מאמר שיטה

שיטה להשתקה מרחוק עצבית פעילות במכרסמים בשלבים בדידים של למידה

DOI:

10.3791/52859

⸱

22 ביוני 2015

 , 
1Department of Neuroscience, Oberlin College

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתיק באופן זמני ומרחוק פעילות עצבית באזורי מוח נפרדים בזמן שחולדות עוסקות במשימות למידה וזיכרון. הגישה משלבת פרמקוגנטיקה (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) עם פרדיגמה התנהגותית (התניה חושית) שנועדה להבחין בין מרכיבים שונים של למידה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד באופן זמני ומרחוק כדי להשתיק את הפעילות עצבית באזורי המוח בדידים בעוד בעלי החיים עוסקים במשימות למידה וזיכרון. הגישה משלבת Pharmacogenetics (מעצב-רצפטורים-הופעל באופן בלעדי על ידי מעצב-בסמים) עם הפרדיגמה התנהגות (נפשית מראש חושי) שנועד להבחין בין צורות שונות של למידה. באופן ספציפי, משלוח בתיווך נגיפי משמש להביע קולט G-חלבון מעכב מהונדס גנטי בשילוב (מעצב קולט) לאזור במוח בדיד במכרסמים. שלושה שבועות לאחר מכן, כאשר רמות ביטוי קולט מעצב הן גבוהות, סוכן תרופתי (מעצב התרופות) מנוהל מערכתי 30 דקות לפני פגישת התנהגות ספציפית. יש תרופת זיקה לקולטן מעצב ובכך גורמת לעיכוב של נוירונים המבטאים את הקולטן המעצב, אבל אחרת אינרטי מבחינה ביולוגית. האזור במוח נשאר מושתק במשך 2-5 שעות (depenדינג על המינון ודרך המתן). עם השלמת הפרדיגמה ההתנהגות, רקמת המוח נבחנת למיקום נכון וביטוי הקולטן. גישה זו שימושית במיוחד לקביעת התרומה של אזורים במוח אדם לרכיבים ספציפיים של התנהגות וניתן להשתמש בו על פני כל מספר של פרדיגמות התנהגות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אתגר מרגש בתחום מדעי מוח התנהגות הוא לקבוע את מצעים העצביים של התנהגויות מורכבות. מספר הטכניקות כגון נגעים קבועים, איון מוח זמני באמצעות שתלי cannulae וoptogenetics להיות מועסק לזהות את תרומתם של אזורים במוח הבדידים למשנה של התנהגויות מורכבות. בעוד גישות אלה להודיע ​​ההבנה ספציפיות האזורי שלנו בלמידה, כל טכניקה היא לא בלי מגבלות. באופן ספציפי, נגעים קבועים מתבצעים בדרך כלל לפני בדיקות התנהגותיות, כך ההשפעות שלהם נמצאות בכל משך הזמן של הפרדיגמה. מחקרי Cannulation שכרוכים בהצגת inactivator טווח קצר עצבי (למשל, tetrodotoxin) יכול לייצר נזק משמעותי לרקמת מוח ויכול לגרום ללחץ בנושאים רק לפני בדיקות התנהגותיות. יתר על כן, איון באמצעות cannulation מוגבל לאזור של רקמה המקיף אתקצה cannulae. לבסוף, בעוד optogenetics מציע מגוון רחב של גמישות לשליטה הזמנית של פעילות באזורי מוח מסוימים, זה העלות ותובענית מבחינה טכנית.

ניתן להתגבר על המגבלות האלה באמצעות גישה pharmacogenetic (מעצב-הופעל באופן בלעדי על ידי מעצב-בסמים רצפטורים, DREADDs) 1,2. חשוב לציין, בזמן שמושג Pharmacogenetics הוא מתוחכם, ביצוע הטכניקה הוא פשוט. בדומה לשיטות ניתוחיות stereotaxic מסורתיים הכוללות עירוי של רעלן (למשל, NMDA, חומצת ibotenic) לאזורים במוח בדידים, טכניקה זו כרוכה בהחדרת וירוס adeno הקשורים (AAV) שמכיל קטע DNA לקולטן G- חלבון מעכב שונה בשילוב (HM4Di; קולט המעצב) לאזור של עניין של מכרסמים מעבדה סטנדרטיים (ראה איור 1). הווקטור הנגיפי מכיל גם כתב ניאון (mcitrine). ברגע שהתאגד בלתאים, קולט המעצב (וחלבון כתב) הם מקסימאלי הביעו ~ 3 שבועות לאחר עירוי-ויכולים להיות מופעל באופן סלקטיבי במשך 2-5 שעות על ידי ממשל מערכתי של תרופת מעצב אחר אינרטי מבחינה ביולוגית, קלוזאפין-N-תחמוצת (CNO) 1 , 3. בגלל ניסוי ניחן בשליטה זמנית מדויקת, עדיין רחוקה מעל הפעילות עצבית באזורים מסוימים במוח, Pharmacogenetics משלב טוב במיוחד עם פרדיגמות התנהגות שנערכות בשלבים מרובים. בדוגמא זו, התרומה של קליפת retrosplenial (RSC) ללמידה בהשוואה לתפקידה בלמידה הפבלובית-גירוי גירוי, לעומת זאת, השילוב של גישות הוא גם מתאים לכל מספר של שאלות שמבקשים לזהות כיצד ספציפי אזורים במוח תורמים ל התנהגות מורכבת.

בנוסף, בזמן שאינו מתואר בפרוטוקול הנוכחי, ניתן להשתמש בגישות ויראלי ומהונדסות כדי להשיג ביטוי DREADD סוג ספציפי תא 2. כפי שים הגלום בפרדיגמות התנהגות שכרוכות תרופתיים ו / או סוגים אחרים של מניפולציות ניסוייות, שיקול זהיר של תכנון ניסוי וניתוח כמותי שלאחר מכן נדרש כאשר העסקת גישת DREADD. הנסיינים חדשים לגישת DREADD מכונים סקירה מקיפה של טכנולוגית DREADD הנוכחית 2.

בכל יום, אורגניזמים ללמוד על גירויים חדשים ואירועים ומערכות היחסים שלהם אחד לשני. גם בסביבה מוכרת, כגון בית, אחד הוא מהיר כדי לזהות שינויים במערכות היחסים בין גירויים, כי שינויים אלה עשויים להיות חזוי של אירועים משמעותיים. גירוי-גירוי כזה (כלומר, יחסים) למידה כרוכה איחוד של גירויים מרובים ובאופן מסורתי נקשר עם ההיפוקמפוס, שמתגורר במרכז בתוך האונה הטמפורלית מדיאלית 4. עם זאת, ההיפוקמפוס אינו קיימת ולא לפעול בבידוד; אזורים בקליפת המוח הן בתוך ומחוץצד של האונה הטמפורלית מדיאלית לספק מידע חושי קריטי להיווצרות בהיפוקמפוס 5-7. מחקרי נגע קבועים מסורתיים לספק ראיות משכנעות למעורבותם של מספר האזורים בקליפת המוח (למשל, הקורטקס retrosplenial, postrhinal וentorhinal) בלמידה בהיפוקמפוס תלוי אך מוגבלים ביכולתם להבחין בתפקיד של אזור מסוים בשלבים בדידים למידת 8-10.

הפרוטוקול הנוכחי בוחן את ההשערה שRSC הכרחי ללמידת גירוי-גירוי על ידי השתקת RSC בשלב אחד של פרדיגמה נפשית מראש חושי 3-שלב 11,12. בקצרה, חולדות לקבל עירויים של AAV שמכיל את הקולטן המעצב ו~ 3 שבועות לאחר מכן מנוהלים סמים מעצב (CNO) 30 דקות לפני תחילת בדיקות התנהגותיות. בפרוטוקול הנוכחי, חולדות ניסוי לקבל CNO במהלך השלב הראשון של בדיקות (כאשר ליר גירוי-גירוינינג מתרחש) והם מקבלים רכב במהלך 2 השלבים הבאים של בדיקות. כדי לשלוט על השפעות מכוונות של CNO על התנהגות, להחדיר חולדות עם קולט המעצב (hM4Di) ולהזריק עם רכב במקום CNO. כדי להסביר את תופעות כלליות של עירוי נגיפי וביטוי הקולטן, להחדיר וירוס שליטה שאינו מכיל את הקולטן המעצב ולנהל CNO.

מספר קפסיד השונים של AAV משמש כדי לספק חומר גנטי. הנחיות NIH הנוכחיות למחקר מעורב רקומביננטי או מולקולות סינטטיים שומרת AAV ש( כל קפסיד) ומבני AAV רקומביננטי או סינטטיים, שבו transgene לא לקודד או מוצר גן פוטנציאל סרטני או מולקולת הרעלן ומיוצרים בהעדר וירוס עוזר, דורש BSL-1 אמצעי זהירות (נספח B-1. סיכון קבוצת 1 (RG1) סוכנים) 13. מספר ביקורות הנוגעות למבנה AAV, שירות ובטיחות זמין 14,15. יש לציין, אם כי, בשל חששות הנוגעים ל16,17 ופוטנציאל מנגנונים אפשריים רבייה מסרטנת 18-20 במכרסמים ל, חלק ממוסדות דורשים שימוש ב- 2 מנהלת הליגה אמצעי זהירות בעת עבודה עם AAV. ודא מנהלת הליגה המתאימה לפני השימוש על ידי התייעצות עם ועדות פיקוח במוסדות בודדים שבי המחקר ייערך, המרכז לבקרת מחלות והנחיות NIH למחקר מעורב רקומביננטי DNA מולקולות 13 בעת שימוש בוקטורים ויראליים למניפולציה גנטית בארצות הברית. הגנה אישית, הכשרת חוקר, בלימת וקטור, טיהור, סילוק חומרי חיטוי, ובעלי חיים לאחר הזרקת דרישות דיור שצוינו על ידי הנחיות אלה. בנוסף, להתייעץ ועיקבו אחרי מוסדי טיפול בבעלי חיים מתאים ובהתאם להנחיות וועדה או הנחיות ועדת ביקורת מוסדיות שווה ערך על מנת להבטיח את הטיפול, הממשל וסילוק של AAV הבטוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בבעלי החיים מאושר על ידי מכללת אוברלין המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש והנו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחי המעבדה 21.

1. הכנה לעירוי ויראלי

הערה: פרוטוקול זה משתמש BSL-1 אמצעי זהירות. כאשר העסקת BSL-2 באמצעי זהירות, חלוק מעבדה חד פעמי, כפפות, נעליים מכסה, הגנות העין והנשמת חלקיקים (הקלד N95) נדרשים. כל אנשי טיפול BSL-2 תרכובות חייבים להיות בכושר נבדקו להנשמת חלקיקים על ידי סוכנות לבריאות הציבור מקומית. עיין אפלולי וMajewska (2010) 22 לפרטים נוספים על טיפול ואחסון של וקטורים ויראליים.

  1. עם השימוש ראשון, aliquot וחנות וירוס שאינו בשימוש ב 20 צינורות microcentrifuge μl כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.
  2. הכן את משטח העבודה על ידי הסרת כל חפצים מיותרים וחיטוי את פני השטח עם 70% אתנול. הכן 10% פתרון אקונומיקה לdecontaminating פסולת AAV. מניחים כוס מלאה של פתרון אקונומיקה ומזרק 10 μl סטרילי על גבי משטח העבודה. מניחים את צינור microcentrifuge עם AAV במכל עם קרח כתוש בלהגדיר.
  3. מניחים את צינור microcentrifuge עם הווירוס לסגן ספסל סטנדרטי. לטעון מזרק 10 μl עם לפחות 4 μl של AAV. הקפד לא לכופף את קצה המזרק נגד התחתון של צינור microcentrifuge במהלך טעינה. ודא שאין בועות אוויר בμl 4 של פתרון AAV במזרק.
  4. השלך את צינור הווירוס הריק בכוס המכילה אקונומיקה 10%. אחסן חלקים שאינם בשימוש של הנגיף כמפורט על ידי הספק.
  5. להוסיף אקונומיקה 10% נוספות למכל הפסולת, ופסולת תאפשר לשבת במשך 30 דקות לפני השלכת הפסולת הנוזלית לחטא.
  6. השלך את כל ציוד מגן ופסולת פלסטיק במכל Biohazard כפי שהורה הנחיות מוסדיות. דקוntaminate כל ציוד או משטחים שבאו במגע עם הנגיף באמצעות אקונומיקה 10%.

2. ניתוח

  1. הכן את אזור הניתוח על ידי הנחת נייר סופג ספסל תחת מנגנון stereotaxic ועל חלל סמוך, המיועד כטיפול אזור וירוס ייעודי.
    1. מניחים 10% מיכל פסולת אקונומיקה באזור טיפול וירוס הייעודי ליד המכשיר כירורגי.
  2. לגרום לרמה קבועה של הרדמה ולהכין את החולדה לניתוח.
    1. מניחים את החולדה לתא אינדוקציה המכיל תערובת של גז isoflurane (טווח של 1 עד 3%) וחמצן (100% בכ 1 ליטר / דקה) עד שיש איבוד ההכרה וחוסר התנועה תכליתית ברוטו. לשמור על ההרדמה isoflurane לאורך ההליך הכירורגי.
    2. לאחר 6 הרדמה עמוקה מושגת, לגלח את העכברוש מבין העיניים למעט מאחורי האוזניים.
    3. מניחים את החולדה בחזרה לתא האינדוקציה ל1-3 דקות נוספות.
    4. ודא שמערכת ההרדמה isoflurane מחוברת לחרטום של ניתוח stereotaxic. פתח את השסתום על צינור isoflurane להתחיל את זרימת isoflurane לstereotax. לשמור על isoflurane וחמצן ברמות שצוינו לעיל.
    5. מניחים את החולדה במנגנון stereotaxic ידי הבטחת הפה על הבר הביס ואבטחת הברים האוזן.
    6. החל סיכה עין בעיניים ובטאדין לאתר כירורגית לפני החתך.
  3. לעשות חתך קו האמצע של 2.4 סנטימטר של העור על פני השטח הגבי של הגולגולת מתחיל כ 2 מ"מ הזנב לעיניים. לחזור העור לחשוף את הגולגולת. מעת לעת לטעת 0.9% תמיסת מלח סטרילית סטרילי בשולי האתר כירורגית כדי למנוע רקמות מייבוש.
  4. רקמה קרומית ברורה מהגולגולת עד גבחת ומבדה גלויה לעין.
  5. ודא שהגולגולת היא על ידי מדידת רמת הקואורדינטות הגבי-הגחון בגבחת ולמבדה. התאם את מכשיר stereotaxic בהתאם עד קואורדינטות הגבי-הגחון בגבחת ומבדה שונות על ידי לא יותר מ 0.04 מ"מ.
  6. בשלב זה, לצמצם את גז isoflurane לבין 2 ל 2.5%.
  7. להחזיר את התרגיל לגבחת, rezero הקואורדינטות ולאחר מכן להעביר את התרגיל לרצוי המדיאלי-צדדי וקדמי, אחורי לתאם.
  8. לקדוח חור בלתאם באמצעות מקדח 0.9 מ"מ כפי שהיא מייצרת חור בגודל מתאים למזרק עירוי G 28.
  9. הגדר את משאבת העירוי כדי לספק וירוס בשיעור של 0.2 μl / דקה. מניחים את המזרק לתוך זרוע העירוי של מכשיר stereotaxic ולהפחית את המזרק לתוך הרצוי לתאם. לספק את הכמות הרצויה של וירוס (טווח 0.1-0.8 μl). לדוגמא, לספק 0.8 μl של AAV מעל 4 דקות.
    הערה: לבצע מחקרי טייס לקבוע אידיאלי עירוי נפח וההתפשטות הטיפוסית של וירוס בכל אזור של עניין.
    1. לאחר המסירה של וירוס הוא שיתוףmplete לעזוב את המזרק במקום במשך 10 דקות כדי למנוע זרימה חוזרת למערכת המחט. לאט לאט להעלות את המזרק בשיעור של כ -5 מ"מ / דקה. חזור על פעולה עד כל הקואורדינטות כבר חדורות AAV.
  10. לסגור את הפצע באמצעות סיכות כירורגיות ומעיל הפצע עם משחה אנטיביוטית מקומית.
  11. פעל לפי הנחיות מוסדיות לניהול כאב שלאחר ניתוח.
  12. מניחים את החולדה בכלוב עם מצעים, מכסה ושילוט מתאים ולהחזיר את החולדה למתקן בעלי החיים.
    1. אם עובד תחת BSL-2 באמצעי זהירות, לאסוף כלי מיטה לכמות הזמן (בדרך כלל 48-72 שעות) שצוינה על ידי הנחיות מוסדיות. הנח מצעים למכל פסולת ביולוגית מסוכנת.
    2. השלך את כל החומרים מזוהמים AAV כמפורט בהנחיות לסילוק הבטוח שלהם.

3. מכשירי התנהגות

הערה: המנגנון נפשית מראש החושי מורכב של צ'אם תניה אופרנטית סטנדרטיבער ("x 9.5 L" x 11.5 "H 12 W) עם רצפת רשת פלדת אל-חלד, 2 הצדדיים פרספקס ו 2 קירות מתכת.

  1. הר אור 2.8 W על אחד קירות האלומיניום לשמש אור הבית וכגירוי החזותי כאשר הבזיקו ב2 הרץ. הר רמקול בחדר כדי לספק את הגירויים השמיעתיים (10 שניות, 1500 הרץ, טון 78 dB טהור ורעש לבן dB 10 שניות 78).
    1. השתמש הופר מזון כדי לספק 45 כדורי מזון מ"ג לתוך כוס מזון. בתוך כוס המזון, photocells אינפרא אדום לזהות את סך כל הזמן בילה בכוס המזון לפני, במהלך ואחרי מצגות של הגירויים ותגמולים מזון.
    2. בית התאים בארונות מרכך-קול (ד H x 16 "" W x 22 "22) לבוש עם אוהדי פליטה (~ 68 dB).
    3. להשתמש במחשב PC עם תוכנת מד Associates לשלוט קאמרי אופרנטית ולרכוש את הנתונים. במהלך פגישות אוויר, לאסוף נתונים על הזמן הכולל בילה עם הראש בכוס המזון במהלך presentation של (עידן 5 שניות) גירוי האור ובמהלך הצגת גמול מזון (5 עידן שניות). במהלך פגישת המבחן, לאסוף נתונים על הזמן הכולל בילה בכוס המזון בתגובה למצגות של הגירויים השמיעתיים (תחילת עידן 10 שניות כאשר הגירויים השמיעתיים הסתיימו).

4. סקירה של החושית אכשור קד פרדיגמה

  1. בעקבות התאוששות מניתוח, בהדרגה מזון להגביל את החולדות עד 85% ממשקל גוף האכלה החופשי שלהם. התייעץ עם צוות וטרינרים לפרדיגמה הגבלת מזון מתאימה.
    הערה: הפרדיגמה נפשית מראש חושי 3-השלב מתואר באיור 2.
  2. אכשור קד מושבים (שלב 1; אימונים יומיים 64 דקות שנערכו על פני 4 ימים רצופים):
    1. חולדות הנוכחיות עם 12 ניסויים שהתערבבו מורכב ממסירה של גירויים שמיעתיים וחזותיים. כוללים מרווחים בין משפט שדקות ממוצעת 4.5 (טווח 4.0-5.0 דקות) לאחר כלמצגת uditory.
    2. ב -6 בניסויים, (הגירוי מותנה מראש) טון הנוכחי במשך 10 שניות, ומייד אחרי מצגת 5 שניות של גירוי האור המהבהב.
    3. על אחרים 6 הניסויים, להציג את הרעש הלבן (גירוי מזווג) לבד במשך 10 שניות.
  3. (; מפגשים יומיים 64 דקות אימון שנערכו על פני 5 ימים רצופים שלב 2) הפעלות אוויר:
    1. חולדות הווה עם 8 ניסויים שמורכבים ממסירה של הגירוי החזותי (גירוי האור המהבהב) במשך 5 שניות ומייד אחרי מסירה של שני כדורי מזון 45 מ"ג. כולל מרווחים בין משפט כי 7 דקות ממוצעת (טווח 6.0-8.0 דקות) אחרי כל משפט. לפעמים חולדות דורשות יותר מ -5 מפגשי אוויר כדי ללמוד עמותת מזון הקלה.
  4. מבחן מושב (שלב 3; פגישת 78 דקות בודדת):
    1. להציג את החולדות עם 12 ניסויים שהתערבבו מורכב ממסירה של הגירויים השמיעתיים לבד. כוללים מרווחים בין משפט שישתוזעם 4.5 דקות (טווח 4.0-5.0 דקות) לאחר כל הצגה שמיעתית.
    2. ב -6 בניסויים, להציג את גירוי הטון (הגירוי המותנה מראש) לבד במשך 10 שניות.
    3. על אחרים 6 הניסויים, להציג את הרעש הלבן (הגירוי מזווג) לבד במשך 10 שניות.
  5. משקל נגד לגירויים על ידי השלמת המחקר עם קבוצה שנייה של חולדות שקבלו את הרעש הלבן כגירוי המותנה מראש ואת הטון כמו הגירוי מזווג.

5. תרופתי והתנהגות נוהל

  1. הפעל את כוח מנגנון ההתנהגות ולטעון את קוד Med-PC לפגישת ההתנהגות המתאימה. תיל ותכנית מנגנון ההתנהגות כזו שהאוהדים שהם רכובים על ארונות הקול מרכך להפעיל כאשר הכח מופעל.
  2. כדי להכין פתרון 1 מ"ג / מיליליטר של קלוזאפין N-תחמוצת (CNO), שוקל 5.0 מ"ג של CNO לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר ולהוסיף 5 מיליליטר של מים סטריליים או 5 מיליליטר של סאלי 0.9% סטריליne. מערבולת עד הפתרון היא ברורה.
    1. אם CNO לא לפזר לפתרון או אם פתרונות מרוכזים יותר של CNO הם רצויים להוסיף סוכן solubilizing, כגון DMSO 23. באופן ספציפי, כדי להכין את פתרון 1 מ"ג / מיליליטר של CNO עם 0.5% DMSO, שוקל 5.0 מ"ג של CNO ולהוסיף 25 μl של DMSO לצינור חרוטי 15 מיליליטר. פליק בעדינות על מנת להבטיח כי התוכן יישאר בבסיס של הצינור. כאשר הפתרון מתברר, להוסיף 5 מיליליטר של מים סטריליים או 5 מיליליטר של תמיסת מלח 0.9% סטרילי. הוראות נוספות להכנת פתרונות של CNO זמינות בדף משאבי ויקי DREADD 25.
    2. הכן פתרון CNO חדש בכל יום שהוא מנוהל.
  3. הזרק CNO intraperitoneally במינון של 1 מ"ג / קילוגרם כ 30 דקות לפני בדיקות התנהגותיות. לדוגמא, להזריק עכברוש 200 גרם עם 0.2 מיליליטר של 1 מ"ג / מיליליטר פתרון CNO. כמובן במינון והזמן של ממשל CNO נבחרו על סמך דיווחים שפורסמו בעבר 2,12.
    1. הזרק CNO דקות 30 לפני כל פגישה נפשית מראש (שלב 1; כולל של 4 ימים של זריקות) אבל לנהל את הרכב לפני כל מפגשי ההתנהגות שלאחר מכן.
  4. לאחר 30 דקות, מניח את החולדות לתאי הבדיקות התנהגותיות וליזום את קוד המחשב לפגישת ההתנהגות המתאימה.
  5. עם השלמת המשימה התנהגותיות, להסיר באופן מיידי את החולדות מהתאים ולהחזיר את החולדות למושבה של בעלי החיים.

6. ניתוח של התנהגות נתונים

הערה: המשתנה התלוי לכל מפגשי ההתנהגות הוא כמות הזמן שראשו של העכברוש הוא בתוך כוס המזון כפי שזוהה על ידי הפרעה של תאי אור אינפרא אדום בכוס המזון. נתונים (בשניות) נאספים ונרשמו על ידי תוכנת המחשב.

  1. אל תנהל ניתוחים על הנתונים שנוצרו בשלב אכשור קד.
  2. למפגשי אוויר: לנתח כל חולדותbility ללמוד עמותת מזון האור על ידי השוואת מזון כוס התנהגות במהלך המצגת של הגירוי החזותי על פני 5 מפגשי התנהגות. באופן ספציפי, לחשב את הזמן הממוצע בילה בכוס המזון בעידן האור 5 שניות לכל אחד מניסויים 8 / מושב (כלומר, ממוצע של 8 ניסויים שכל 5 שניות בזמן / חולדה). שקלו את השליטה ממוצעת וערכים ניסיוניים עבור כל 5 מפגשים יומיים (ראה איור 3 א).
    1. לנתח את המוטיבציה של החולדות לקבל גמול מזון על ידי השוואת מזון כוס התנהגות במהלך הלידה של גמול מזון (5 עידן שניות) על פני 5 מפגשי התנהגות תוך שימוש באותו החישוב כמפורט לעידן אור 5 שניות לעיל. ערכים אלה יהיו גבוהים יותר באופן עקבי מאלו שנרכשו במהלך המצגת של הגירוי החזותי (ראה איור 3).
  3. לפגישת המבחן: לחשב יחס אפליה המתאר את חולדות כוס מזון התנהגות בתגובה לפרהentations של כל גירוי שמיעתי.
    1. באופן ספציפי, לכל חולדה, לחלק את המשך הזמן הממוצע בכוס המזון הבא כל אחד מ6 מצגות של הגירוי המותנה מראש החושי (כלומר, את הטון) בסכום של המשך הזמן הממוצע בכוס המזון הבא כל אחד ממצגות של 6 גירוי חושי preconditioned (כלומר, גירוי הטון) בתוספת הממוצעת של סך כל הזמן בילה בכוס המזון הבא כל אחד מ6 מצגות של הגירוי מזווג (כלומר, גירוי הרעש הלבן). כל עידן הוא 10 שניות בזמן.
      הערה: ציון אפליה של 0.5 או יותר מוכיח כי חולדות למדו עמותות הגלומות בפרדיגמה נפשית מראש החושית.

7. אימות של AAV מיקום וביטוי

  1. הרדימי וperfuse חולדות transcardially באמצעות paraformaldehyde 4%. בשל השימוש בתוויות ניאון, לא יעלה על זמן שלאחר קיבוע-של 2 שעות לקבוע מינימוםאובדן imize של antigenicity ולשמר את אות הניאון.
  2. מייבש את מוח perfused ידי העברתם לצנצנת מוח המכילה 30 מיליליטר של תמיסת סוכרוז 20% בופר פוספט (1x) למינימום של 2 ימים או עד שהמוח שוקע לתחתית צנצנת המוח.
  3. השתמש microtome הזזה הקפאה כדי להפוך את החלקים במוח העטרה (20-40 מיקרומטר) בכל מידת rostrocaudal השלם של האזור של עניין.
  4. לנהל אימונוהיסטוכימיה המכוונת נגד קולט מתויג או חלבון הכתב כדי לברר את המיקום וביטוי של הקולטן המעצב ו / או כתב 12. פרוטוקול מכתים אימונוהיסטוכימיה מסופק על דף משאבי ויקי DREADD 25.
  5. הר הסעיפים על גבי שקופיות SuperFrost פלוס וcoverslip באמצעות 100-200 μl של מדיום גובר מימי.
  6. בצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי על רקמת מוח כדי לוודא מיקום AAV וחלבון ביטוי 12,24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות התנהגות

עם השלמת הניסוי, את האפקטיביות של איון הזמני ספציפי לאזור יש להעריך כמותית ואיכותית. הדוגמא הנוכחית כרוכה הפרדיגמה 3-שלב התנהגות (נפשית מראש חושי), שבו היה מנוהל CNO כדי להחליש פעילות עצבית בRSC במהלך פגישות אכשור קד לבחון את ההשערה שRSC הכרחי להיווצרות של עמותות בין גירויים ניטראליים 12. חשוב לציין, הנסיינים אינם מוגבלים לפרדיגמה ההתנהגות או עיצוב ניסיון המתואר במסמך זה כגישת pharmacogenet...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליישם גישת pharmacogenetic (DREADD) כדי לחקור כיצד אזור ספציפי במוח תורם למשימה למידה מורכבת רב-שלב. עם היכולת באופן זמני ומרחוק כדי להשתיק את הפעילות עצבית באזורי המוח הבדידים פני שלבים של למידה, זה שילוב של גישות מספק פלטפורמה לחקור מגוון רחב של התנהגויות, כוללים צורות יותר מורכב או רעולי פנים של למידה. בדוגמא שתוארה בפרוטוקול זה, לשלוט חולדות ועכברים המבטאים את הקולטן המעצב בקליפת retrosplenial (RSC) נבדקו במשימה התנהגותיות 3-שלב 12. השלב הראשון...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברים של רובינסון ואח '. 12 על תרומתם לכתב היד שממנו הפרוטוקול זה נגזר באופן חלקי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
זכר, חולדות לונג אוונס, בן 55-60 יוםHilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrineVirus Vector Coreזהירות: זוהי תרכובת BSL-1
rAAV8/hSyn-GFPVirus Vector Coreזהירות: זוהי תרכובת BSL-1
Clozapine-N-oxideR& D Systems4936-10תרופת מעצבים
מכסה כלוב עכברושים (פוליקרבונט)עיצוב אלטרנטיבי FT 8XL-PCמשמש לכיסוי כלובי בעלי חיים 48-72 שעות לאחר עירוי
נייר סינון (החלפה)עיצוב אלטרנטיביFP-R-1018XADנייר סינון שהולך עם מכסי כלוב
מלחציים שולחנייםJETS2201-265להחזקת צינורות מיקרוסנטריפוגה המכילים AAV במכסה המנוע
שקיות אשפה Biohazardסיכות113444ספינות ביולוגיות של Medline
פח אשפה BiohazardUnited Solutions פח אשפה מלבני עם גלגלים בנפח 34 ליטר עם וו וידית נעילה
Isoflurane, 100 מ"לPatterson Veterinary Supply Inc.07-890-8540הרדמה
סטריאוטקסי כפול לבעלי חיים קטנים עם קונסולת קריאת תצוגה דיגיטליתדיוויד קופףדגם 942ציוד כירורגי
מוטות אוזניים ללא קרעים, סט של 2 (חולדה)דיוויד קופףדגם 955ציוד כירורגי
מסכת הרדמה (חולדה)דיוויד קופףדגם 906ציוד
כירורגימקדחה סטריאוטקסית במהירות גבוהה כוללת בקר מנוע שולחני, דוושת רגל, ידית, מחזיק ידית סטריאוטקסיתדיוויד קופףדגם 1474ציוד כירורגי
מיקרו-מקדחה, 0.9 מ"מFine Science Tools Inc19007-09אספקה כירורגית
משאבת מזרק אוטומטית עם בקר micro4דיוויד קופףדגם UMP3-1ציוד כירורגי
להב קרמי נשלף פרו-בעלי חיים ערכת קוצץAhdis21420אספקה כירורגית
Betadine לניקוי עורPerdue Products L.P67618-149-04אספקה כירורגית
משחה אנטיביוטית משולשתאספקת Medline53329-087-01אספקה כירורגית
משחה וטרינרית Puralubeבלבד אספקה וטרינרית17033-211-38אספקה כירורגית
מיקרוסקופדינו-לייטAD7013MTLאלטרנטיבה לטווח החיתוך המסורתי
מעמד בום שולחני קשיח דינו-לייטמיקרוסקופMS36Bציוד כירורגי
28 G 10 μ l מזרקהמילטון80308-701SNציוד כירורגי
הנחתת קול MDF גבוה במיוחדMed Associates, IncENV-018MD22 'W x 22" H x 16" D
תא בדיקה מודולרי גבוה במיוחדMed Associates, IncENV-007ציוד התנהגותי
רצפת רשת נירוסטהMed Associates, IncENV-005ציוד
התנהגותיאור הביתMed Associates, IncENV-215Mמשמש כאור הבית ואור גירוי
מתקן גלולה מודולריMed Associates, IncENV-203M-45ציוד התנהגותי
שקע גלולה, סוגMed Associates, IncENV-200R1Mציוד התנהגותי
גלאי כניסת ראש לחולדהMed Associates, IncENV-254-CBציוד התנהגותי
כדורי מזון מדויקים ללא אבק, 45 מ"גBio-ServF0165אספקה התנהגותי
לתא חולדותMed Associates, IncENV-224AMציוד התנהגותי
מחולל אודיו לתכנותMed Associates, IncANL-926ציוד התנהגותי
חכם ctrl 8 כניסה/16 חבילת פלטMed Associates, IncDIG-716P2ציוד התנהגותי
ארון שולחני גדול וספק כוחMed Associates, IncSG-6510Dציוד התנהגותי
חבילת ממשקPCI Med Associates, IncDIG-700P2-R2ציוד התנהגותי
MED Intel Core Computer pkg עם צג X Pro 19 אינץ'Med Associates, IncCOM-103Vציוד התנהגותי
Paraformaldehyde (גרנולר), 1 ק"גמיקרוסופיה אלקטרונית מדעים19210סכנה: מסרטן, שוקל במכסה המנוע
נוגדן חד שבטי ארנב (HA-Tag)טכנולוגיות איתות תאים3724Sמגיב היסטולוגיה
XP נוגדן חד שבטי ארנב (GFP)טכנולוגיות איתות תאים2956Sמגיב היסטולוגיה
אנטי ארנב IgGטכנולוגיות איתות תאים4412Sאספקה היסטולוגית
סופרפרוסט פלוס שקופיותVWR international483111-703ציוד היסטולוגיה
Amazon.com חומר תא רמקול כלוב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  2. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
  3. Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
  4. Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
  5. Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
  6. Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
  7. Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
  8. Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
  9. Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
  10. Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
  11. Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
  12. Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
  13. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  15. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
  16. Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
  17. Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
  18. Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
  19. Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  20. Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
  21. National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
  22. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  23. Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
  24. Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
  25. wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
  26. Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
  27. Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
  28. Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
  29. Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
  30. Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Clozapine N OxideAdeno Associated Virus

מאמרים קשורים