הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

7.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52910

⸱

3 בדצמבר 2015

 ,  , 
1Primate Research Center, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה יעילה של אנדותל המוגני ואבות המטופויאטיים רב-פוטנציאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק.

תקציר

במהלך פיתוח, תאי hematopoietic נובעים ממשנה מיוחד של תאי האנדותל, האנדותל hemogenic (HE). פיתוח מודלים הוא במבחנה הוא חיוני למחקרים מכניסטית של מעבר אנדותל-hematopoietic ומפרט hematopoietic. כאן, אנו מתארים שיטה לזירוז יעיל של HE מתאי אנושיים pluripotent גזע (hPSCs) בדרך של ביטוי יתר של קבוצות שונות של גורמי שעתוק. השילוב של ETV2 וGATA1 או GATA2 TFS משמש כדי לגרום לו עם פוטנציאל פאן-מיאלואידית, תוך שילוב של GATA2 וגורמי שעתוק TAL1 מאפשר לייצורו עם erythroid ופוטנציאל megakaryocytic. התוספת של LMO2 לGATA2 ושילוב TAL1 משמעותית מאיצה בידול ומגבירה את ייצור תאי erythroid וmegakaryocytic. שיטה זו מספקת אמצעי יעיל ומהיר של האינדוקציה HE מhPSCs ומאפשרת לתצפית של האנדותל-hematopoietiמעבר ג בצלחת תרבות. הפרוטוקול כולל נהלי התמרה hPSCs וניתוח שלאחר התמרה-שלו ואבות דם.

מבוא

היכולת הייחודית של תאי גזע pluripotent האנושיים (hPSCs) לעצמית לחדש ולהתמיין לתאים של שלוש השכבות נבט, כוללים דם, לגרום להם כלי רב ערך עבור המחקרים מכניסטית של פיתוח hematopoietic, מודלים של מחלות דם, הקרנת סמים, מחקרים רעילים, והפיתוח של טיפולים סלולריים. בגלל היווצרות דם בתמורת העובר מהאנדותל hemogenic (HE) דרך מעבר hematopoietic אנדותל 1,2, הדור של HE בתרבויות תהיה חיוני כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים המסדירים את המעבר לאנדותל hematopoietic ומפרט hematopoietic. שיטות נוכחי ללימודים של HE מבוססות על האינדוקציה של בידול hematoendothelial באגרגטים (EBS) עם התוספת של ציטוקינים hematopoietic 3-5, וcoculture של hPSCs עם תאי סטרומה hematopoiesis-תומך 6,7 או בתרבויות דו ממדים עם תאי מטריצות וגytokines 8,9. שיטות הבחנה הקלאסיות אלה מבוססות על ההיכרות של אותות חיצוניים הפועלים על פני השטח של התאים וייזום מפלי מסלולים מולקולריים שסופו של דבר יובילו להפעלה של תכנית תעתיק המנחה פיתוח hematoendothelial. לפיכך, את היעילות של בידול hPSCs במערכות אלה מסתמך על אינדוקציה יעילה של אותות אלה, הולכים אותות לגרעין, והפעלה של רגולטורי תעתיק ספציפיים וכתוצאה מכך. בנוסף, המחקר של HE בתרבויות בידול קונבנציונליים דורש צעד נוסף של בידוד HE תאים באמצעות מיון תא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזירוז הישיר שלו ודם על ידי ביטוי יתר של גורמי שעתוק hematopoietic. שיטה זו מאפשרת לאינדוקציה היעילה של HE בצלחת ותצפית ישירה של האנדותל למעבר hematopoietic ללא הצורך בבידוד של HE באמצעות הליך מיון תא מסורבל.

היווצרות הוא והדם מתאי גזע pluripotent אנושיים יכולים להיגרם ביעילות על ידי overexpressing רק כמה גורמי שעתוק (TFS). שילוב האופטימלי של TFS מסוגל גרימת hematopoiesis פאן-מיאלואידית החזקה מhPSCs כולל וGATA1 או GATA2 ETV2. לעומת זאת, שילוב של GATA2 וTAL1 גורם erythromegakaryocytopoiesis 10. תכנות hPSCs דרך ביטוי יתר של גורמים אלה מבדיל hPSCs ישירות לVE-CAD + CD43 - CD73 - הוא תאים שירכשו את הפנוטיפ hematopoietic שהוגדר על ידי הביטוי של CD43 סמן hematopoietic מוקדם 7 בהדרגה. שיטה זו מבוססת על lentiviral לתכנות הישיר של שיטת תאי גזע pluripotent האנושית היא ישימה עבור הדור שלו ותאי דם למחקרים מכניסטית, מחקרים של האנדותל למעבר דם, ורגולצית תעתיק של פיתוח ומפרט hematopoietic. למרות גפרוטוקול urrent מתאר ייצור דם באמצעות ביטוי מכונן של transgenes, ניתן להשיג תוצאות דומות באמצעות mRNA שונה 10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנות וירוס וצירופי גורם שעתוק

  1. הכן את הפתרונות עם פלסמיד ביטוי lentiviral pSIN-EF1α מכיל DNA המקודדים חלבונים לETV2, GATA1, GATA2, TAL1 וLMO2 (טבלת 1).
  2. למדוד את הריכוז וטוהר הכנות פלסמיד המשמשות לייצור lentiviral על ידי הקלטת קליטת UV עם ספקטרופוטומטר ב 230 ננומטר, 260 ננומטר, ו -280 ננומטר. הערה: הכנות DNA A260 / 280 וA260 / 230 ערכי הוכחה גדולים יותר מאשר 1.8 נחשבים בדרך כלל באיכות טובה. A260 / 280 ערכים נמוכים עלולים להצביע על זיהום חלבון, בעוד A260 / 230 ערכים נמוכים מצביעים על זיהומים עם מלחים או כמה כגון פנול הממס. ריכוז פלסמיד מומלץ הוא 1-3 מיקרוגרם / μl.
  3. לייצר lentiviruses לtransductions כפי שתואר בפרוטוקולים שפורסמו בעבר 11. אינדוקציה שלו עם פוטנציאל פאן-מיאלואידית דורשת שיתוף ביטוי של ETV2 וGATA1, או ETV2 וGATA2.אינדוקציה שלו עם פוטנציאל erythro- וmegakaryocytic דורשת GATA2 וTAL1. התוספת של LMO2 משפרת באופן משמעותי את התשואה של תאי erythro-megakaryocytic מhPSCs בנוכחות GATA2 וTAL1 10.

2. hPSCs תרבות פרוטוקול

  1. לגדל תאי גזע pluripotent במושבות הדוקות עם קצוות חדים לconfluency 70-80% לפני subculturing. מארק ולהסיר הבדיל מושבות באופן ספונטני לפני passaging תאים.
  2. לדלל ג'ל המסחרי תאי מטריצה ​​(ראה טבלה 2) על פי הוראות היצרן וצלחות מעיל 6-גם הלילה ב 4 ° C, או לפחות שעה אחת על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. לפני passaging תאים, לשאוב את המטריצה, להוסיף 2 מיליליטר של culturemedium המלא המסחרי הטרי (ראה טבלה 2) ולשמור על צלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד התאים מוכנים לזריעה.
  3. hPSCs מעבר
    1. ASPIRAבינוני te מטוב אחד ומחוברות של 6-גם צלחת עם hPSCs ולהוסיף 1.5 מיליליטר של תמיסת Dispase השני מראש חימם (2 מ"ג / מיליליטר בDMEM / F12, מעוקר על ידי סינון דרך 0.22 מיקרומטר מסננים). דגירה 5-7 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד הקצוות של מושבות להתחיל להרים מהמשטח.
    2. פתרון לשאוב Dispase השני ובזהירות לשטוף את המושבות פעמיים על ידי הוספה ולאחר מכן aspirating 2 מיליליטר של מדיום DMEM / F12 הטרי. לאחר מכן, באמצעות פיפטה זכוכית סרולוגיות 5 מיליליטר, לנתק hPSCs עם 3 מיליליטר של מדיום תרבות השלמה מסחרי טרי (ראה טבלה 2) על ידי pipetting השעיה תא למעלה ולמטה מספר פעמים.
    3. הוסף 0.5 מיליליטר של השעיה תא היטב בכל צלחת 6-היטב המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום תרבות השלמה המסחרי (ראה טבלה 2). להתסיס את צלחת קדימה ואחורה וזכות מספר פעמים שמאלי כדי להבטיח חלוקת תא אחידה כאשר למקם את הצלחת לתוך החממה. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל18-24 שעות.
    4. שינוי היום הבינוני הבאה למדיום תרבות השלמה מסחרי טרי (ראה טבלה 2) ולבחון את מורפולוגיה hPSCs. תוצאות passaging מוצלחות במושבות קטנות, מצורפים היטב שמירת מורפולוגיה hPSC. hPSCs חייב להיות מוזן עם 2.5-3 מיליליטר freshmedium לכל גם על בסיס יומי וpassaged כל 4-5 ימים בלא יותר ממפגש 70-80%.
      הערה: אם hiPSCs נשמרו על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs), הם צריכים להיות מועברים לתנאים ללא מזין וpassaged 2-3 פעמים לפני שהתמרה כדי להבטיח בידול יעיל.

3. אינדוקציה של Hematoendothelial Pprecursors מhPSCs (יום 0, התמרה של hPSCs)

  1. להכין מדיום תגובה לשלב 1.3 מיליליטר של מדיום סרום ללא שלם מסחרי (ראה טבלה 2), וירוס, polybrene, ומעכב Y27632 ROCK (טבלת 1): להוסיף 1.3 μl של מעכבי ROCK 10 מ"מ 1.3 מיליליטר בינוני עד Concentra סופיtion של 10 מיקרומטר, וpolybrene למיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 6 סופי.
    1. להוסיף כמות מתאימה של תרכיז נגיפי (ים) בריכוז סופי של 0.5-1.0 משרד הפנים (ריבוי של זיהום) של כל וירוס לכל תא. שמור בינוני תגובה על קרח או על 4 מעלות צלזיוס עד ההשעיה התא הבודד מוכנה.
      הערה: אותו הסכום של משרד הפנים לכל וירוס בGATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, ותערובות GATA2 / TAL1 / תגובת LMO2 הוא אופטימלית לאינדוקציה של בידול. תרבויות עם זאת, בETV2 / GATA2 transduced הכפלת משרד הפנים לGATA2, ביחס לETV2, משפרת בידול. לכן, לתרבויות אלה, יחס 1: 2 למשרד פנים של ETV2 ומשרד הפנים של 1 GATA2 מומלץ (למשל, אם להתרכז ויראלי מוערך בכ 6.8 x 10 7 מיליליטר / חלקיקים, להוסיף 10 μl של ETV2 ו -20 μl של תרכיזים נגיפיים GATA2 ל 0.68 x 10 6 תאים לכל תגובת ETV2 / GATA2 אחד בבאר 35 מ"מ של צלחת 6-היטב).
  2. הכן hPSCs בתליוני תא בודדיםension.
    1. לגדול hPSCs בתנאים ללא מזין כפי שתואר בסעיף 2. ביום 4 בעקבות המעבר האחרון, להתבונן צפיפות תאים ומורפולוגיה תחת מיקרוסקופ הפוכה. hPSCs צריך לגדול במושבות הדוקות עם קצוות חדים ללא התמיינות ספונטנית ולהגיע ~ confluency 60-70% ביום של התמרה.
    2. בינוני לשאוב, להוסיף 1.5-2 מיליליטר של מגיב תא דיסוציאציה המסחרי (טבלה 1) לכל היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 5-7 דקות.
    3. איסוף תאים לכמויות שווה של מדיום שלם מסחרי (ראה טבלה 2) עם 10 מיקרומטר של מעכבי ROCK, לספור את התאים ולקבוע את הכדאיות. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות ולאחר מכן resuspend תאים בינוניים שלם מסחרי עם 10 מיקרומטר של מעכבי ROCK לריכוז של 3.4-5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
      הערה: כדאיות תא היא קריטיות עבור התמרה ויראלי מוצלחת ובידול שלאחר מכן.בדרך כלל, כדאיות תא לפני התמרה יעלה על 90%.
  3. הוסף 200 μl של ההשעיה התא, המכיל תאי .68-1 x10 6, ל1.3 מיליליטר של מדיום התגובה שהוכן ב3.1.
  4. לשאוב את פתרון המטריצה ​​מצלחת 6-היטב מצופה הלילה הערוך 2.2., להעביר את תערובת התגובה לטובה אחד של צלחת 6-היטב ולהפיץ תאים באופן שווה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות לפחות 80% מהתאים צריכים להיות מחוברים למטריצה.

4. אינדוקציה של Hematoendothelial מבשרי מhPSCs (יום 1-7)

  1. 24 שעות לאחר התמרה-, להסיר בינוני המכיל וירוס ולשטוף תאים מצורפים עם מדיום תרבות תא שלם מסחרי (ראה טבלה 1) ולאחר מכן להוסיף 3 מ"ל לכל טוב של מדיום תרבות תא שלם מסחרי המכילים ציטוקינים hematopoietic: SCF 100 ng / ml, TPO 50 מיליליטר ng /, bFGF 20 ng / ml (להלן כ3F-בינוני).
  2. החלף בינוני מוחלט עם 3F-בינוני טרי בימים 2, 3 ויום 4 להסרת תאים מתים ופסולת. לאחר יום 4, כאשר תאי hematopoietic צפים הם מתעוררים, להחליף מחצית מ3F-הבינוני בכל יום אחר, תוך השמירה על הנפח הכולל ב 4 מיליליטר.
    הערה: פלסמידים ביטוי lentiviral pSIN-EF1α לשלב גן התנגדות puromycin ובכך לאפשר לסלקציה חיובית של תאי transduced. 1 מיקרוגרם / מיליליטר של puromycin ניתן להוסיף עד בינוני במהלך 1-2 הימים הראשונים של בידול לחסל את כל hPSCs מובחן שייר.
  3. שים לב מורפולוגיה תא ביום 4 תחת מיקרוסקופ הפוכה: אשכולות צפופים של תאים עם מורפולוגיה האנדותל טיפוסית מתחילים להופיע (2A דמויות, 3A). תאי דם עגולים מופיעים מיום 5 ליום 7 של בידול, ואילו באזורים מסוימים עשויים לשמור מורפולוגיה hPSCs. לנתח הוא ובידול hematopoietic כמתואר להלן.
    הערה: שונה hematoendothelial מוצלחiation תוצאות בייצור של תאי דם המופיעים תאים עגולים refractile כפי שצורף לתאי האנדותל שטוחים בסיס רופף. תאים אלה באופן פעיל להתרבות יוצרים אגרגטים קטנים, וסופו של דבר לנתק ולצוף (2A דמויות ו3A). תאי דם בשידור חי יכולים להיות מכובדים מבחינה ויזואלית מהתאים המתים וגוססים מבוססים על היכולת שלהם כדי לשקף את האור ולהרחיב בתנאי תרבות.

5. ניתוח של שלב האנדותל (HE) Hemogenic של בידול.

  1. זיהוי היווצרות HE בין ימים 3 ו -4 של בידול על ידי תצפית מיקרוסקופית של תאים עם מורפולוגיה האנדותל. אין תאי דם צפים בתרבות, בשלב זה של בידול. נוכחות שהוא יכול להיות מאושר על ידי צביעת immunofluorescent וזרימת ניתוח cytometric באמצעות נוגדני VE-cadherin, CD73, CD226 וCD43.
    1. כדי להעריך היווצרותו על ידי תאי שימוש ניתוח התזרים cytometric ביום 3ויום 4 מניסוי אחד. איסוף תאים על ידי דוגרים של תרבויות עם מגיב תא דיסוציאציה מסחרי (ראה טבלה 1) למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן להשתמש עד 1 x 10 5 תאים לכל תגובה מכתימה (cytometry זרימת ההליך מכתים המתוארים ב 12).
      הערה: VE-cadherin + HE תאים לרכוש ביטוי של CD226 סמן hematopoietic מוקדם, אבל חוסר הביטוי של CD73 וCD43 6. לעומת זאת, תאים שאינם HE להביע (2B דמויות, 3B) CD73.
  2. מכתים immunofluorescence כי הוא נגזר hPSC.
    1. שטוף את monolayer המצורף של תאים עם מי מלח פוספט (PBS) ולאחר מכן לתקן תאים בparaformaldehyde 4% 30-60 דקות בטמפרטורת חדר.
    2. לשטוף את תאים שוב עם PBS ולאחר מכן Permeabilize באמצעות 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר.
    3. לשטוף את התאים בPBS שני שלוש פעמים ולאחר מכן דגירה בחסימת מאגר בהיקף של PBS עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), למשך 30 עד 120 דקות.
    4. הכן פתרון מכתים, המכיל את שני נוגדנים ראשוניים (1: 1,000 דילול) CD43 אנטי אנושי בעכבר וארנב אנטי אנושי VE-cadherin בPBS עם FBS 5%, (טבלה 1).
    5. לשאוב את מאגר החסימה מהתאים ולהוסיף 1 מיליליטר לכל טוב של חיץ מכתים עם הנוגדנים העיקריים הוסיפו; דגירה 3 שעות בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    6. שוטפים את התאים שלוש פעמים על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS עם 5% FBS.
    7. הכן חיץ מכתים שני, המכיל נוגדנים משני בשעת 1: 500 דילול ב PBS עם 5% FBS: חמור נגד ארנב מצומדות עם צבע ירוק ניאון, ואנטי עכבר מצומדות עם צבע אדום ניאון (טבלת 1). הוסף 1 מיליליטר לכל טוב של חיץ מכתים המשני ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
    8. לשטוף שלוש פעמים עם PBS ללא סרום. תאי כתם עם 300 ננומטר DAPI עובד פתרון ב DH2 O במשך 10-15 דקות.
    9. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים ולהוסיף 2-3 מיליליטר של PBS לתוך היטב עם תאים מוכתמים. שים לב הקרינה עם מסנני מיקרוסקופ ירוקים, אדום וכחול.

6. ניתוח של מבשרי Hematopoietic המושרה

  1. לשמור על תרבויות בידול עד תאים צפים להרחיב באופן משמעותי, עד 10-14 ימים, שינוי מחצית 3F-הבינוני, כפי שתוארו בסעיף 3.1, בכל יומיים.
  2. לנתק ולאסוף ההבחנה monolayers של תאים על ידי טיפול בתאים עם מגיב תא דיסוציאציה המסחרית (ראה טבלה 1) למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. לבצע cytometry זרימה באמצעות אנטי VE-cadherin-, נוגדני CD43 וCD45 להעריך hematopoiesis בתרבויות 12. שים לב שחלק גדול של תאים, עד 40% מתאי ETV2 וGATA2 transduced, שיתוף מבטא VE-CAD וCD43. הנוגדנים הבאים יכולים לשמש כדי לזהות שושלות תאים ספציפיות הבאים דוארxpansion או בידול של אבות דם מושרה: CD235a (תאי erythroid), CD41a (megakaryocytic), CD32 (כל סוגי תאי מיאלואידית), CD66b (נויטרופילים) וCD163 (מקרופאגים).
  4. בצע CFC-assay באמצעות מדיום מסחרי clonogenic (טבלת 1) על פי הוראות היצרן.
    1. העבר 1-2 x 10 4 תאים לתוך 3 מיליליטר של מדיום clonogenic המסחרי (ראה טבלה 3) כדי להעריך את מספר תאי מושבה יוצרים וסוגים של מושבות hematopoietic. צפיפות זריעה אופטימלית מאפשרת זיהוי והבידוד של מושבות אחת שגדלות בנפרד זה מזה ואינו חופף. צפיפות זריעה עשויה להשתנות בין ניסויים בהתאם ליעילות בידול, אבל לא תעלה על 1 x 10 4 תאים לכל 1 מיליליטר של מדיום clonogenic המסחרי.
    2. מערבבים תאים בינוניים clonogenic המסחרי על ידי vortexing העדין, ולהעביר 3 מיליליטר של השעיה לשני מנות של 35 מ"מ מצורף נמוכות במיוחדעבור assay CFC, 1.5 מיליליטר של השעיה לכל מנה. להפיץ בינוני באופן שווה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 14 יום. להימנע מלהפריע המנות; להתבונן הקמת מושבה ביום 7 ויום 10 של assay.
    3. לזהות ולספור מושבות hematopoietic לפי המורפולוגיות ביום 14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התרשים סכמטי של הוא ואינדוקצית דם מhPSCs ידי ביטוי יתר של גורמי שעתוק מוצג באיור 1. ETV2 עם שילוב GATA1 או GATA2 גורם hematopoiesis פאן-מיאלואידית, בעוד GATA2, TAL1 +/- שילוב LMO2 גורם hematopoiesis בעיקר erythro-megakaryocytic. שני שילובי TF ישירות מושרה תאיו שהפכו בהמשך לאבות דם עם ספקטרום שונה של בידול hematopoietic. בידול של hPSCs ממדינת pluripotent לדם הפקה הוא לוקח על 4 ימים בממוצע. תאי דם עגולים יוצאים ראשון ביום 5 של בידול. בהמשך לכך, תאי דם צפים רבים מופי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה מתוארת לעיל לבידול hematopoietic של hPSCs ידי ביטוי יתר של TFS, מייצגת גישה מהירה ויעילה לייצור הוא ואבות מיאלואידית וerytho-magakaryocytic מhESCs וiPSCs, ובכך לאפשר את ייצור תאי דם עד 30 מיליון מ תאי גזע pluripotent מיליון 10. שיטה זו הציגה בידול עקבי בקווי hESC וiPSCs מרובים 10. במהלך בידול על ידי ETV2 וGATA2, גורמי GATA1 כמו גם גורמי GATA2 וTAL1, תאי האנדותל דם יוצרים הפקה, הוא ולעבור האנדותל למעבר hematopoietic. היווצרות הוא בדרך כלל נצפתה בין ימים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

IS היא בעל מניות מייסדים ויועץ לCynata.

תודות

אנו מודים למאט ריימונד על עזרת העריכה. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהמכון הלאומי לבריאות (U01HL099773, R01HL116221 ו-P51 RR000167) וקרן שרלוט גייר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות

טבלה 1. אינדוקציה של התמיינות hPSCs עם גורמי טרנקריפטציה וניתוח של אנדותל ותאי דם המוגניים.

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro Addgeneפלסמיד #61061וקטור לנטי-ויראלי
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro AddgenePlasmid #61063וקטור לנטי-ויראלי
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro Addgeneפלסמיד #61062וקטור לנטי-ויראלי
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro Addgeneפלסמיד #61062וקטור לנטי-ויראלי
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro Addgeneפלסמיד #61064וקטור לנטי-ויראלי
Hexadimethrine bromide (פוליברן) Sigma-Aldrich107689-10Gפולימר קטיוני המשמש להגברת יעילות הזיהום
Y-27632 (דיהידרוכלוריד) מעכב ROCKSTEMCELL Technologies72302מעכב מסלול RHO/ROCK מעכב ROCK
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentLife TechnologiesA11105-01מגיב
מדיום תרבית לא שלם (ללא גורם גדילה)                                                                                          mTeSR1 נוסחה מותאמת אישית מכון המחקר WiCell (מדיסון, ויסקונסין)MCFhuman SCFPeprotech300-07פרימיום כיתה
אנושית TPOPeprotech300-18דרגת מחקר
אנושי FGF-basicPeprotech100-18Bפרימיום כיתה
CD144 (VE-cad) FITCBD Biosciences560411סמן אנדותל (FACS)
CD226 PEBD Biosciences338305Hematopoietic ( FACS)
CD43 PEBD Biosciences560199Hematopoietic (FACS)
CD73 APCR& D SystemsFAB5795Aסמן אנדותל (FACS)
CD45 APCBD Biosciences555485Hematopoietic (FACS)
7AADLife TechnologiesA1310בדיקה חיה/מתה (FACS)
פרפורמלדהיד סיגמא-אולדריץ'P6148-500Gקיבוע תאים 
טריטון X-100 סיגמא-אולדריץ'T9284-500ML פרמיביליזציה 
FBSFisher ScientificSH3007003סרום בקר עוברי
עכבר אנטי אנושי CD43BD Biosciences551457נוגדן טהור וראשוני לצביעת אימונופלואורסצנציה (IF)
ארנב אנטי-אנושי VE-cadherinBenderMedSystemBMS158ראשוני (IF)
אנטי-ארנב Alexa Fluor 488-מצומדJacksonResearch715-486-152משני (IF)
אנטי עכבר Alexa Fluor 594-מצומדJacksonResearch715-516-150 משני (IF)
צבע חומצת גרעין DAPILife TechnologiesD1306 בדיקת חי/מת (IF)
מדיום קלונוגני MethoCult H4435 מועשרSTEMCELL Technologies4435CFC-assay
תמיסת כתמים רייטסיגמא -Aldrich32857צביעת ציטוספינים

טבלה 2. hPSCs culture.

תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מכון המחקר של WiCell (מדיסון, ויסקונסין)hESCs (WA01, WA09) תאי גזע עובריים אנושיים; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ללא טרנסגניםhPSCs מסוגלים להתחדש בעצמם ולהתמיין לתאים של שלוש שכבות נבט
מדיום שלם ללא סרום לתרבית של hPSCs                                                                                                      מדיית mTeSR1   מכון המחקר WiCell (מדיסון, ויסקונסין)M500 ללא סרום  בינוני עם גורמי גדילה לתרבית נטולת מזין של ESC/iPSCs
מטריגלBD Biosciences/ קורנינג מטריצת 356234 לתחזוקת גזעי ESC/iPSCs אנושיים
DMEM/F-12, אבקה Life Technologies12500-062מדיום בסיסי 
אבקת PBS של HyClone Dulbeccoפישר סיינטיפיקdSH30013.04PBS
Dispase II, powderLife Technologies17105-041פרוטאז ניטרלי, דיסוציאציה

טבלה 3. פריימרים לזיהוי אינטגרציה גנומית של נגיף.

שם הפריימר<חזק>פורוורד (Fwd)  5' -->3' <חזק>הפוך (סיבוב) 5'-->3' <חזק>תיאור 
pSIN EF1a FwdTTC CAT TTC AGG TGT CGT GA--EF1a רצף מקדם
GATA1 Rev--TCC CTG TAG GCC AGT GC  אזור קידוד 
GATA2 Rev--GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG&nbsp; אזור קידוד 
TAL1 Rev--AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT  אזור קידוד 
LMO2 Rev--GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC  אזור קידוד 
ETV2 Rev--GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC   אזור קידוד 
דיסוציאציה של תאים של תאים

מקורות

  1. Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
  2. Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
  3. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
  4. Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
  5. Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
  6. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
  7. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
  8. Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
  9. Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
  10. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372(2014).
  11. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
  12. Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6(2007).
  13. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ETV2 GATA1GATA2 TAL1LMO2
אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.