יש סוכנים רבים בפיתוח לטיפול בגידולים ממאירים השפעות עמוקות על התקדמות מחזור תא או לגרום למוות של תאים באמצעות תלויים-מנגנוני מחזור התא. כדי ללמוד דינמיקת מחזור תא או תאים בשלב מסוים של מחזור התא, זה רגיל לסנכרן תאים. עם זאת שיטות סנכרון יכולות להיות השפעה מזיקה על התאים הנלמדים, שעלול להיות בלבול התוצאות שהתקבלו. 1 ניתוח לאחרונה את השימוש בחלבונים מתויגים fluorescently שנמצאים רק בשלבים מסוימים של מחזור התאים התיר להתקדמות מחזור התא בתאים בודדים לאורך זמן 2, לעומת זאת....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בקו תא לוקמיה לימפובלסטית החריף NALM6 אבל יכול להיות מיושם על סוגי תאים אחרים.

1. פתרונות וריאגנטים

  1. RPMI מלא
    1. להוסיף 56 מיליליטר סרום עגל עוברי (FCS) ו -5.5 מיליליטר של 200 מ"מ L- גלוטמין לבקבוק 500 מיליליטר של מדיום RPMI-1640.
  2. BrdU פתרון במלאי

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי להשיג מגוון רחב של מידע. כמה יישומים המפורטות כאן.

    הערכה של משך מחזור התא

    כדי לקבוע את הזמן דרוש לתאים למעבר דרך מחזור התא, תאים נקצרים בנקודות זמן שונות הבאות דופק BrdU. המרווחים בין הערכות יכולים להיות מותאמים לתאים מסוימים להיות מנותח. שורות תאי hematopoietic הוערכו בכל שעה במשך 24 שעות בהיעדר טיפול תרופתי כדי לקב.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    היכולת לנתח את מחזור התא היא חשובה להבנת ביולוגיה של סרטן ואת מנגנון פעולה של שתי התרופות וגנים המשפיעים על שגשוג תאים וצמיחה. אמנם יש מספר רב של מבחני שדיווחים למדוד התפשטות תאים, רוב לספק מידה המציינת את מספר התאים בהווה בלבד. אלה כוללים מבחני המודדים תא מספר על ידי הדמיה ישירה וספירה, פעילות המטבולית או ריכוז ה- ATP. היתרון העיקרי של רבים מהשיטות האלה הוא שהם קלים יחסית לביצוע ונוחים לפורמטים microplate ואוטומציה, שהופכים אותם שימושיים לסינון כמויות גדולות של תנאים או תרכובות. .......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    למחברים אין מה לחשוף.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    העבודה מומנה על ידי אגודת הלוקמיה והלימפומה של ארה"ב (6105-08), מענק של מועצת הסרטן של NSW (13-02), מלגת מחקר בכירה של NHMRC (LJB) (1042305) ומענק פרויקט (1041614).

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    ערכת זרימה של APC BrdUBiosciences552598מכילה נוגדן BrdU, מאגר 7-AAD ו-BD Cytofix/Cytoperm
    (המכונה מאגר קיבוע)
    מאגר חדירות BD Cytoperm בתוספתBD Biosciences561651המכונה מאגר פרמביליזציה
    BD Perm/Wash BufferBiosciences554723המכונה מאגר כביסה
    DNaseSigmaD-4513
    BD פלקון 12 x 75  מ"מ צינורות FACSBD Biosciences352008
    BD Pharmingen מאגר כתמיםBD Biosciences554656
    BD LSR FORTESSA זרימה ציטומטרBD BiosciencesFORTESSA
    PipetmanGilsonP2, P20, P100, P1000
    RPMI 1,640 w/o L-Gln 500 מ"ללונזה12-167F
    DPBSLonza17-512F
    סרום בקר עובריFisherBiotecFBS-7100113
    L-גלוטמיןSigmaG7513-100ML
    5-Bromo-2′-דאוקסיורידיןסיגמאB5002-1G
    Falcon TC 150  ס"מ2 צלוחיות מאווררותBD Biosciences355001
    פיפטות 25  מ"לגריינר760180
    פיפטות ארסול 200  ומיקרו; lInterpath24700
    Aersol Pipettes 1  mlInterpath24800
    צנטריפוגהספינטרוןGT-175R
    CO2 אינקובטורקלסרC 150
    AF488 אנטי-היסטון H3 פוספו (Ser10) איתותתאי9708S
    פוספו-Chk2 (Thr68) (C13C1) איתות תאי mAb ארנב2197S
    פוספו-Chk1 (Ser345) ( 133D3)איתות תאי2348S
    NALM6 DSMZACC-128
    BD BD נוגדן mAb ארנב

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Banfalvi, G. Methods Mol Biol. Banfalvi, G. 761, Humana Press. New York, Dordrecht, Heidelberg, London. 1-23 (2011).
    2. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
    3. Harper, J. W., Elledge, S. J.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Cell Cycle ProgressionFlow CytometryBrdU UptakeS Phase TrackingCell Cycle AnalysisDNA SynthesisCell SynchronizationProtein ExpressionCheckpoint ActivationCell Death

    Related Articles