עיצוב ובנייה של תאי מטריקס המלאכותי (aECM) חלבונים מ Coli Escherichia להנדסת רקמות עור

סיכום

טכנולוגיות רקומביננטיות אפשרו למעצבי חומרים ליצור חלבונים מלאכותיים חדשים עם פונקציות מותאמות אישית ליישומי הנדסת רקמות. לדוגמה, ניתן לתכנן חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מלאכותיים כך שישלבו תחומים מבניים וביולוגיים שמקורם ב-ECMs מקוריים. כאן, אנו מתארים את הבנייה והטיהור של חלבוני aECM המכילים חזרות דמויות אלסטין.

תקציר

טכנולוגיה רקומביננטית היא פלטפורמה רב-תכליתית ליצירת חלבונים מלאכותיים חדשים בעלי תכונות הניתנות לכוונון. בעשור האחרון דווח על חלבונים מלאכותיים רבים ששילבו תחומים פונקציונליים שמקורם בטבע (או יצרו דה נובו). בפרט, פותחו חלבוני מטריצה חוץ-תאית מלאכותית (aECM); חלבוני aECM אלה מורכבים מתחומים ביולוגיים שנלקחו מפיברונקטין, למינינים וקולגנים ומשולבים עם תחומים מבניים הכוללים חזרות דמויות אלסטין, חזרות משי וקולגן. עד כה, חלבוני aECM נחקרו באופן נרחב ליישומים בהנדסת רקמות ותיקון פצעים. לאחרונה, Tjin ועמיתיו פיתחו חלבוני aECM ספציפיים לאינטגרין המיועדים לקידום התקשרות והתפשטות של קרטינוציטים בעור אנושי. בעבודתם, חלבוני ה-aECM משלבים תחומי קשירת תאים שנלקחו מפיברונקטין, למינין-5 וקולגן IV, כמו גם חזרות דמויות אלסטין. הם הראו כי חלבוני ה-aECM שפותחו בעבודתם היו מועמדים מבטיחים לשימוש כסובסטרטים בעור מלאכותי. כאן, אנו מתארים את התכנון והבנייה של חלבוני aECM כאלה כמו גם את תהליך הטיהור שלהם באמצעות המאפיינים המגיבים לחום של אלסטין.

מבוא

במשך כמה עשורים, חומרים סינתטיים וטבעיים נחקרו לשימוש כפיגומים בהנדסת רקמות^1,2. בעוד שחומרים סינתטיים כגון פולימרים מציעים שלמות מבנית מצוינת ותכונות מכניות מתכווננות, לעתים קרובות אין להם מספיק פעילות ביולוגית כדי לקדם צמיחה וחדירה של רקמות. מצד שני, לחומרים טבעיים כגון חלבוני מטריצה חוץ-תאית (ECM) יש פעילות ביולוגית מצוינת, אך יש להם מגבלות כמו שונות מאצווה לאצווה, פירוק מהיר ובעיות חיסוניות. ככזה, חלבונים רקומביננטיים רצויים, מכיוון שניתן לתכנן אותם כך שיחקו רק את התכונות הרצויות של חלבונים מקומיים^3,4.

הנדסת חלבונים רקומביננטיים זכתה להתעניינות נרחבת כפלטפורמה רב-תכליתית לתכנון וייצור של ביו-פולימרים חדשים של חלבונים מלאכותיים. על ידי שליטה ברצף הגנטי, ניתן להתאים את הפונקציונליות של החלבונים המלאכותיים למגוון רחב של יישומים^5,6. בפרט, ניתן להתאים חלבוני מטריצה חוץ-תאית מלאכותית (aECM) כך שיהיו להם פונקציות מרובות ליישומים בהנדסת רקמות, התחדשות ותיקון פצעים^2,7. חשוב מכך, ההתקדמות בטכנולוגיות שיבוט וטיהור הגדילה את יכולת ההרחבה והפחיתה את עלות ייצור החלבונים הרקומביננטיים בצורה אדירה. ניתן לייצר כמויות גדולות של חלבונים רקומביננטיים בעלויות ייצור נמוכות שהן כלכליות לשימוש בקליניקה⁵.

חלבוני מטריצה חוץ-תאיים מלאכותיים פותחו ליישומי הנדסת רקמות^8-11. לדוגמה, טירל ועמיתיו תכננו שתל כלי דם בקוטר קטן באמצעות חלבונים מלאכותיים המכילים רצף פיברונקטין CS5 וחזרות דמויות אלסטין (ELP-CS5). הם הראו שתאי אנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVECs) היו מסוגלים להיצמד ולגדול על חומרים אלה¹². אחרים שילבו גם רצפים ביו-אקטיביים קצרים שנלקחו מפיברונקטין, קולגן, למינין, פיברינוגן וויטרונקטין וכן תחומים מבניים המחקים אלסטין, משי עכביש וקולגנים ליצירת מגוון חלבוני היתוך¹⁰. סרטים צולבים בתפזורת העשויים מחלבוני aECM מבוססי אלסטין הציגו גם תכונות מכניות דומות לאלו של אלסטין מקומי (מודולים אלסטיים נעים בין 0.3-0.6 מגה פיקסל)¹³. לאחר מכן, דווח גם על חלבוני aECM המכילים שברי פיברונקטין ארוכים יותר כמאיצים את ריפוי הפצעים במבחנה עקב זיקות קשירת אינטגרין מוגברות⁸.

לאחרונה פותחו חלבוני ECM מלאכותיים ספציפיים לאינטגרין על ידי Tjin ועמיתיו¹⁴. כל חלבון aECM מכיל תחום קשירת תאים ביו-אקטיבי שנלקח ממרכיבי ECM של עור אנושי^{מקומי 2,7,15}, כגון למינין-5, קולגן-IV ופיברונקטין. לדוגמה, הוכח כי האינטגרין α₃Β₁ קושר את רצף PPFLMLLKGSTR שנמצא בתחום הכדורי של שרשרת אלפא-3 למינין-5 (LG3)^16,17. בדוח שלהם, הם הראו כי קרטינוציטים אפידרמיסיים ראשוניים של עור אנושי מעדיפים לעסוק באינטגרינים שונים לקשירה לכל אחד מחלבוני ה-aECM, בהתאם לסוג תחום קשירת התאים הקיים.

חלבוני ה-aECM שנדונו בעבודתם של Tjin ואחרים מכילים תחומים דמויי אלסטין מצדדים {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG₎₂}₈ המעניקים גמישות המחקה את התכונות המכניות של עור האדם. בנוסף, שילוב שאריות ליזין בתוך החזרות דמויות האלסטין מגדיל גם את מסיסות החלבון הכוללת בממיסים מימיים. בנוסף, שאריות הליזין משמשות גם כאתרי קישור צולבים כדי להקל על היווצרות סרטי aECM צולבים¹². הכללת חזרות דמויות אלסטין ברצף חלבון aECM מאפשרת לטהר את החלבונים בקלות באמצעות מחזור מעבר הפוך (ITC)¹⁴. אלסטינים עוברים מעבר פאזה חד והפיך בטמפרטורה מסוימת המכונה טמפרטורת התמיסה הקריטית הנמוכה יותר (LCST) או טמפרטורת המעבר ההפוכה (T_t) ^18-20. אלסטינים וחזרות דמויות אלסטין מאמצים קונפורמציות סליל אקראיות הידרופיליות מתחת ל-LCST שלהם והופכים מסיסים במים, בעוד שמעל ה-LCST שלהם, אלסטינים מצטברים במהירות לחלקיקים בגודל מיקרון. מעברי פאזה כאלה הם הפיכים ולכן ניתן לנצל אותם כדי לאפשר טיהור קל של חלבוני aECM מבוססי אלסטין באמצעות טכניקת ITC²¹.

בעבודה זו, אנו מדווחים על הליך כללי לתכנון, בנייה וטיהור של חלבוני ECM מלאכותיים המכילים תחומי קשירת תאים ביו-אקטיביים, המאוחים לחזרות דמויות אלסטין. מתואר התהליך לתכנון ושיבוט הפלסמידים המקודדים לרצפי חומצות האמינו עבור חלבוני aECM. מתוארים השלבים הכרוכים בטיהור חלבוני ה-aECM באמצעות ITC. לבסוף, נדונות השיטות לקביעת הטוהר של חלבוני ה-aECM המתקבלים באמצעות אלקטרופורזה SDS-PAGE ו-Western Blotting.

פרוטוקול

1. שיבוט של רקומביננטי פלסמידים קידוד לחלבונים aECM

1. לעצב את רצף החומצות האמיניות של תחום הפונקציונלי (למשל, תחום מחייב תא וחוזר כמו אלסטין). אתרי הגבלת עיצוב איגוף הקצוות של תחומים הפונקציונליים כדי להקל על שימוש בתוכנה חופשית בהתאם להוראות תוכנת שיבוט-משנה (לדוגמא, http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). כאן, בחר אתרי הגבלה ייחודיים שאינם קיים בתחום הפונקציונלי להגביל עיכול לאתרים המיועדים. בחר אתרי הגבלה המופיעים באתר השיבוט מרובה (MCS) של וקטור המארח (למשל, pET22b (+)) למשנה שיבוט.
2. הפוך לתרגם את רצף חומצות אמינו לתוך רצף נוקליאוטידים באמצעות אתרים בחינם על פי הוראות תוכנה. (למשל, http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). קודונים להבטיח מותאמים E. מארחי coli.
3. גן של עניין יכול להיות purchasoligonucleotides אד מסחרי יחיד שנתקע (כלומר, אם oligonucleotides <100 זוגות בסיסים (BP)) ולבצע חישול DNA (ראה שלב 1.4) כדי להפחית את העלות. אחרת, לגנים גדולים יותר מ -100 נ"ב, הם יכולים לרכוש דרך חברות מסחריות.
4. חישול DNA של oligonucleotides
   1. לחשל oligomers DNA כדי להשיג את רצף הגן הרצוי. ממיסים oligonucleotides דנ"א במאגר oligomer DNA (10 מ"מ טריס: 2-אמינו-2- (hydroxymethyl) -propan-1,3-דיאול, pH 8.0, מסונן) לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μl.
   2. הוסף 4 μl של כל oligomer 32 μl של חיץ חישול DNA (10 מ"מ טריס, 100 מ"מ NaCl 100 ננומטר וMgCl ₂₎ כדי להשיג כוללת תערובת 40 μl.
   3. מרתיחים כוס מים באמצעות פלטה חשמלית ולטבול את התערובת ל5 דקות, 95 מעלות צלזיוס. הסר את הכוס ולקרר את כל להגדיר בתיבת קלקר O / N בהדרגה. Oligomers כבר מרותק ומוכנים לעיכול.
5. הוסף את אנזימי הגבלה המקביל לעכל oligomers מורפה (כלומר, המכונה להוסיף) ווקטור מארח (כלומר, pET22b (+)) בנפרד. השתמש במתכון הבא (1-2 מיקרוגרם של ה- DNA, 2 μl של כל אנזים הגבלה, 5 μl של חיץ 10x הגבלת אנזים, ומים עד לסך תערובת 50 μl) במשך 3-4 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: pET22b (+) וקטור פלסמיד הוא עמיד לאנטיביוטיקה אמפיצילין ומכיל 6x-תג בC-הסופי. 6x-התג הנוכחי בpET22b (+) מאפשר לנו להשתמש בנוגדנים מתויגים כדי לזהות את חלבון המטרה באמצעות מערבי סופג בשלב 7.
6. להוסיף צבע טעינת 6x לכל תערובת עיכול. הפעל את תערובות העיכול בנפרד כוללים סולם DNA בג'ל agarose DNA של 1.2% המכיל DNA כתם UV-ניאון עבור שעה 1 ב 100 V. דמיין 1.2% ג'ל agarose DNA עם הפנס אור UV.
7. פורסים את ג'ל לחלץ מוצרי DNA מתעכלים באמצעות ערכות טיהור ג'ל המסחרי. Elutדואר באמצעות הנפח המינימאלי לטור כדי להשיג ריכוז ה- DNA מינימום של 50-100 ng / μl.
8. מערבבים את הגן של ריבית על ידי רצף ligating להכניס DNA מתעכל (כלומר, חוזר אלסטין או תחומים תא מחייב מתקבלים על ידי חישול DNA) לתוך וקטור פלסמיד באמצעות האנזים T4 באמצעות המתכון הבא: (2 μl של וקטור, μl 1 של האנזים T4, 1.5 μl של חיץ קשירת T4, x μl של הכנס, 10.5 x-מים μl לסך תערובת 15 μl). דגירה את תערובת קשירה ב RT עבור שעה 2.
   הערה: ריכוז טוחן של וקטור להכניס צריכה להיות מגוון כדי לייעל את יעילות קשירה. נפח של הכנס תאר כx במתכון תלוי בריכוז ה- DNA eluted מצעד 1.7.
9. ההפשרה E. קולי תאי DH5α כימיים מוסמך (או כל זן שיבוט) על קרח. צלחות אגר 2xYT החם (טבלה 1) המכילה אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) עד 37 מעלות צלזיוס.
10. להפוך את התאים באמצעותהלם חום:
    1. Aliquot 50 μl של תאים המוסמכים לתוך צינורות נקיים, טרום צוננים מיקרו צנטריפוגות. μl פיפטה 5 (בין 100 עמ '100 ng) של תערובת קשירה לתאים, pipetting בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב. השאר את התערובת על קרח למשך 20 דקות.
    2. לטבול את צינור מיקרו צנטריפוגות המכיל התערובת של התאים באמבט מים 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות וחזר לעל קרח למשך 2 דקות. זמן משך הטבילה כדי למזער נזקי חום לתאים.
    3. הוסף 500 μl של תקשורת SOC (טבלת 1) לתוך צינור מיקרו צנטריפוגות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך שעה 1.
    4. מורחים 50 500 μl של תערובת תא / קשירה על צלחת אגר 2xYT כי כבר מראש לחמם RT, המכיל אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) ודגירה צלחות הפוכה ב 37 מעלות CO / N (12-16 שעות) .
11. למחרת, לאסוף מושבות DNA מהצלחת אגר באמצעות טיפים פיפטה נקיים. לגדול המושבות ב 5 מיליליטר של תקשורת 2YT (טבלה 1) המכיל אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) O / N ב 37 מעלות CO / N (12-16 שעות) עם (סל"ד רועד 225).
12. למחרת, השתמש בערכת בידוד פלסמיד כדי לחלץ את פלסמידים DNA לכל מושבה הרימה על פי הפרוטוקול של היצרן. Elute DNA עם 50 μl של מים.
13. לבצע בדיקה לעכל עם אנזימי הגבלת שימוש במתכון הבא: (DNA 5 μl, 0.2 μl של כל אנזים הגבלה, חיץ 1 μl 10x הגבלת אנזים ומים העליונים לסך תערובת 10 μl), דגירה של השעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס למסך למושבות שעשויות לכלול את הכנס ולרוץ על 1.2% ג'ל agarose DNA כמו בשלב 1.6.
    הערה: לאחר העיכול, קשירה מוצלחת צריכים תוצאות בשתי להקות, אחד עבור כל וקטור ולהוסיף שמתאימים למשקל המולקולרי שלהם (איור 1).
14. שלח הסבירות מושבות לרצפי DNA באמצעות אמרגן T7 קדימה ולהפוך פריימרים לsequencers המסחרי.

ילדה = "jove_title"> 2. הפיכתו של רקומביננטי פלסמיד למארח ביטוי בקטריאלי

1. מהתוצאה הרצף, בחר מושבה שכבר ligated בהצלחה ולהשתמש בפלסמיד דנ"א להפיכה ה מארח ביטוי coli.
2. ההפשרה E. זן ביטוי coli (BL21 (DE3) pLysS) על קרח. בינתיים, צלחות אגר חמות המכילות אמפיצילין (25 מיקרוגרם / מיליליטר) וchloramphenicol (34 מיקרוגרם / מיליליטר) לRT.
   הערה: פלסמיד pLysS הנוכחי בחיידקים להתאמץ BL21 (DE3) pLysS מכילה גן התנגדות chloramphenicol. פלסמיד pLysS מכיל גן מדכא T7 אשר בא לידי ביטוי constitutively להגביל ביטוי דולף של חלבון aECM. Chloramphenicol יש צורך לבחור לתאי חיידקים המכילים pLysS בתרבות.
3. חזור על שלב 1.10 להשיג הפך E. תאי coli כי הם מוכנים לבטא את החלבונים המלאכותיים. לעטוף צלחות אגר בParafilm ולאחסן הפוך ב 4 6; C עד חודש אחד.

3. ביטוי של חלבונים בקטריאלי aECM

1. עיין באיור 2, פיק מושבה מהצלחת אגר הפכה עם קצה פיפטה ולחסן לתוך 10 מיליליטר של תקשורת סטרילית נהדר מרק (TB) (טבלה 1) המכילה את שני אמפיצילין ואנטיביוטיקה chloramphenicol במבחנה. דגירה תרבות המתנע זה על 37 מעלות CO / N (12-16 שעות) עם רעד ב225 סל"ד.
2. העברה 10 מיליליטר של תרבות המתנע לתקשורת שחפת 1 ליטר טרי וסטרילי בתוספת אותה האנטיביוטיקה בבקבוק 3 L Erlenmeyer. דגירה התרבות על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 225 סל"ד במשך 2-3 שעות ולבחון את הצפיפות האופטית של התרבות (OD ₆₀₀₎ הגיע .6-0.8 ידי pipetting 1 מיליליטר של התרבות לתוך קובט ריק לקריאה. חוסכים 1 מיליליטר של התרבות לפני הגיוס לאפיון SDS-עמוד.
   1. כדי למדוד OD ₆₀₀ של תרבית התאים, להכין בקבוקון 1 של תקשורת שחפת בקובטלמדידה ריקה. בנפרד, להעביר 1 מיליליטר של תרבות מהבקבוק התרבות לקובט הריק חדש. מדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באמצעות ספקטרופוטומטר נגד השליטה ריקה בספיגה של 600 ננומטר.
   2. שמור את המדגם (לניתוח SDS-עמוד שלאחר מכן) על ידי העברת 1 מיליליטר של מדגם התרבות לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, צנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 2 דקות, ולמזוג supernatant.
3. לגרום לתרבות עם איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 מ"מ ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 225 סל"ד עוד 4 שעות. חוסכים 1 מיליליטר של תרבות בסוף האינדוקציה ב 4 שעות לאפיון SDS-עמוד.
4. קציר התאים על ידי העברת התרבות לבקבוקי צנטריפוגות 1 ליטר ו צנטריפוגות ב XG 12,000 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant, לשקול את כדורי תא וגלול בעשרה חיץ (1 M טריס, 0.01 M EDTA, 0.1 מ 'NaCl, pH = 8.0) ברמה של 0.5 גר' / מיליליטר.

4. תמוגה של תרבויות חיידקים

1. להקפיא את תרבות התא מחדש המושעה ב -80 CO ° / N. להפשיר את תרבות תאים קפואה באמבט מים ב RT או על קרח כדי lyse התאים. הוסף 10 מיקרוגרם / מיליליטר Deoxyribonuclease אני (DNase אני), 10 מיקרוגרם / מיליליטר Ribonuclease (RNase אני), ומיקרוגרם 50 / מיליליטר phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF) תוך הפשרה וhomogenize הפתרון עם ערבוב איטי.
2. לאחר כל תאי resuspended הם הפשירו, להתאים את הפתרון ל- pH 9.0 להגדיל את מסיסות החלבון במים ^12. הוסף 6 ירידת N NaOH חכמה עם ערבוב על קרח כדי להשיג עקביות הומוגנית. Lyse על ידי שיבוש קולי במשך 20 דקות על קרח באמצעות קצה 2 מ"מ קוטר שטוח, 5 שניות דופק.
3. צנטריפוגה פתרון התא ב XG 12,000 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant ל, בקבוק ריק נקי וחנות על 4 מעלות צלזיוס לטיהור מאוחר יותר.
4. בינתיים, resuspend התא גלולה שוב עם עשרה חיץ ומחדש הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. לתמוגה מלאה התא, הקפאה / הפשרה חוזרת וsonication תהליך עד שלוש פעמים. חסוך 20 lysate תא μl לאפיון SDS-עמוד.

5. טיהור החלבונים aECM שימוש הפוך מעבר רכיבה על אופניים

1. איסוף lysate התא מהשלב 4.3 ולהמשיך לטהר את חלבוני aECM באמצעות ITC, דומה לזה המשמש לטיהור חלבונים מבוסס אלסטין ^21. מחזורים ייעשו עם הטמפרטורות שונות שהם 4 ° C (המכונה "קר") ו- 37 ° C (המכונה "חמים") מחזורי בהתאמה.
2. פיצול lysate התא לתוך 50 מיליליטר בקבוקי צנטריפוגות, וצנטריפוגות ב 40,000 XG לשעה 2 ב 4 מעלות צלזיוס. המראה של התא גלולה צריך להיות בצבע חום כהה ולחפש נזלת.
3. הסר את supernatant ידי pipetting כדי לקבל הפרדה נקייה מגלולה. לאסוף את supernatant בבקבוקי צנטריפוגות נקיים ולהוסיף NaCl לריכוז סופי של 1 M (עד למקסימום של 3 מ '). חםהפתרון ל -37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 עם רעד ב225 סל"ד.
   הערה: תוספת של NaCl תפעיל את המעבר של רכיב אלסטין של הצבירה גורמת aECM. Supernatant יהפוך עכור. אם ריכוז החלבון הוא גבוה מספיק, חלבון מוקצף לבן ניתן לראות בצדדים של בקבוק צנטריפוגות.
4. צנטריפוגה supernatant משלב 5.3 ב40,000 XG לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant. לרסק את הכדור בעזרת מרית מתכת וresuspend הביטים גלולה בautoclaved מים מזוקקים קר כקרח (50 מ"ג / מיליליטר) עם O ערבוב נמרץ / N ב 4 ° C באמצעות סרגל מערבבים מגנטי וצלחת. גלולה צריכה להיות נמסה לגמרי.
5. חזור על שלבים 5.2-5.4 לשלוש עד חמש פעמים נוספות כדי להשיג טוהר גבוה יותר של החלבון.
6. לאחר המחזור האחרון של טיהור, desalt פתרון החלבון על ידי dialyzing זה נגד מים מזוקקים ב 4 מעלות צלזיוס. Dialyze פתרון חלבון נגד מים במשך 2-3 ימים עם שינויים במים כל 4שעות או 8 שעות לO / N. חסוך 20 μl של החלבון המטוהר לSDS-PAGE וLyophilize שאר החלבון והחנות המטוהרים ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.

6. אפיון של החלבונים aECM שימוש SDS-PAGE אלקטרופורזה

1. הכן 12% ג'ל SDS-עמוד (אם המשקל המולקולרי גדול, להשתמש בג'לים SDS-עמוד 8% להפרדה טובה יותר). הוסף חוצץ טעינת SDS 2x מדגם זה, לחמם את הדגימות למשך 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס ולהפעיל דגימות על הג'ל לשעה 1 ב 100 V או עד סולם החלבון המתאים למשקל המולקולרי של חלבון aECM מגיע אמצע ג'ל.
2. אחזר את הג'ל מSDS עמוד-להגדיר ולהוסיף Coomassie כתם כחול מבריק (טבלה 2) עם נפח כדי להטביע את הג'ל לשעה 1 בצלחת פטרי. ג'ל שטיפה בתמיסת destaining (טבלה 2) במשך 5 דקות על כיסא נדנדה. לשנות את פתרון destaining, וימשיך destain ג'ל עם נדנדה עד שהרקע של tהוא ג'ל הופך ברור. להקות חלבון צריכה להיות ברור לעין.
3. להשוות את מעמדו של חלבון המטרה נגד סולם החלבון כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של חלבון המטרה.
4. כדי לאשר את קיומו של חלבון המטרה נוסף, לבצע מערבי סופג כמו בשלב 7.

7. אפיון של החלבונים aECM שימוש סופג מערבי

1. הפעל את הדגימות על 12% ג'ל SDS-עמוד כאמור בסעיף 6 ללא הכתמה.
2. חותך קרום nitrocellulose לגודל מעט גדול יותר מג'ל SDS-עמוד. חותך 4 חתיכות של נייר סינון באותו הגודל.
3. חתיכה אחת רטובה של נייר סינון עם הצפת העברה המערבית (20% מתנול / V V, 25 מ"מ טריס, 190 מ"מ גליצין, pH 8.3), הנח את ג'ל SDS-עמוד על גבי נייר הסינון, ואחריו פיסת נייר סינון נוספת , אז קרום nitrocellulose וסופי שתי חתיכות של נייר סינון אחרות. ודא ההגדרה כולו שקועה עם חיץ העברה מערבי מספיק.
   הערה: ג'ל והקרום לא צריך להיות במגע בנקודת זמן זו כחלבונים יכולים להיקשר לממברנה במגע.
4. העבר את החלבונים על הממברנה nitrocellulose על ידי הצבת שני מסמכי מסנן ליחידה מערבית חצי יבש העברה, ואחריו את קרום nitrocellulose, ומניח בזהירות את ג'ל SDS-עמוד ובעל הקרום, ולבסוף מניח את נייר הסינון האחרון שני הרטוב ב ג'ל SDS-עמוד. הפעל את ההעברה המערבית ב 45 מילי-אמפר, 30 דקות. הוסף חוצץ אם מתח גבוה מ -30 V.
   הערה: רצוי למקם את ג'ל SDS-PAGE על הממברנה עם ניסיון אחד ולהימנע מהעברת ג'ל שלא לצורך על קרום חלבונים יכולים להיקשר לממברנה במגע.
5. אחזר ולחסום את קרום nitrocellulose עם פתרון החסימה (5% חלב דל שומן בpH 7.4 PBS, מסונן עם נייר סינון) לשעה 2 ב RT. השלך חיץ החסימה ולהוסיף PBS לשטוף.
   הערה: שינוי לכפפות חדשות, כדי למנוע זיהום הקרום עם הגנה של מחזור לא רצויתוספות.
6. דגירה הנוגדן הראשוני נגדו בדילול PBS ב 1: 1,000 ב RT עבור שעה 1 עם נדנדה. הכן תערובת בנפח שיכול להטביע את כל הקרום, למשל, עם יחס דילול 1: 1,000, להוסיף 1 μl של נוגדן (ריכוז מניות: 1 מ"ג / מיליליטר) עד 999 μl PBS לתערובת כוללת של 1 מיליליטר.
7. יש לשטוף את הממברנה עם 5 מיליליטר של PBST (PBS עם 0.1% Tween20).
8. דגירה עם נוגדנים משני מצומדת לperoxidase סוס-צנון (HRP) בדילול PBS ב 1: 5000 ב RT עבור שעה 1 עם נדנדה. הכן תערובת בנפח שיכול להטביע את כל הקרום, למשל, עם יחס דילול 1: 5,000, להוסיף 1 μl של נוגדן (ריכוז מניות: 1 מ"ג / מיליליטר) ל4,999 μl PBS לתערובת כוללת של 5 מיליליטר.
9. לשטוף את הממברנה עם 5 מיליליטר של PBST וחזור פעמיים.
10. החל מצע chemiluminescent הקרום בהיקף כדי לכסות את הקרום ודגירה על ידי ביצוע ההוראות למצע בשימוש.
    הערה: הרגישות של המצע לגילוי חלבון עשויה להשתנות, אנו ממליצים מצע עם רגישות מקסימלי לאותות נמוכים מאוד במקרה הגדלת ריכוז נוגדנים אינו מגביר אותות.
11. ללכוד את אותות chemiluminescent באמצעות תרמי מבוסס מצלמת CCD. התאם את יחס דילול נוגדן הראשוני ומשניים אם אותות חלשים ואינם ספציפיים. דגירה ארוכה יותר בחסימת פתרון אם אות רקע היא גבוהה.

תוצאות

בעיצוב חלבוני היתוך המכילים חזרות כמו אלסטין-, חשוב לשמור על תכולת האלסטין כוללת, מספיק חלק גדול של חלבון ההיתוך ^18. זו היא להבטיח כי מבנה חלבון ההיתוך שומר מאפיינים כמו אלסטין-, על מנת להשתמש ITC לטיהור. העיצוב והרצפים המתוארים בסעיף זה חלבוני aECM נלקחו במיוחד מהעבודה על ידי et al Tjin. ^14. בעבודה זו, שלושה חלבוני aECM היו משובטים בהצלחה לוקטור ביטוי pET22b (+). קשירה רציפה החלה ראשונה עם ligating חוזר אלסטין להכניס לתוך וקטור PET, ואחרי ה...

דיון

הנדסת חלבון רקומביננטי היא טכניקה צדדי כדי ליצור חומרי חלבון רומן באמצעות גישה מלמטה למעלה. יכולים להיות מתוכננים חומרים מבוססי החלבון יש פונקציות מרובות, מותאם בהתאם ליישום של עניין. בשל התקדמות גוברת בטכנולוגיות שיבוט וביטוי חלבון, זה הפך להיות יחסית פשוט (וחסכוני) כדי ליצור מגוון של חלבונים מלאכותיים באופן שחזור וניתן להרחבה. תחום כמו אלסטין-כבר שולב במספר החלבונים המלאכותיים, שישמש כתג טיהור, כמו גם להעניק תכונות מכאניות. חלבונים מלאכותיים המכילים רצף כמו אלסטין-יכולים להיות מ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
pET22b (+)	Novagen	69744	עם עמידות בפני אמפיצילין
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	אנטיביוטיקה נוספת - כלורמפניקול
איזופרופיל-בטא-D-תיוגלקטוזיד (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M תמיסת מלאי עם מים אוטוקלאבים, הופכים טריים לפני האינדוקציה.
ערכת QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106	ערכת בידוד פלסמיד
T4 ligase	ניו אינגלנד Biolabs	M0202S
Ampicillin	Affymetrix	11259
Chloramphenicol	Affymetrix	23660
Zymoclean™ ערכת שחזור DNA ג'ל	Zymo Research	D4001
XL10-gold strain	Agilent Technologies	200315