הכנה קלילה ויעילה של Glycopolymers פלורסנט Tri-רכיב באמצעות פלמור שליטת רפסודה

סיכום

מודגמת סינתזה יעילה בת שלושה שלבים של גליקופולימרים פלואורסצנטיים מבוססי RAFT, המורכבת מהכנת גליקומונומר, קופולימריזציה ופוסט-שינוי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה להכנת גליקופולימרים סטטיסטיים מבוססי RAFT עם מבנים רצויים.

תקציר

glycopolymers סינטטי הם כלים אינסטרומנטליים ותכליתיים המשמשים בתחומי מחקר ביו-רפואיים ביוכימי ושונים. דוגמא לסינתזה קלילה ויעילה של glycopolymers הסטטיסטי ניאון מבוקר היטב באמצעות שרשרת העברה בנוסף פיצול הפיכה פילמור מבוסס (הרפסודה) הוא הוכיח. הסינתזה מתחילה בהכנת methacrylamide 2-lactobionamidoethyl מכיל β-גלקטוז-glycomonomer מתקבל על ידי תגובה של lactobionolactone וN - methacrylamide (2-aminoethyl) (AEMA). methacrylamide 2-Gluconamidoethyl (GAEMA) משמש כאנלוגי מבני חסר β-galactoside מסוף. תגובת copolymerization תיווך הרפסודה הבאה כרוכה בשלושה מונומרים שונים: N - acrylamide (2-hydroxyethyl) כspacer, AEMA כיעד לתיוג הקרינה נוסף, וglycomonomers. סובלני של מערכות מימיות, סוכן הרפסודה המשמש בתגובה הוא (חומצת 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate.dispersities נמוך (≤1.32), יצירות קופולימר צפויות, ושחזור גבוה של polymerizations נצפו בין המוצרים. פולימרים פלורסנט מתקבלים על ידי שינוי glycopolymers עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein מיקוד הקבוצות הפונקציונליות האמינים הראשוני על AEMA. ספציפיות קטינים מחייבות של glycopolymers כתוצאה מכך הם אומתו על ידי בדיקה עם חרוזים agarose מקביל מצופים בקטיני glycoepitope הכרה ספציפיים. בגלל הקלות של הסינתזה, השליטה ההדוקה של יצירות המוצר והשחזור הטוב של התגובה, פרוטוקול זה יכול להיות מתורגם להכנת glycopolymers מבוססת רפסודה אחרת עם מבנים וקומפוזיציות ספציפיים, כרצונכם.

מבוא

בשני העשורים האחרונים, חקירות עם glycopolymers הסינתטי עברו התפתחות איטית אך מתמשכת, מפגינות פוטנציאל משמעותי לבחינת מנגנוני זיהומיות הכוללים מחקר המתמקד בקטיני הכרת תהליכי ^1-3. מאז glycopolymers הסינתטי בעל moieties סוכר multivalent תערוכה efficacies קטינים מחייבים הרבה יותר גבוה, בהשוואה לפחמימות חד ערכי, הם ביקוש גדול בתחום glycobiology ^3. עניין מיוחד במחקר קליני הוא השימוש בglycopolymers ניאון כדי לאפיין את החיידקים בתיווך הקטינים מחייבים עם פחמימות זמינות על משטחים אנושיים נשימה תא וגליקופרוטאין הרירי. בתחילת לימודים חוץ גופית מועסק glycopolymers מבוסס polyacrylamide זמין מסחרי בבדיקות מחייבות חיידקים. כמה מבדיקות אלה הראו תוצאות מבטיחות, אך העלה חששות בנוגע ל, סטיות obtainability, והרבה-הרבה-בשני polמשקל מולקולרי Ymer ותוכן glycoepitope. פרוטוקול ובמעבדה חסכוני פותח אשר יספק לשליטה מספקת של תוכן מבנה, גודל, וטוהר glycopolymers הסינתטי מיקוד קטיני חיידקים.

בחיפוש אחר גישה סינתטית מתאימה לglycopolymers, טכניקת פילמור חדשה יחסית נבדקה באמצעות סוג של פילמור הרדיקלי המבוקר שהעסיק בשרשרת העברה בנוסף פיצול הפיכה סוכנים (רפסודה) ^4. לאחרונה ריאגנטים רפסודה כגון כבר בשימוש בכמה הכנות glycopolymer ^5-7. בהשוואה לפרוטוקולי הכנת glycopolymer אחרים, polymerizations תיווך הרפסודה להפגין כמה יתרונות, כולל הסובלנות למגוון של מבני מונומר ותנאי תגובה, תאימות פוטנציאלית עם תמיסות מימיות, וdispersity גודל הנמוך של המוצרים פולימריים הרצויים ^8,9. עניין בולט הם פרוטוקולים להכנת הרפסודה-baglycopolymers SED תלת-רכיב, המאפשר שליטה על יצירות של מונומרים שונים, כל אחד מהם עשוי להיות פונקציות שונות ^10-13. עם זאת, רוב מאמצי מחקר הקודמים או חסר anomeric פחמימות תליון ^10, או מועסק על צעד polymerizations וכתוצאה מכך קופולימרים תלת-בלוק, שמורכב מhomopolymers קשור קוולנטית, לעתים קרובות המשמשים למטרות שונות מפולימרים סטטיסטיים שקופולימרים בי הרצף של מונומר שאריות אחרי שלטון ^9-13 סטטיסטי.

לאחרונה, (חומצת 4-cyanopentanoic) העסקת מתחם רפסודת thiocarbonylthio -4-dithiobenzoate בסביבה מימית, ההכנה של קבוצת רפסודה מבוססת glycopolymers תלת-רכיב ליניארי הסטטיסטי המכיל סוכרים תליון ספציפיים ויישומם בחיידקים מחייבים בתיווך קטינים בדיקות דווחו ^14. המטרה הכוללת של שיטה זו, שהוצגה באופן חזותי, היא להכין תלת-רכיבglycopolymers ניאון סטטיסטי באמצעות copolymerization שליטת רפסודה. בגלל הקלות של פרוטוקול פילמור צעד אחד, הבקרה הטובה על אורך הפולימר ויצירות, והשחזור הגבוה של התגובה, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות לסינתזות מבוססת רפסודה אחרות של glycopolymers עם מבנים המבוקשים.

פרוטוקול

1. סינתזה של Glycomonomer 2-Lactobionamidoethyl Methacrylamide

1. לפזר 2 גרם של חומצת lactobionic ב3.0 מיליליטר של מתנול נטול מים ולאט לאט להוסיף אתנול מוחלט באופן חכם ירידה עד הפתרון פשוט הופך מעונן, ולאחר מכן להסיר הממסים באמצעות rotoevaporation.
2. ממיסים את השאריות, מהשלב 1.1, 3.0 במתנול נטול מים מיליליטר ו, שוב, לאט להוסיף אתנול מוחלט עד מעונן פשוט, אז להתאדות הממסים באמצעות rotoevaporation. חזור על פעולה זו 3 פעמים כדי לקבל lactobiono-1,5-לקטון (1.94 גר ', תשואת 98%). מוצר זה הוא של טוהר מספיק כדי לשמש בתגובות הבאות.
3. להוסיף 1.0 גרם של lactobionolactone ב3.0 מיליליטר של מתנול לN - (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA, 0.58 גר ') ואתר monomethyl הידרוקינון (MEHQ, 1.0 מ"ג), מעכב של פילמור העצמי, ב2.0 מיליליטר של מתנול, ואחרי על ידי 1.0 מיליליטר של triethylamine. מערבבים על RT במשך 48 שעות.
4. להוסיף 20 מיליליטר של H ₂ O deionized (DH ₂ O) לבקבוק התגובה, ולאחר מכן להסיר מתנול וtriethylamine בחינם על ידי אידוי ליובש באמצעות rotoevaporation.
5. כדי להסיר כל חומצת lactobionic שנותרה, להוסיף 20 מיליליטר של DH ₂ O, לאחר מכן להעביר את התמיסה המימית דרך עמודת אניוני (OH ^- טופס, 10 מ"מ x 20 מ"מ) לתוך מבחנה המכילה 1.0 מ"ג קבלה של MEHQ.
6. הסר triethylamine, מיוצרת בשלב 1.5, על ידי מתאדה ליובש באמצעות rotoevaporation.
7. להוסיף 20 מיליליטר של DH ₂ O ולהסיר AEMA unreacted ידי הוספה לאט aliquots 1 מ"ג של שרף חילוף קטיון (H ⁺ טופס) עד שלא ninhydrin חומרים תגובתי הם לזיהוי. צג ההסרה על ידי לקיחת aliquots μl 1 לפתרון לאחר כל הוספת שרף, ליישם אותו לצלחת כרומטוגרפיה בשכבה דקה, ואז ריסוס הצלחת עם ninhydrin 2% בפתרון אתנול. כאשר אין צבע כחול עמוק הוא ציין לפתח כאשר הצלחת מחוממת ל -90 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, כבר הגיעה לנקודת הסיום.
8. סנן את הפתרון דרך משפך זכוכית fritted, להעביר את התסנין למבחנה, להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן Lyophilize.
9. הסר MEHQ מהמדגם על ידי המסת החומר מיובש בהקפאה בסכום מינימאלי של מתנול (~ 0.5 מיליליטר), ולאחר מכן להוסיף אצטון נטול מים קרים (-20 ° C, 15 מיליליטר) כדי לזרז את המוצר. לאסוף את המשקע על ידי סינון באמצעות משפך זכוכית fritted, לאחר מכן לייבש המשקע בייבוש תחת ואקום להשיג methacrylamide 2-lactobionamidoethyl (LAEMA) כאבקה מחוץ לבן (0.94 גר ', תשואת 68%). מוצר זה הוא של טוהר מספיק כדי לשמש בתגובות הבאות.

2. סינתזה של מונומר 2-Gluconamidoethyl Methacrylamide

הערה: הכנת methacrylamide 2-gluconamidoethyl (GAEMA), שאינו בעלי סוכר תליון, הותאמה משיטה שפורסמה ^15.

1. להוסיף 2.0 גרם של AEMA המומס ב 10 מיליליטר של מתנול לפתרוןשל D-gluconolactone (1.6 גר ') ב -30 מיליליטר של מתנול ו, עם ערבוב, מוסיף באיטיות 1.6 מיליליטר של triethylamine.
2. מערבבים את התגובה בRT למשך 24 שעות.
3. סנן את המוצר זירז באמצעות משפך זכוכית fritted ולשטוף את המשקע שלוש פעמים עם 10 מיליליטר כל אחד מisopropanol, ולאחר מכן לשטוף עם 10 מיליליטר של אצטון היבש. ייבש את המוצר זירז בייבוש תחת ואקום.

3. רפסודת Glycopolymer סינתזה

1. כדי להסיר את MEHQ הנוכחי בN המסחרי המעכב - (2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA), להוסיף 1 מיליליטר של HEAA לצינור 2 מיליליטר microcentrifuge, ואחריו הוספתי 0.5 גרם של חלקיקי תחמוצת אלומיניום. צנטריפוגה הצינור ב XG 300 במשך 30 שניות, ולהשתמש בHEAA השכבה העליונה בתגובה הבאה.
2. להוסיף 32.8 מ"ג של LAEMA (70.0 μmol), 1.7 מ"ג של AEMA (10.5 μmol) ו27.5 μl של HEAA (270 μmol) בזהירות, כל מומסים ב0.4 מיליליטר של DH ₂ O, לצינור 1 מיליליטר Schlenk ניקה היטב, ובכך יש monomאה יחס טוחנת של 20: 3: 77.
3. בתגובה מקבילה, על מנת לייצר פולימרים שליטה שלא להחזיק כל סוכר תליון, במקום באמצעות LAEMA בשלב 3.2, להחליף 21.4 מ"ג של GAEMA (70.0 μmol) בתגובה.
4. לצינור המתאים Schlenk (כלומר, 3.2 או 3.3), ברצף להוסיף 50 μl של DMF מכיל 0.53 מ"ג של (חומצת 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate (1.9 μmol, סוכן רפסודה), ו -50 μl של DMF המכיל 250 מיקרוגרם של 4,4'-azobis- (חומצת 4-cyanovaleric) (0.9 μmol, יוזם). לערבב בעדינות על ידי קשה באצבע.
5. להקפיא את התוכן הכלול בצינור Schlenk העסקת קרח יבש: אמבטיה אתנול (קרח יבש 75 גרם ב 100 מיליליטר אתנול), תחול ואקום לבתוך 10-50 mTorr, אז סגור את שסתום Schlenk ולאפשר הפתרון ללהפשיר לאט לRT . חזור על מחזור ההקפאה-פינוי-הפשרה זה עוד פעמיים. ודא שכל חומרים כימיים מומסים לאחר ההפשרה האחרונה.
6. מניחים את צינור Schlenk לתואר ראשון פלסטיק סגרg, לפנות האוויר של התיק, ולאחר מכן לאטום אותו. העבר את התיק המכיל את צינור Schlenk לאמבטית מים שחומם מראש ב 70 מעלות צלזיוס ודגירה של 24 שעות.
7. להעביר בזהירות את הפתרון בצינור Schlenk לשקית מוכנה דיאליזה (MWCO = 3,500), ודיאליזה נגד DH ₂ O (10 x 2 L) למשך 24 שעות, שינוי DH ₂ O בכל שעה לשעה 8 הראשונה. בעקבות דיאליזה, להעביר את המדגם מצינורות הדיאליזה למבחנה, להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן Lyophilize זה.

הערה: פולי-methacrylamide / acrylamide הסטטיסטית התוצאה (PMA) קופולימרים המכילים תליון -β-D-galactopyranosyl-D-gluconamide 4 O (lactobionamide) (משלב 3.2) או D-gluconamide (משלב 3.3), בהתאמה, הם הושג. לנוחיות דיון, שתי glycopolymers אלה מקוצרים כמו PMA-LAEMA וPMA-GAEMA, בהתאמה.

4. לאחר שינוי של Glycopolymers עם fluorophores

1. ממיסים 5.0 מ"ג של glycopolymer-LAEMA PMA או PMA-GAEMA מכיל ~ 0.9 μmole של קבוצות פונקציונליות האמינים ראשוני ב0.9 מיליליטר של בופר פוספט (PBS, 0.1 מ 'פוספט נתרן, 0.15 מ' NaCl, pH 7.5), בהתאמה.
2. לאט לאט להוסיף 0.6 מ"ג של succinimidyl אסתר carboxyfluorescein בDMF של 100 μl לפתרונות מהיר עם ערבוב. בעדינות מערבב את התגובות במשך 16 שעות בחושך ב RT.
3. בעוד מוגן מפני אור, טען את המדגם לתוך צינור מוכן דיאליזה (MWCO = 3,500) ודיאליזה נגד DH ₂ O (2 ליטר) במשך 16 שעות, לשנות את פתרון הדיאליזה בכל שעה לשעה 8 הראשונה. בעקבות דיאליזה, להעביר את המדגם מצינורות הדיאליזה למבחנה, להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן Lyophilize זה.

שים לב: בעקבות lyophilization, glycopolymers ניאון PMA-LAEMA-העמסה וPMA-GAEMA-והעמסת, בהתאמה, מתקבל.

5. אפיון של גלאיקופולימרים

1. לקבוע את מספר משקל המולקולרי (n M) הממוצע, המשקל מולקולרי (w M) הממוצע במשקל וdispersity (M w / n M) של glycopolymers על מערכת HPLC מסחרית מצוידות בכרומטוגרפיה חלחול ג'ל תוכנה (GPC), GPC טור מתאים למשקל המולקולרי של עניין, וגלאי שבירה, באמצעות 0.1 M טריס / מאגר M 0.1 נתרן כלורי (pH 7) כeluent בקצב זרימה של 0.6 מיליליטר / דקה ^14. השתמש סטנדרטים פוליאתילן גליקול כסטנדרטי משקל מולקולריים (MW: 200-1,200,000 g / mol).
2. לכמת את הריכוזים בפועל של קבוצות פונקציונליות האמינים הראשוני בתוך glycopolymers ^16. לנתח את תוכן פחמימות הכולל של glycopolymers המסונתזת על פי שיטה שפורסמה ^17.
3. לבצע בדיקות של הרכב וטוהר LAEMA glycomonomers מבניים, GAEMA וglycopolymers PMA-LAEMA, PMA-GAEMA בD ₂ O על ידי ספקטרוסקופיה NMR ¹⁴.

6. בדיקות עקידת Glycopolymers סינטטי עם קטינים מצופים חרוזים agarose

1. להוסיף 1.5 מיליליטר של PBS 50 μl של השעיה של חרוזים Erythrina Crista-גאלי קטינים (ECL) -coated agarose, צנטריפוגה XG ב 300 דקות 1, ולהסיר בזהירות ולהשליך את supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים, ולאחר מכן resuspend את החרוזים ב 0.5 מיליליטר של PBS.
2. הוסף 3 מיקרוגרם של PMA-LAEMA-העמסה או PMA-GAEMA-והעמסת (שליטה שלילית) ב 6 μl של PBS להשעית חרוזים, דגירה התערובות, בחושך, בRT עבור שעה 1.
3. שטוף את התערובות עם 1.5 מיליליטר פעמים PBS שלוש, וחרוזים גלולים ב0.2 מיליליטר של PBS. לטעון aliquot (4 μl) לתוך באר בשקופיות מיקרוסקופ immunofluorescence (מצופה טפלון), מכסה בתלוש לכסות, ולהתבונן על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מסנן FITC (אורך גל עירור: 467-498 ננומטר, אורך גל פליטה: 513- 566 ננומטר) ואובייקטיבי 10X לבחון את הכריכה של tהוא פלורסנט glycopolymers עם חרוזים ^14.

תוצאות

סינתזה של glycomonomer

חומצת Lactobionic שימשה במסמך זה כדוגמא להכנת glycomonomers. תוך שימוש בשיטות בדיווח הראשוני על הסינתזה של LAEMA ^11, תשואות מגוונות בהכנה עם טוהר מספק נצפו. שיטת הטיהור שונה באמצעות שרפים קטיון וחילופי אניון להסיר חומר unreacted ההתחלה הציע תשואת מוצר יציבה וטוהר גבוה, אשר אושר על ידי H ¹ ו- ¹³ ספקטרוסקופיה NMR C (איור 1).

סינתזת glycopolymer רפסודה ופוסט-שינוי של glycopolymers עם fluorophores

בניגוד לגוש-glycopolymers הכין דרך polymerizations הרפסודה יצא, פרוטוקול copolymerization צעד אחד זה מספק הפצת glycomonomer אחידה לאורך עמוד השדרה הפולימר. Glycopolymers מוצג כאן לכלול 20% mol של GLycomonomer, 77% mol של HEAA כspacer, ו -3% mol של AEMA כיעד לפוסט-שינויים (ראה איור 2). ¹ H- ו ^-13 ספקטרוסקופיה C-NMR אישרו את המבנים של PMA-LAEMA וPMA-GAEMA (איורים 3 ו -4). כפי שניתן לראות בתרשים 5, כאשר זממו נגד פרופילי elution GPC של glycopolymer מסונתז ללא רפסודה, שני PMA-LAEMA וPMA-GAEMA יש dispersities נמוך, המוכיחים את יעילותה של גישת הרפסודה. כצפוי, יש PMA-GAEMA M קטן יותר מזה של n PMA-LAEMA בשל החוסר של PMA-GAEMA של סוכר תליון. ניתוח של הפחמימות וקבוצות פונקציונליות אמין ראשוני תוכן של glycopolymers הרפסודה גילה כי היחס של מונומרים בglycopolymers המוצר עולה בקנה אחד עם יחס stoichiometric של החל מונומרים מועסקים בתגובה בתיווך הרפסודה פילמור (טבלת 1). זה מסמל שליטה הדוקה של Compositio מונומרNS בglycopolymers המסונתזת, כפי שתוכנן.

תגובה של קבוצות פונקציונליות האמינים ראשוני עם fluorophores מופעלת היא טכניקה בשימוש נרחב בתיוג חלבון. טכניקה זו הועסקה כאן כדי לתייג glycopolymers המטוהר עם carboxyfluorescein. בעקבות הודעה שינוי-, פולימרים ניאון התקבלו (איור 6). אין השפלה של הפולימרים שכותרתו והעמסת בתגובה זוהתה על ידי ניתוח GPC (מידע לא מוצג).

כריכת בדיקות של glycopolymers הסינתטי עם חרוזים agarose מצופה קטינים

כדי להעריך את הספציפיות מחייבים קטינים של glycopolymers המסונתזת, חרוזים agarose קטינים מצופה עם סגוליות מחייבות פחמימות ידועות היה בשימוש קטינים. Erythrina Crista-גאלי (ECL), שהועסקו בניסויים, יש סגוליות מחייב כלפי β-D-galactoside. איור 7 א ממחיש באופן ברור כי PMA-LAEMA-פלורידהuorescein, המכיל β-D galactoside-כפחמימות תליון, הציג חזק מחייב עם קטיני ECL. לעומת זאת, השלילי מחייב ECL של PMA-GAEMA-העמסת glycopolymer, שאינו בעלי סוכר תליון, מוצג באיור 7. תוצאה זו מדגימה את היעילות וזיקה המחייבות של glycopolymer הניאון המסונתזת.

איור 1. מוקצה ¹ H- (א) ו- ¹³ C-NMR (ב) ספקטרום (D ₂ O) לLAEMA. (נתון זה שונה מואנג et al. ¹⁴⁾ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

איור 2. איור סכמטי של הסינתזה של glycopolymer ניאון PMA-LAEMA מכיל β-galactoside כסוכר התליון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. מוקצה H- () ו ^-13 C-NMR ספקטרום (ב) (ד ₂ O) לglycopolymer PMA-LAEMA. ¹ (נתון זה שונה מואנג et al. ¹⁴⁾ טיעוןse לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. מוקצה ¹ H- () ו ^-13 C-NMR ספקטרום (ב) (ד ₂ O) לPMA-GAEMA. (נתון זה שונה מואנג et al. ¹⁴⁾ אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. עקבות כרומטוגרפיה חלחול ג'ל איור של PMA-GAEMA וPMA-LAEMA מבוססי רפסודה מוכנה עם וללא שימוש בסוכן רפסודה. בניגוד לPMA-LAEMA הוכן ללא רפסודת סוכן (כחול), RAFT- PMA-LAEMA מבוסס (ירוקה) יש dispersity נמוך בהרבה (M w / n M). מבוסס רפסודת PMA-GAEMA (אדום) וPMA-LAEMA יש פרופילי GPC דומים, אבל יש לי לשעבר n M קטן יותר בשל העדר סוכרים תליון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6. PMA-LAEMA לפני ואחרי פוסט-שינוי עם fluorophore. (א) בהשוואה לglycopolymer הלבן שכותרתו אינו (צינור שמאלי), שכותרתו והעמסת PMA-LAEMA תערוכות צבע חזק צהוב (צינור מימין). (ב) תחת UV, PMA-LAEMA שאינו מסומן (צינור שמאלי, 1 מ"ג / מיליליטר PBS) הוא כהה ומציג ללא הקרינה, ואילו PMA-LAEMA כותרת והעמסת (צינור תקין, 1 מ"ג / מיליליטר PBS) מופעים הקרינה ירוקה חזקה.: "Target =" _ //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7. קטיני Crista-גאלי Erythrina חרוזים agarose (ECL) -coated לאגד β-D-galactoside מכיל glycopolymers, ולא אלה לא בעל סוכר תליון. () PMA-LAEMA-והעמסת (3 מיקרוגרם) הפגינה חזקה מחייבת עם ECL , ואילו ב( ב) PMA-GAEMA-והעמסת, אשר ברשותה שום שאריות התליון β-D-galactoside, לא הראה שום מחייב עם חרוזים מצופים קטינים. בר סולם = 100 מיקרומטר.

טבלת 1. ערכי מיקוד של פרמטרים סינטטיים ויצירות בפועל של glycopolymers.) מיקוד ערכים, ערכים שהם רצויים של המוצרים; ב) DP, תואר של פילמור; ג) NA, אינו זמין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

	DP ב	Dispersity	תוכן ממשי של glycomonomers % Mol	תוכן ממשי של אמין ראשוני % Mol
מיקוד ערכים	100	<1.3	20	3
PMA-LAEMA	99	1.26	19	3.2
PMA-GAEMA	89	1.32	NA ג	2.7

דיון

פרוטוקול קליל ויעיל לglycopolymers מבוסס רפסודה תלת-רכיב ניאון, עם ובלי פחמימות תליון, והשימוש בם במבחן מחייב קטינים, באו לידי הביטוי בדוח זה. הפרוטוקול מתחיל עם הכנת LAEMA glycomonomers וGAEMA. דרך copolymerization שליטת רפסודת צעד אחד, glycopolymers עם תשואה לשחזור, הרכב מונומר צפוי וdispersity הנמוך, מתקבל. בעקבות פוסט-שינוי של glycopolymers עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein, המחייב של glycopolymer שכותרתו הניאון המתאים וכתוצאה מכך הוא קושי הניתן לבדיקה לסגולית מחייב קטיניה.

בשלבים הראשוניים של preparative glycomonomers שיועסקו בסינתזות glycopolymer לאחר מכן, חומצת lactobionic זמינה וgluconolactone נוצלו. בתאוריה, כל פחמימות של עניין, מmonosaccharides לאוליגוסכרידים המורכבים, יכולות להיות converteד לglycomonomers ידי conjugating סוכר היעד על קבוצת הידרוקסיל העיקרית על C6 של גלוקוז. בעקבות חמצון של שאריות גלוקוז צמצום, וההתייבשות הבאה שלה ללקטון, המוצר יכול להיות בקלות אז הגיב באמין הראשוני על AEMA כדי ליצור את glycomonomer המקביל. דוגמאות נוספות של מסלול זה ניתן לראות בדו"ח האחרון ^14. יש לציין כי לפני ביצוע כל צעד פילמור, MEHQ, מעכב פילמור חזק, יש להסיר מכל הכנות מונומר וglycomonomer רק לפני השימוש. המטרה זו מושגת בקלות על ידי שימוש בכמות המינימלית של מתנול לפזר glycomonomer שבעל MEHQ לאחר מכן לטפל באופן מיידי את זה עם אצטון ב -20 ° C כדי לזרז את המוצר ללא מעכב בתשואה גבוהה.

חיוני בכל תכנית פילמור רדיקלית, תשומת לב לפרטים וpurities מונומר הם הדגישו. כאופייני למערכת פילמור רפסודה, זה מורכב ממקור קיצוני, מגיב רפסודה, מונומר וממס. במצגת דמיין זו, מערכת פילמור הרפסודה בשלב יחיד מתוארת המתמקדת בייצור של קופולימרים סטטיסטיים שנוצרו מתערובת תגובה בעל שלושה מונומרים שונים בתמיסה מימית. שתי תגובות בתיווך רפסודה נפרדות מוצגות בי אחד מנצלת glycomonomer שבעל תליון, שאינה תחנה סופית הפחתת פחמימות (כלומר, β-D-גלקטוז), והשני, בעל polyol עם שאריות לא פחמימות קשורות. משותף לשתי תגובות בתיווך הרפסודה היו מונומרים בעל קבוצת הידרוקסיל ייחודי המשמשת כמולקולת spacer, ועוד בעלי אמין בחינם לפוסט-שינוי עם fluorophore אמינו-reactive.

מאז הנוכחות של חמצן בתערובת התגובה והסביבה פוגעת בפילמור תיווך רפסודה, הסרתה כדי לעקוב אחר הרמות מושגת בקלות באמצעות כמה הקפאה-אווהמחזורים אחר כך לידיד-הפשרה תוך שמירה על כלי תגובת צינור Schlenk תחת ואקום גבוה.

יש לציין כי היחס טוחנת של מונומרים שונים בתגובה יכול להיות מותאם לפי צורך. כמו כן, על ידי שינוי כמות סוכן הרפסודה משמשת, אורכו של הפולימרים וכתוצאה מכך יכול להיות נשלט על ^18. עם זאת, היחס טוחנת סוכן הרפסודה ליוזם תמיד צריך להיות גדול יותר משני להבטיח dispersity הנמוך של המוצר. בתנאים אלה, את האבולוציה של copolymerization היא יציבה, והשחזור של התגובה הוא גבוה מאוד. עם זאת, אין זה סביר שמתקבל התפלגות אחידה לחלוטין של כל מונומרים המשתתפים בקופולימר סטטיסטי, בשל מהירויות פילמור השונות שלהם. אפיון ההפצה של מונומרים שונים בתוך הפולימר הוא עדיין מאוד מאתגר.

שיטת פוסט-השינוי, שהוצג כאן, היא שני amenabl הפשוט ויותרדואר לשימוש במגוון רחב יותר של תוויות ניאון, בהשוואה לפרוטוקולים אחרים להחיל glycopolymers תווית ^2,11. אלה יכללו רבים של fluorophores האמין-reactive מסיס במים, נקודות קוונטיות, biotins, ואחרים. הם ספציפיות המחייבות של glycopolymers המסונתזת, שכותרתו לאימות בקלות באמצעות קטינים עם זיקות מחייבות ידועות. PMA-GAEMA בעל ללא סוכר תליון הוא שליטה שלילית מתאימה. Glycopolymers עם תוויות ניאון שונות שהוכנו באמצעות מסלול זה שימש בהצלחה בחקירות של קטינים בתיווך חיידקים מחייבים ^14. כפי שהוצג, הכנה קלילה ויעילה זו של glycopolymers ניאון הסטטיסטי אמורה לספק פוטנציאל גדול למגוון רחב של מחקר glycobiological.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנט
חומצה לקטוביונית	סיגמא-אולדריץ	153516-D-גלוקונולקטון
	סיגמא-אולדריץ'	G2164
N-(2-הידרוקסיאתיל) אקרילאמיד (HEAA)	סיגמא-אולדריץ'	697931
תפוז II מלח נתרן	סיגמא-אולדריץ'	O8126
הידרוקינון מונומתיל אתר (MEHQ)	סיגמא-אולדריץ'	54050	מעכב פילמור
N-(2-אמינואתיל) מתקרילאמיד הידרוכלוריד (AEMA)	Polysciences, Inc	24833-5
Triethylamine	Fisher Scientific	BP-616
שרף חילופי אניונים IRN-78 בצורת הידרוקסיד, 80 רשת	Sigma-Aldrich	10343-U
שרף חילופי קטיון 50Wx8, 200 רשת	Sigma-Aldrich	217514
תחמוצת אלומיניום, ~150 רשת	סיגמא-אולדריץ'	A1522	סוג WN-6, ניטרלי, דרגת פעילות סופר I
נינהידרין	סיגמא-אולדריץ'	N4876	תמיסת אתנול של 0.2% נינהידרין שימשה בבדיקה
4-ציאנו-4-(פנילקרבונוטיואילתיו)חומצה פנטנואית	סיגמא-אולדריץ'	722995	סוכן רפסודיה
4,4&פריים;-אזוביס (4-חומצה ציאנובלרית)	סיגמא-אולדריץ'	11588	יוזם פילמור
קרבוקסיפלואורסצאין סוקסינימידיל אסטר	Life Technologies	C1157
Erythrina Cristagalli לקטין מצופה חרוז אגרוז	מעבדות וקטור	AL-1143
Solvent
strong>dH2O			מיוצר על ידי מערכת טיהור המים Barnstead, 18 megOhm-cm
Isopropanol	Fisher Scientific	A461-4	ACS דרגה או טובה יותר
מתנול	Fisher Scientific	A454-4	ACS דרגה או טוב יותר
אתנול מוחלט	Fisher Scientific	BP2818-100	ACS דרגה או טובה יותר
Dimethylformamide	Sigma-Aldrich	22705	ACS דרגה או טובה יותר
אצטון	פישר סיינטיפיק	A929-4	ACS דרגה או טוב יותר
<חזק>ציוד
ממברנת דיאליזה (MWCO: 3,500)	Spectrum Labs	132720
פוליאתילן גליקול תקן אנליטי	סטנדרטי Sigma-Aldrich	O2393
שלנק, 1 מ"ל		קווארק	מותאם אישית
TSK-GEL G4000 PWxl	טוסו ביוסיינס	8022	משמש לניתוח GPC של הגליקופולימרים
Empower 3 עם חבילת GPC/SEC	HPLC של Waters Corporation
	תאגיד		מצויד בגלאי מקדם שבירה (ווטרס 2414) וגלאי פלואורסצנטי (ווטרס 2475)
Avance III ספקטרומטר NMR 800 מגה-הרץ	מיקרוסקופ
BX43	Olympus Corporation		משמש עם מסנן FITC במבחן קשירת הגליקופולימר
Rotavap / Rotoevaporator	Heidolph
Fritted משפך דיסק	פישר סיינטיפיק	10-310-109
Lyophilizer	Labconco
שקופית מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי	Polysciences	18357-1
Revco Ultima Plus -80  ° C מקפיא	מפלסטיק תרמו סיינטיפיק
ומשאבת יד	משאבת
, כונן ישיר, מקסימה C פלוס	פישר מד
	סרג'נט-וולש