Method Article

תשואה גבוהה ומערכת ביטוי עלות-יעילה של Granzymes האדם בתאי יונקים

DOI:

10.3791/52911

⸱

June 10th, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Medicine Program, Boston Children’s Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Medicine, University of Fribourg, 3Centre Médical Universitaire, University of Geneva

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן מערכת ביטוי גרנזים חסכונית המשתמשת בתאי HEK293T המייצרת תפוקות גבוהות של פרוטאז טהור, מסוכרר לחלוטין ופעיל אנזימטית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTL) או תאי הרג טבעי (NK) מזהים תאי גידול או תאים הנגועים בפתוגנים תוך-תאיים, הם משחררים את תכולת הגרגירים הציטוטוקסיים שלהם כדי לחסל את תאי המטרה ואת הפתוגן התוך-תאי. מוות של תאי המארח ופתוגנים תוך-תאיים מופעל על ידי גרגירי סרין פרוטאזות, גרנזימים (Gzms), המועברים לציטוזול התא המארח על ידי החלבון היוצר נקבוביות (PFN) ולפתוגנים חיידקיים על ידי הממברנה הפרוקריוטית המשבשת את גרנוליזין החלבון (GNLY). כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של מוות תאי מטרה המתווכים על ידי Gzms בהגדרות ניסיוניות במבחנה, יש צורך במערכות ביטוי וטיהור חלבונים המייצרות כמויות גבוהות של אנזימים פעילים. מערכות ביטוי חלבון המופרשות על ידי יונקים מרמזות על הפוטנציאל לייצר חלבון מקופל כהלכה ומתפקד במלואו הנושא שינויים לאחר התרגום, כגון גליקוזילציה. לכן, השתמשנו בשיטת משקעי סידן חסכונית להעברה חולפת של תאי HEK293T עם Gzms אנושי משובט לביטוי pHLsec פלסמיד. טיהור Gzm מהסופרנטנט התרבית הושג על ידי כרומטוגרפיה של זיקה ניקל משותקת באמצעות תג הפוליהיסטידין C-terminal המסופק על ידי הווקטור. החדרת אתר אנטרוקינאז בקצה ה-N של החלבון אפשרה יצירת פרוטאז פעיל שטוהר לבסוף על ידי כרומטוגרפיה של חילופי קטיונים. המערכת נבדקה על ידי ייצור רמות גבוהות של Gzm אנושי ציטוטוקסי A, B ו-M ואמורה להיות מסוגלת לייצר כמעט כל אנזים בגוף האדם בתפוקות גבוהות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gzms היא משפחה של פרוטאזות סרין ההומולוגית מאוד מקומי בlysosomes מיוחד של CTL ותאי NK 1. הגרגרים הרעילים לתאים של תאי רוצח אלה מכילים גם חלבוני שיבוש-קרום PFN וGNLY שפורסמו בו זמנית עם Gzms על הכרת תא מטרה המיועד לחיסול 2,3. ישנם חמש Gzms בבני אדם (GzmA, B, H, K ו- M), ו -10 Gzms בעכברים (GzmA - G, K, M ו- N). GzmA וGzmB הם נפוצים ביותר ונחקר בהרחבה בבני אדם ועכברים 1. עם זאת, מחקרים שנעשה לאחרונה יותר החלו לחקור את מסלולי תא-מוות, כמו גם את ההשפעות ביולוגיות נוספות בתיווך Gzms האחר, שנקרא היתום בבריאות ובחוליים 4.

הפונקציה הידועה ביותר של Gzms, בפרט של GzmA וGzmB, היא האינדוקציה של מות תאים מתוכנת בתאי יונקים, כאשר נמסרו לתאי המטרה על ידי PFN 5,6. עם זאת, יותר מחקרים שנעשה לאחרונה הראו גם השפעות תאית של Gzms עם השפעה עמוקה על רגולציה ודלקת חיסוניות, באופן בלתי תלויים על ידי משלוח cytosolic PFN 7,8. הספקטרום של תאים שנהרגו ביעילות לאחר כניסת cytosolic של Gzms גם התרחב לאחרונה מתאי יונקים לחיידקי 9,10 ואפילו טפילים מסוימים 11. הגילויים האחרונים אלה נפתחו שדה חדש לגמרי לחוקרי Gzm. לכן,, מערכת יונקים ביטוי תשואה גבוהה יעילה וחסכונית באופן משמעותי להקל את הדרך למחקרים עתידיים אלה.

Gzms האנושי, עכבר והחולדה ילידים כבר מטוהר בהצלחה מחלק גרגיר של קווי תאי CTL וNK 12-14. עם זאת, בידיים שלנו התשואה של טכניקות טיהור כזה היא בטווח של תרבות פחות מ -0.1 מ"ג / L תא (תצפית לא פורסם ו -12). יתר על כן, החלטת chromatographic של Gzm יחיד ללא זיהום על ידי טיהורGzms ו / או חלבונים שנמצאים גם בגרגרים r מאתגר (נתונים שלא פורסם ו12,14). Gzms רקומביננטי הופק בחיידקי 15, שמרי 16, תאי חרקים 17 ובאפילו בתאי יונקים כגון 293 HEK 18,19. רק מערכות ביטוי היונקים לשאת הפוטנציאל לייצר אנזימי רקומביננטי עם שינויי posttranslational זהים לחלבון הרעיל לתאים המקומי. שינויי Posttranslational היו מעורבים עם הספיגה הספציפית על ידי אנדוציטוזה והלוקליזציה תאית של פרוטאז בתוך תאי יעד 20-22. לכן, על ידי השימוש בpHLsec 23 (מתנת סוג של ראדו Aricescu והאיבון ג'ונס, אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה) כעמוד שדרת פלסמיד ביטוי Gzm, הקמנו מערכת פשוטה, זמן ועלות-יעילה לייצור חלבון תשואה גבוהה ב תאי HEK293T. pHLsec משלב משפר CMV עם אמרגן Β אקטין עוף; יחד, מרכיבים אלה demonstraטד פעילות האמרגן החזק ביותר בשורות תאים שונות 24. בנוסף, מכיל פלסמיד אינטרון ארנב Β-גלובין, אותות קוזאק והפרשה מותאמים, ליס-6xHis-תג ופולי-אות. ניתן לשכפל מוסיף נוחות בין אות ההפרשה ויס-6xHis התג (איור 1) להבטיח ביטוי אופטימלי ויעילות הפרשה לחלבונים חסרי תחומים N-מסוף מתאימים. לביטוי של Gzms, החלפנו את רצף אות הפרשת אנדוגני עם אות ההפרשה הניתנת על ידי הווקטור אחרי enterokinase אתר (EK) (DDDDK), כך שטיפול EK הופעל Gzms המופרש (Gzms הפעיל להתחיל עם N-המסוף רצף חומצות אמינו IIGG 25). בנוסף לטובת לשיטה זו, תאי HEK293T לצמוח במהירות בינוני במחיר נמוך, כגון בינוני של הנשר (DMEM) השתנה Dulbecco, ומתאימים גם לשיטת transfection סידן-פוספט עלות-יעילה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הפקה של פלסמיד הביטוי pHLsec-Gzm

  1. הכן רנ"א הכל מתאי NK אנושיים (תאים ראשוניים שהוכנו כב -26 או שורת תאי NK NK-92 המבטא את כל חמש Gzms האנושי) בשיטת בידוד RNA מתאימה ולהפוך לתמלל באמצעות ערכה לסנתז cDNA ראשונה גדיל, הבאים manufacturer` המלצות של. להגביר Gzm cDNA באמצעות PCR ושיבוט לpHLsec כפי שתואר ב -23 (מתנת סוג של ראדו Aricescu והאיבון ג'ונס, אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה), תוך שימוש באתרי AgeI וKpnI (איור 1).
    הערה: השתמש בפריימרים הבאים שצוינו בטבלה 1.
  2. אשר מוסיף נכון על ידי רצף. הרחב את פלסמידים ביטוי בתאי DH5α ולטהר באמצעות ערכת בידוד פלסמיד ללא רעלן פנימי ולעקוב אחר ההוראות של היצרן.
  3. Resuspend פלסמידים המטוהרים ב, מים סטריליים ללא רעלן פנימי בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל ​​ולאחסן ב -20 ° C untiשימוש l.

2. ביטוי של Gzms בתאי HEK293T

  1. הכנה של חומרים כימיים
    1. להכין מדיום תרבות סטנדרטי. לנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) גלוקוז המכיל גבוה (25 מ"מ), Glutamax (4 מ"מ), פירובט נתרן (1 מ"מ) להוסיף 10% מסרום סטנדרטי עגל עוברי (FCS), פניצילין (100 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין ( 100 מיקרוגרם / מיליליטר).
    2. הכן בינוני transfection. למדיום תרבות ללא פניצילין, סטרפטומיצין להוסיף 25 מיקרוגרם / מיליליטר chloroquine (להוסיף טרי ביום transfection מ1,000x מניות בPBS, מאוחסנות ב -20 ° C).
    3. הכן בינוני תרבות סרום ללא: עד בינוני סרום ללא לHEK293 תאים להוסיף גלוטמין (4 מ"מ), פניצילין (100 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מיליליטר), ו2.5mg / ב amphotericin L
    4. הכן את הפתרונות שמתוארים בטבלה 2 ומסנן עם מסנן 0.45 מיקרומטר לפני שימוש:
  2. הרחבת תאי HEK293T
    1. לגדל תאי HEK293T ב 20 מיליליטר כתבינוני יור באמצעות 150 x 25 מנות בתרבית רקמת מ"מ.
    2. פיצול תאים ב 80% confluency (מפוצל ביחס של 1: 4, בדרך כלל בכל יום 3 rd). תאים באופן רופף לצרף, הם יכולים להיות מכניים מנותקים ללא trypsinization ידי קפדנות pipetting למעלה ולמטה.
    3. תאי צלחת בלילה שלפני transfection לתת confluency 60-70% ביום transfection (צפיפות זריעה ~ 2 x 10 5 תאים / מיליליטר). גודל הכנה רגיל מורכב של 20 עד 25 מנות תרבות.
  3. transfection סידן פוספט
    1. 1 שעה לפני transfection, לשנות את התרבות בינונית הסטנדרטי למדיום transfection 20 מיליליטר. לקראת סוף שלב דגירה שעה 1 זה, ​​לערבב 400 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד עם 10.95 DDH מיליליטר 2 0 ו1.55 מיליליטר של 2M CaCl 2 בצינורות 50 מיליליטר (צינור 1/5 מנות).
    2. 1 עד 2 דקות לפני transfection, להוסיף 12.5 מיליליטר 2x HBS ל12.5 מיליליטר של פתרון ה- DNA-סידן, לערבב על ידי היפוך של הצינורות ודגירה במשך 30 שניות בRT.
    3. להוסיף התערובת מוכנה בדואר 2.3.2 ישירות לתאים (5 מ"ל לכל צלחת), ירידה מבחינת לתוך המדיום. מפזרים באופן שווה על פני כל השטח, הופכים את המדיום לצבע כתום מעט.
    4. דגירה תרבות המנות ל7-11 שעות בתרבית רקמת חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באוויר humidified). לאחר הדגירה, משקע בסדר גלוי. הסר את מדיום transfection, לשטוף בזהירות עם PBS מראש חימם ולהוסיף בינוני תרבות סרום ללא 20 מיליליטר מוכן ב2.1.3. דגירה של 72 שעות בתרבית רקמת חממה.
    5. לנתח את יעילות transfection וביטוי על ידי הפעלת מדגם (~ 20 μl) של supernatant התא על SDS-PAGE וצביעה עם כחול מבריק Coomassie לדמיין להקת granzyme.
  4. טיהור של Gzms מsupernatant התרבות על ידי ניקל-IMAC
    1. לאחר הדגירה, למזוג את supernatants תרבית תאים למ"ל 250 צינורות וברורים על ידי צנטריפוגה. לבצע ספין ראשון (400 XG, 10 דקות, 4 °ג) שינקה את המדיום מהתאים מנותקים. מעבירים את supernatant ב 250 מיליליטר צינורות וספין טריים ב 4000 XG, 30 דקות ב 4 ° C כדי להסיר כל פסולת תא שנותרה.
    2. הוסף 5 מיליליטר של 5 M NaCl, 6.25 מיליליטר של 2 מ 'טריס-בסיס (pH 8) ו 1 מיליליטר של 0.25 מ' 4 Niso ל250 מיליליטר של supernatant פינה. סנן את supernatant באמצעות יחידת 500 מיליליטר מסנן אבק (0.45 מ"מ).
    3. לאזן טור ניקל-iMac עימו מחייב חיץ (כרכי טור 10, CV) באמצעות מערכת FPLC מתאימה.
    4. החל supernatant פינה לעמודת equilibrated בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר / דקה על 4 מעלות צלזיוס.
    5. לאחר supernatant יושם, לשטוף טור עם החיץ-מחייב עד לנקודת התחלת ספיגת UV (בדרך כלל 10 קורות חיים).
    6. Gzms Elute עם 20 מ"ל שיפוע ליניארית (0 עד 250 מ"מ imidazole) בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר / דקה בעת איסוף 2 מ"ל שברים. לנתח את השברים elution על ידי SDS-עמוד וצביעת Coomassie.
  5. Enterokinase (EK)טיפול וניקוי סופי על ידי כרומטוגרפיה החלפת קטיון
    1. בריכת Gzm מכיל שברים בצינור dialyzing עם ≤10 MWCO. אחסן מדגם קטן ב -20 ° C כשליטה מראש EK.
    2. להוסיף EK ביחידת 0.02 / 50 מיליליטר של supernatant הראשוני ישירות לשבריר נקווה בצינור הדיאליזה ודיאליזת O / N (לפחות 16 שעות) ב RT בEK-חיץ (4 L, שינוי חיץ פעם אחת).
    3. למחרת, לנתח EK טופל Gzms בהשוואה לEK מראש השליטה על ידי SDS-עמוד וצביעת Coomassie.
    4. כאשר עיבוד N-מסוף הוא מלא, לשנות חיץ דיאליזה לS חיץ (4 ליטר) ודיאליזה במשך 4 שעות נוספות בRT. dialysate מסנן (0.45 מיקרומטר).
    5. לאזן S-טור עם א 'חיץ S טען את המדגם על העמודה עם בקצב זרימה של 0.5 מיליליטר / דקה על 4 מעלות צלזיוס.
    6. לאחר טעינת מדגם, לשטוף את העמודה עם חיץ S עד לנקודת התחלת ספיגת UV (כ -10 קורות חיים). Elute Gzms עם שיפוע 30 מיליליטר ליניארי (150 ל -1,000 מ"מ NaCl). דואר GzmAלאוטות ב ~ 650 מ"מ NaCl, GzmB ב ~ 700 מ"מ NaCl וGzmM ב ~ 750 מ"מ NaCl.
    7. לנתח שברי elution ידי SDS-עמוד ומבחני colorimetric (ראה להלן). שברים בריכה המכילים Gzms ולהתרכז (על פי 30, לריכוז של כ -100 מיקרומטר) במסנני ספין (15 מיליליטר, 10 MWCO). Aliquot ההכנות מרוכזות Gzm ולאחסן ב -80 ° C.

פעילות 3. הבדיקה Gzm

  1. הכנה של חומרים כימיים
    1. הכן חיץ assay colorimetric: 50 מ"מ טריס-בסיס, pH 7.
      1. למדידה GzmA, להוסיף Na-CBZ-L ליזין thiobenzyl אסתר (S-Bzl) (BLT) למאגר assay לריכוז סופי של 0.2 מ"מ ו5,5'-dithio-bis (חומצה 2-nitrobenzoic) (DTNB) לריכוז של 0.22 מ"מ. לGzmB, כולל 0.2 מ"מ בוק-עלא-עלא-Asp-S-Bzl (AAD) ו0.22 מ"מ DTNB. לGzmM, כולל 0.2 מ"מ SUC-עלא-עלא-Pro Leu-P-nitroanilide (PNA) (AAPL). פפטידים סינטטיים מתווספים מפתרונות מניות מתאימים (בDMSO, Storאד ב -20 ° C) למאגר טרי לפני assay.
    2. הכן חיץ assay מחשוף: 100 מ"מ NaCl, 50 מ"מ טריס-בסיס, pH 7.5
  2. מבחני colorimetric
    1. להפיץ דגימות קטנות Gzm (<μl 5) משברי elution או מניות מרוכזות בצלחות 96 היטב שטוח תחתון. כולל בקרה חיובית (הכנות Gzm נבדקו או גולמי lysates תא NK) ובקרה שלילית (חיץ בלבד).
    2. להוסיף של חיץ assay 100 μl היטב כל אחד (בעזרת פיפטה רב-ערוצים). דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. למדוד OD ב 405 ננומטר בקורא microplate.
  3. assay המחשוף
    1. עבור מבחני מחשוף באמצעות מצעים מטוהרים, שיתוף דגירה מצע חלבון (יליד רקומביננטי או, 100-400 ננומטר; כמה דוגמאות של מצעי Gzm יעילים מוצגות בסעיף התוצאה ובהערה בסוף הסעיף זה) עם דילולים סידוריים של Gzm (החל מ -400 ננומטר) במאגר assay לזמנים שונים.ניתוח על ידי SDS-עמוד וCoomassie או צביעת כסף; או על ידי מערבי סופג באמצעות נוגדנים ספציפיים.
    2. עבור מבחני מחשוף באמצעות lysates תא, להשעות 10 6 תאי הלה (או כל קו תאים סרטני זמין) ב 1 מיליליטר של חיץ assay וlyse על ידי הקפאה באתנול / אמבט קרח יבש והפשרה על 37 מעלות צלזיוס פעמים שלוש. הסר פסולת תא על ידי צנטריפוגה (15,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C).
    3. שיתוף דגירה lysate פינה עם Gzms בריכוזים ובזמנים שונים כאמור לעיל. מחשוף הוא זוהה על ידי immunoblotting באמצעות נוגדנים מתאימים.
      הערה: כמה דוגמאות של מצעים בתום לב שלנוגדנים מסחריים זמינות: הצעה (BH3 אינטראקצית אגוניסט מות תחום) וcaspase 3 ביקע ידי GzmB 27,28; ribonucleoproteins מרובה הטרוגנית הגרעיני (hnRNPA1, A2 ו- U) ביקע ידי GzmA 29; phosphoprotein ציטומגלווירוס 71 על ידי 30 GzmM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בסעיף הבא נציג תיעוד של הכנת GzmA שלם כדי להאיר את השיטה. אנחנו גם מטוהרים בהצלחה GzmB וGzmM, הפקת תוצאות דומות בכל קשור ליעילות טיהור ופעילות. עם זאת, מהכנות מאוחר יותר אלה שרק מראים כמה חתיכות נבחרות של נתונים. הכנות GzmB מתאי 293T הבאים הפרוטוקול הנוכחי שמשו במספר מחקרים שפורסמו, המדגישות את פעילותם במערכות ביולוגיות שונות assay 9,29,31-34.

טיהור GzmA טיפוסית מוצגת באיור 2 א. transf...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפקיד הקלאסי ונחקר בהרחבה של GzmA וGzmB הוא האינדוקציה של אפופטוזיס בתאי יונקים לאחר לידת cytosolic על ידי חלבון יוצרים הנקבובית 1 PFN. לאחרונה, הספקטרום ציטוטוקסיות של Gzms הורחב באופן משמעותי מתאי יונקים לחיידקים 9,10, כמו גם לטפילים מסוימים 11. יתר על כן, הפונקציות שאינן קלאסיות, תאית של GzmA וGzmB כמו גם את המשמעות הביולוגית של Gzms היתום השונים עדיין מעורפלות. לכן, מערכת ביטוי והטיהור חזקה זמן ועלות-היעילה של Gzms, כפי שנקבע בפרוטוקול זה, תהי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן נוברטיס למחקר רפואי-ביולוגי וממאגר המחקר של אוניברסיטת פריבורג (ל-MW). אנו מודים ל-Li Zhao, Zhan Xu ו-Solange Kharoubi Hess על התמיכה הטכנית, כמו גם ל-Radu Aricescu ו-Yvonne Jones (אוניברסיטת אוקספורד, בריטניה) על אספקת הפלסמיד pHLsec, ול-Thomas Schürpf (בית הספר לרפואה של הרווארד) על דיונים מועילים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TRIzol ReagentInvitrogen15596-026ערכת בידוד RNA כוללת
SuperScript II Reverse TranscriptaseInvitrogen18064-014
Phusion נאמנות גבוהה DNA פולימראזNEBM0530L
EndoFree פלסמיד ערכת מקסיQIAGEN12362
EX-CELL 293 מדיום נטול סרום עבור HEK 293 תאיםSigma14571C
DMEM, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובטGibco31966-021
צינורות דיאליזה SnakeSkin, 10K MWCOThermo Scientific68100
אנטרוקינאז ממעי בקרSigmaE4906רקומביננטי, ≥ 20  יחידות/מ"ג חלבון
HisTrap Excel 5 מ"ל עמודהGE Healthcare17-3712-06 ניקל IMAC
HiTrap SP HP טור 5 מ"לGE Healthcare17-1152-01 עמודת S
N-α-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)SigmaC3647GzmA substrate
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)MP Biomedicals2193608 _10mgGzmB substrate
Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)BachemGzmM substrate
5,5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB)SigmaD8130המגיב של אלמן

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chowdhury, D., Lieberman, J. Death by a thousand cuts: granzyme pathways of programmed cell death. Annu Rev Immunol. 26, 389-420 (2008).
  2. Thiery, J., Lieberman, J. Perforin: a key pore-forming protein for immune control of viruses and cancer. Subcell Biochem. 80, 197-220 (2014).
  3. Krensky, A. M., Clayberger, C. Biology and clinical relevance of granulysin. Tissue Antigens. 73, 193-198 (2009).
  4. Bovenschen, N., Kummer, J. A. Orphan granzymes find a home. Immunol Rev. 235, 117-127 (2010).
  5. Lieberman, J. Granzyme A activates another way to die. Immunol Rev. 235, 93-104 (2010).
  6. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell death and differentiation. 19, 28-35 (2012).
  7. Hiebert, P. R., Granville, D. J. Granzyme B in injury, inflammation, and repair. Trends Mol Med. 18, 732-741 (2012).
  8. Afonina, I. S., Cullen, S. P., Martin, S. J. Cytotoxic and non-cytotoxic roles of the CTL/NK protease granzyme. B. Immunol Rev. 235, 105-116 (2010).
  9. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, 1309-1323 (2014).
  10. Lee, W. Y., et al. Invariant natural killer T cells act as an extravascular cytotoxic barrier for joint-invading Lyme Borrelia. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
  11. Kapelski, S., de Almeida, M., Fischer, R., Barth, S., Fendel, R. Antimalarial activity of granzyme B and its targeted delivery by a granzyme B-scFv fusion protein. Antimicrob Agents Chemother. , (2014).
  12. Thiery, J., Walch, M., Jensen, D. K., Martinvalet, D., Lieberman, J. Isolation of cytotoxic T cell and NK granules and purification of their effector proteins. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit3 37), (2010).
  13. Shi, L., Yang, X., Froelich, C. J., Greenberg, A. H. Purification and use of granzyme B. Methods Enzymol. 322, 125-143 (2000).
  14. Masson, D., Tschopp, J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell. 49, 679-685 (1987).
  15. Lorentsen, R. H., Fynbo, C. H., Thogersen, H. C., Etzerodt, M., Holtet, T. L. Expression, refolding, and purification of recombinant human granzyme B. Protein Expr Purif. 39, 18-26 (2005).
  16. Sun, J., et al. Expression and purification of recombinant human granzyme B from Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 261, 251-255 (1999).
  17. Xia, Z., et al. Expression and purification of enzymatically active recombinant granzyme B in a baculovirus system. Biochem Biophys Res Commun. 243, 384-389 (1998).
  18. Stahnke, B., et al. Granzyme B-H22(scFv), a human immunotoxin targeting CD64 in acute myeloid leukemia of monocytic subtypes. Mol Cancer Ther. 7, 2924-2932 (2008).
  19. Gehrmann, M., et al. A novel expression and purification system for the production of enzymatic and biologically active human granzyme. B. J Immunol Methods. 371, 8-17 (2011).
  20. Metkar, S. S., et al. Cytotoxic cell granule-mediated apoptosis: perforin delivers granzyme B-serglycin complexes into target cells without plasma membrane pore formation. Immunity. 16, 417-428 (2002).
  21. Motyka, B., et al. Mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 103, 491-500 (2000).
  22. Pinkoski, M. J., et al. Entry and trafficking of granzyme B in target cells during granzyme B-perforin-mediated apoptosis. Blood. 92, 1044-1054 (1998).
  23. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
  24. Fukuchi, K., et al. Activity assays of nine heterogeneous promoters in neural and other cultured cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30 A, 300-305 (1994).
  25. Tran, T. V., Ellis, K. A., Kam, C. M., Hudig, D., Powers, J. C. Dipeptidyl peptidase I: importance of progranzyme activation sequences, other dipeptide sequences, and the N-terminal amino group of synthetic substrates for enzyme activity. Arch Biochem Biophys. 403, 160-170 (2002).
  26. Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  27. Barry, M., et al. Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol Cell Biol. 20, 3781-3794 (2000).
  28. Darmon, A. J., Nicholson, D. W., Bleackley, R. C. Activation of the apoptotic protease CPP32 by cytotoxic T-cell-derived granzyme B. Nature. 377, 446-448 (1995).
  29. Rajani, D. K., Walch, M., Martinvalet, D., Thomas, M. P., Lieberman, J. Alterations in RNA processing during immune-mediated programmed cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 8688-8693 (2012).
  30. Domselaar, R., et al. Noncytotoxic inhibition of cytomegalovirus replication through NK cell protease granzyme M-mediated cleavage of viral phosphoprotein 71. J Immunol. 185, 7605-7613 (2010).
  31. Thiery, J., et al. Perforin activates clathrin- and dynamin-dependent endocytosis, which is required for plasma membrane repair and delivery of granzyme B for granzyme-mediated apoptosis. Blood. 115, 1582-1593 (2010).
  32. Thiery, J., et al. Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells. Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).
  33. Thomas, M. P., et al. Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins. J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).
  34. Jacquemin, G., et al. Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis. Cell death and differentiation. , (2014).
  35. Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C. The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).
  36. Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).
  37. Huang, M. T., Gorman, C. M. Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA. Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).
  38. Luthman, H., Magnusson, G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucleic Acids Res. 11, 1295-1308 (1983).
  39. Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity. Biochem J. 197, 239-244 (1981).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Granzyme ExpressionMammalian Cell TransfectionCalcium Phosphate MethodImmobilized Metal Affinity ChromatographyCation Exchange ChromatographyEnterokinase ActivationHEK293T CellsProtein PurificationEnzymatic Activity AssayGlycosylated Protease

Related Articles