עיצוב ובנייה של תאי מטריקס המלאכותי (aECM) חלבונים מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; להנדסת רקמות עור

סיכום

טכנולוגיות רקומביננטיות אפשרו למעצבי חומרים ליצור חלבונים מלאכותיים חדשים עם פונקציות מותאמות אישית ליישומי הנדסת רקמות. לדוגמה, ניתן לתכנן חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מלאכותיים כך שישלבו תחומים מבניים וביולוגיים שמקורם ב-ECMs מקוריים. כאן, אנו מתארים את הבנייה והטיהור של חלבוני aECM המכילים חזרות דמויות אלסטין.

תקציר

טכנולוגיה רקומביננטית היא פלטפורמה רב-תכליתית ליצירת חלבונים מלאכותיים חדשים בעלי תכונות הניתנות לכוונון. בעשור האחרון דווח על חלבונים מלאכותיים רבים ששילבו תחומים פונקציונליים שמקורם בטבע (או יצרו דה נובו). בפרט, פותחו חלבוני מטריצה חוץ-תאית מלאכותית (aECM); חלבוני aECM אלה מורכבים מתחומים ביולוגיים שנלקחו מפיברונקטין, למינינים וקולגנים ומשולבים עם תחומים מבניים הכוללים חזרות דמויות אלסטין, חזרות משי וקולגן. עד כה, חלבוני aECM נחקרו באופן נרחב ליישומים בהנדסת רקמות ותיקון פצעים. לאחרונה, Tjin ועמיתיו פיתחו חלבוני aECM ספציפיים לאינטגרין המיועדים לקידום התקשרות והתפשטות של קרטינוציטים בעור אנושי. בעבודתם, חלבוני ה-aECM משלבים תחומי קשירת תאים שנלקחו מפיברונקטין, למינין-5 וקולגן IV, כמו גם חזרות דמויות אלסטין. הם הראו כי חלבוני ה-aECM שפותחו בעבודתם היו מועמדים מבטיחים לשימוש כסובסטרטים בעור מלאכותי. כאן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של חלבוני aECM כאלה כמו גם את תהליך הטיהור שלהם באמצעות המאפיינים המגיבים לחום של אלסטין.

מבוא

במשך כמה עשורים, חומרים סינתטיים וטבעיים נחקרו לשימוש כפיגומים בהנדסת רקמות^1,2. בעוד שחומרים סינתטיים כגון פולימרים מציעים שלמות מבנית מצוינת ותכונות מכניות מתכווננות, לעתים קרובות אין להם מספיק פעילות ביולוגית כדי לקדם צמיחה וחדירה של רקמות. מצד שני, לחומרים טבעיים כגון חלבוני מטריצה חוץ-תאית (ECM) יש פעילות ביולוגית מצוינת, אך יש להם מגבלות כמו שונות מאצווה לאצווה, פירוק מהיר ובעיות חיסוניות. ככזה, חלבונים רקומביננטיים רצויים, מכיוון שניתן לתכנן אותם כך שיחקו רק את התכונות הרצויות של חלבונים מקומיים^3,4.

הנדסת חלבונים רקומביננטיים זכתה להתעניינות נרחבת כפלטפורמה רב-תכליתית לתכנון וייצור של ביו-פולימרים חדשים של חלבוני....

פרוטוקול

1. שיבוט של רקומביננטי פלסמידים קידוד לחלבונים aECM

1. לעצב את רצף החומצות האמיניות של תחום הפונקציונלי (למשל, תחום מחייב תא וחוזר כמו אלסטין). אתרי הגבלת עיצוב איגוף הקצוות של תחומים הפונקציונליים כדי להקל על שימוש בתוכנה חופשית בהתאם להוראות תוכנת שיבוט-משנה (לדוגמא, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). כאן, בחר אתרי הגבלה ייחודיים שאינם קיים בתחום הפונקציונלי להגביל עיכול לאתרים המיועדים. בחר אתרי הגבלה המופיעים באתר השיבוט מרובה (MCS) של וקטור המארח (למשל, pET22b (+)) למשנה שיבוט.

תוצאות

בעיצוב חלבוני היתוך המכילים חזרות כמו אלסטין-, חשוב לשמור על תכולת האלסטין כוללת, מספיק חלק גדול של חלבון ההיתוך ^18. זו היא להבטיח כי מבנה חלבון ההיתוך שומר מאפיינים כמו אלסטין-, על מנת להשתמש ITC לטיהור. העיצוב והרצפים המתוארים בסעיף זה חלבוני aECM נלקחו במיוחד מהעבודה על ידי et al Tjin. ^14. בעבודה זו, שלושה חלבוני aECM היו משובטים בהצלחה לוקטור ביטוי pET22b (+). קשירה רציפה החלה ראשונה עם ligating חוזר אלסטין להכניס לתוך וקטור PET, ואחרי ה.......

דיון

הנדסת חלבון רקומביננטי היא טכניקה צדדי כדי ליצור חומרי חלבון רומן באמצעות גישה מלמטה למעלה. יכולים להיות מתוכננים חומרים מבוססי החלבון יש פונקציות מרובות, מותאם בהתאם ליישום של עניין. בשל התקדמות גוברת בטכנולוגיות שיבוט וביטוי חלבון, זה הפך להיות יחסית פשוט (וחסכוני) כדי ליצור מגוון של חלבונים מלאכותיים באופן שחזור וניתן להרחבה. תחום כמו אלסטין-כבר שולב במספר החלבונים המלאכותיים, שישמש כתג טיהור, כמו גם להעניק תכונות מכאניות. חלבונים מלאכותיים המכילים רצף כמו אלסטין-יכולים להיות מ.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
pET22b (+)	Novagen	69744	עם עמידות בפני אמפיצילין
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	אנטיביוטיקה נוספת - כלורמפניקול
איזופרופיל-בטא-D-תיוגלקטוזיד (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M תמיסת מלאי עם מים אוטוקלאבים, הופכים טריים לפני האינדוקציה.
ערכת QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106	ערכת בידוד פלסמיד
T4 ligase	ניו אינגלנד Biolabs	M0202S
Ampicillin	Affymetrix	11259
Chloramphenicol	Affymetrix	23660
Zymoclean™ ערכת שחזור DNA ג'ל	Zymo Research	D4001
XL10-gold strain	Agilent Technologies	200315

וקטורי ביטוי T7 של