שיטה לגרום סגור ראש הפגיעה מוחית טראומטית ב<em&gt; דרוזופילה</em

סיכום

כאן אנו מתארים שיטה לגרום פגיעת ראש סגור מוח הטראומתי (TBI) בדרוזופילה. שיטה זו מספקת שער לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים העומדים בבסיס פתולוגיות TBI באמצעות המגוון הרחב של כלים וטכניקות ניסיוניים זמינים לזבובים.

תקציר

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) משפיעה על מיליוני אנשים בכל שנה, גורמת לירידת ערך של פיזי, קוגניטיבית, ופונקציות התנהגותיות ומוות. מחקרים באמצעות תסיסנית תרמו פריצות דרך חשובות בהבנת תהליכי נוירולוגיות. לפיכך, במטרה להבין את הבסיס התאי ומולקולרי של מחלות TBI בבני אדם, שפיתחנו מכשיר הגבוה השפעת הטראומה (HIT) להסב את הראש סגור TBI בזבובים. זבובים נתון לפנוטיפים תצוגת מכשיר HIT בקנה אחד עם TBI אדם כגון נבצרות זמניות וניוון מוחיה מתקדם. מכשיר HIT משתמש במנגנון המבוסס על קפיץ כדי להניע את הזבובים על הקיר של בקבוקון, וגרם לנזק מכאני למוח הזבוב. המכשיר הוא זול וקל לבנייה, הפעלתו היא פשוטה ומהירה, והיא מייצרת תוצאות לשחזור. כתוצאה מכך, מכשיר HIT יכול להיות משולב עם כלים ניסיוניים קיימים וטכניקות לזבובים כדי לטפל בבסיסייםשאלות על TBI שיכול להוביל לפיתוח של כלי אבחון וטיפולים לTBI. בפרט, מכשיר HIT ניתן להשתמש כדי לבצע מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה כדי להבין את הבסיס הגנטי של מחלות TBI.

מבוא

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) מוגדרת כפגיעה במוח מכוח מכאני חיצוני. הנפוץ ביותר, תוצאות TBI מכוחות הראש סגורים כגון כוחות בוטים והאצת אינרציה וכוחות ההאטה שגורמים למוח להכות את החלק הפנימי של הגולגולת. בארצות הברית, ההערכה היא כי 50,000 אנשים מתים בכל שנה מTBI ו2.5-6,500,000 אנשים חיים עם ההשלכות של TBI, כוללים מתישים פיזי, קוגניטיבית, ובעיות התנהגות ^1,2. ההשלכות של TBI הן לא רק עקב פציעות מכאניות עיקריות למוח, אלא גם לפציעות המשניות תאיות ומולקולריות למוח, כמו גם רקמות אחרות המתרחשות לאורך זמן ^3-5. הפיתוח של גישות לאבחון וטיפול TBI הוכיח להיות קשה כי TBI הוא תהליך מחלה מורכב. הטבע המשתנה של פציעות עיקריות, פיזיולוגיה אנושית, וגורמים סביבתיים גורם לi המשנית הטרוגניתnjuries ופתולוגיות. גורמים משתנים בסיסי כוללים את חומרת הפגיעה הראשונית, זמן בין פציעות עיקריות החוזרות ונשנות, וגיל וגנוטיפ של הפרט. הבנה כיצד כל גורם משתנה תורם להשלכות של TBI עשויה לסייע בפיתוח של גישות לאבחון וטיפול TBI ^6,7.

כאן אנו מתארים שיטה לגרימת TBI הראש הסגור בmelanogaster דרוזופילה (זבובי פירות), שניתן להשתמש כדי לשרטט את תרומתם של גורמים משתנים להשלכות של TBI. השיטה מבוססת על תצפית ראשונית שמאוד להכות את הצד של בקבוקון תרבות זבוב על כף יד שנגרמה פרא-סוג טס להופכים באופן זמני נכה, תוצאה סבירה של TBI. לפיכך, אנו נבנו מכשיר הטראומה (HIT), השפעה הגבוה לשחזר כוחות התאוצה וההאטה מהפעולה ביד להכות. סרט במהירות גבוהה מראה כי שביתה אחת מHIT מכשיר גורם זבובים ליצור קשר עם קיר הבקבוקון מספר פעמים עם הראש וגופם ^8. במידה מסוימת, את כל אנשי הקשר עלולים לגרום למוח הזבוב ליתיר ולעוות נגד הקפסולה הראש, דומה למה שקורה לבני אדם בנפילות ותאונות דרכים ^9. בהתאם לכך, זבובים שטופל בפנוטיפים תצוגת מכשיר HIT בקנה אחד עם פגיעה מוחית, כולל נבצרות זמניות ואחריו אטקסיה, התאוששות הדרגתית של ניידות, שינויי ביטוי גנים בראש, וניוון של מערכת עצבים מתקדמות במוח ^10. לפיכך, מכשיר HIT מאפשר ללמוד TBI באמצעות הארסנל העצום של כלים וטכניקות שפותחו לזבובים ניסיוניים.

פרוטוקול

1. בנייה של מכשיר HIT

1. צרף את האביב ללוח באמצעות שני מלחציים וארבעה ברגים (איור 1 א). מרכז את מהדק ביחס לרוחב הלוח ונוגח אותם אחד נגד השני עם סומק המהדק החיצוני עם הקצה של הלוח. לפני מצרף את מהדק, לכופף אותם באמצעות צבת שיתאים היטב על האביב.
   הערה: ראה טבלת 1 לתיאורים של החומרים הנדרשים לבניית מכשיר HIT. הסוף מהודק של האביב צריך להיות 1/8 אינץ '(3.2 מ"מ) מקצה הלוח, ואת הקצה החופשי צריך להרחיב על הלוח על ידי 3/4 אינץ' (19 מ"מ). התאם את האביב, כך שהוא נמצא במקביל לאורכו של הלוח.
2. עטוף את הקצה החופשי של הקפיץ פעם אחת סביב עם רצועת הדבק של לולאות סקוטש. הקצה החיצוני של סקוטש צריך להיות מיושר עם סוף האביב. סקוטש הוא חשוב משום שהוא משמש כדי לאבטח את הבקבוקון למעיין על ידי creating הולם דחיסה חזק. סקוטש גם מאפשר חיבור קל וההסרה של בקבוקונים, המאפשר בקבוקונים רבים להיות מעובד בתקופה קצרה של זמן.
3. הנח את כיסוי דלי הקרח הפוך, מרוכז, חזק נגד לוח העץ. כוון את האזור המורם של כיסוי דלי הקרח כך שהקצה הארוך מקביל לרוחב של הלוח. שים לב שהאזור שהועלה של דלי הקרח הוא 1/2 אינץ '(13 מ"מ) גבוה יותר מאשר לוח העץ, כך שכאשר בקבוקון מחובר לאביב האביב לא לשכב על הלוח.
4. חלק את כל המכשיר נגד אובייקט קבוע כגון קיר, כך שכיסוי דלי הקרח תקוע בין הלוח והאובייקט ולא זז.
5. קלטת מד זווית נייר לתחתית קרטון לטוס מגש בקבוקון ולסבול את זה על קצה נגד האורך של הלוח כך שהסימן 90 ° מיושר עם האביב כאשר הוא נסוג למצב אנכי בצורה מושלמת.

2.מבצע של מכשיר HIT

1. מקום בין CO 1 ו -60 ₂ -anesthetized זבובים בבקבוקון ריק ופקק הבקבוקון באמצעות כדור צמר גפן הדוק.
2. להגביל את הזבובים לאינץ 'התחתון 1 (2.5 סנטימטרים) של הבקבוקון על ידי לחיצה על כדור צמר גפן לתוך הבקבוקון עד שהוא 1 אינץ' (2.5 סנטימטרים) מהתחתית. זה מועיל למתוח קו על הבקבוקון בסימן 1 אינץ '(2.5 סנטימטרים). שים לב שמגביל זבובים לאזורים גדולים יותר או קטנים יותר של הבקבוקון יכול להשפיע על החומרה של פנוטיפים.
3. חכה 5 דקות לזבובים להתאושש ניידות מCO _2. שים לב שזה לא ידוע אם 5 דקות מספיקות כדי להסיר את ההשפעות של CO ₂ לחלוטין.
4. הכנס את הקצה של האביב לתוך הבקבוקון עד הקצה הפנימי של סקוטש הוא מיושר עם החלק העליון של הבקבוקון (איור 1). כאשר באביב הוא שוכב, 1 אינץ '(2.5 סנטימטרים) של הבקבוקון צריך לחפוף את האזור המורם של כיסוי דלי קרח. ניתן לעשות שימוש חוזר בקבוקי מ 'כל זמנים.
5. בעת שישב, להחזיק את הבקבוקון באזור סקוטש באמצעות האגודל והאצבע של יד שמאל. החזק את הלוח הדוק לbenchtop ביד הימין שלך. לחלופין, להשתמש C-מהדק להחזיק את הלוח ההדוק לbenchtop.
6. משוך את האביב בצורה מושלמת ישר בחזרה לזווית הרצויה. שחרר את האביב. לאפשר האביב להגיע לעצירה מוחלטת.
7. הסר את הבקבוקון מהמעיין ולאפשר הזבובים להתאושש במשך ≥5 דקות. להכפיף את הזבובים לשביתה נוספת או להעביר את הזבובים לבקבוקון עם אוכל לטוס.
   הערה: מגוון רחב של מבחני יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות פנוטיפי של שביתות ממכשיר HIT. לדוגמא, השפעות על תוחלת חיים יכולות להיקבע על ידי ניתוח אחוזים מזבובים שלשרוד בזמנים לאחר פציעה, השפעות על מורפולוגיה המוח יכולות להיקבע על ידי ניתוח היסטולוגית של הראש, והשפעות על ביטוי גנים יכולות להיקבע על ידי ניתוח כמותי של רמות ה- mRNA ^10.
8. Determinהשפעות אלקטרוניים של ההליך שאינן בשל שביתות על ידי זהה טיפול זבובי שליטה שאינם נתון לשביתות. ללבוש שמיעת הגנה מפני ההשפעה של הבקבוקון נגד כיסוי דלי הקרח מייצרת רעש חזק.

תוצאות

אנחנו מעוניינים להבין מדוע זבובים מתים זמן קצר לאחר פגיעה ראשונית. כדי לכמת מוות, קבענו מדד התמותה ב 24 שעות (MI _24), המהווה את האחוז של זבובים שמת בתוך 24 שעות של הפגיעה העיקרית. זבובים נתון לשביתות ממכשיר HIT הודגרו של 25 מעלות צלזיוס בבקבוקון עם אוכל לטוס, ומספר הזבובים המתים נספר לאחר 24 שעות. אנחנו השתמשנו בגישה זו כדי לזהות גורמים המשפיעים על ₂₄ MI ומצאנו כי ₂₄ MI אינו מושפע ממספר הזבובים בבקבוקון (10 עד 60 זבובים נבדקו), את הזמן בין שביתות ח...

דיון

שיטת מכשיר HIT נבדל משיטות אחרות שתגרומנה לפגיעה טראומטית בזבובים על ידי כך שהיא גורמת לראש סגור ולא חודר ¹¹ TBI. יתר על כן, שיטת מכשיר HIT לוקחת פחות זמן, מאמץ, מיומנות ולגרום TBI בזבובים רבים, ולכן השיטה היא נוחה יותר מאשר בשיטות אחרות למסכים גנטיים בקנה מידה גדולה. לבסוף, העובדה שהפציעות עיקריות שנגרמו על ידי מכשיר HIT אינן מוגבלות למוח הוא גם מגבלה ויתרון. זה הגבלה כי מחקרים נוספים נדרשים להעריך האם פנוטיפים הם עקב פציעה טראומטית למוח או לחלקים אחרים בגוף. מצד השני,...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קפיץ דחיסה מצופה אבץ	הילמן  קבוצה		540189 9 7/8 אינץ' (אורך, 2.2 ס"מ), 15/16 אינץ' (קוטר חיצוני, 2.4 ס"מ), 0.12 אינץ' (גודל חוט, 0.3 ס"מ)
לוח			9 אינץ' (אורך, 22.9 ס"מ), 6.5 אינץ' (רוחב, 16.5 ס"מ), 0.75 אינץ' (גובה, 1.9 ס"מ)
מהדקים	סיגמא ייצור חשמל 49822		3.10 אינץ' (אורך, 7.9 ס"מ), 0.68 אינץ' (רוחב, 1.7 ס"מ), 1.11 אינץ' (גובה, 2.8 ס"מ), רצועות EMT דו-חוריות, לחץ על הסוג עבור צינור EMT מפלדה בגודל 1 אינץ' (2.5 ס"מ)
לולאה חצי סקוטש			3 אינץ' (אורך, 7.6 ס"מ), (רוחב 3/4 אינץ', 1.9 ס"מ)
כיסוי דלי קרח פוליאוריטן	פישר סיינטיפיק	02-591-45	9 1/8 אינץ' (אורך, 23.2 ס"מ), 9 1/8 אינץ' (רוחב, 23.2 ס"מ), 1 1/4 אינץ' (גובה, 3.2 ס"מ)
בקבוקוני זבוב מפלסטיק	Applied Scientific	AS-510	3 11/16 אינץ' (גובה, 9.4 ס"מ), 1 1/16 אינץ' (קוטר פנימי, 2.7 ס"מ), 1 1/8 אינץ' (קוטר חיצוני, 2.9 ס"מ)
כדורי צמר גפן גדולים	פישר סיינטיפיק	22-456-883
מד זווית			10 אינץ' (קוטר, 25.4 ס"מ)

עץ דביק נייר