על מנת לחקור ארגון מחדש של המוח בתנאים פתולוגיים השתמשנו במשאבות זעירות להעברת חלבון ישירה למוח תוך עקיפת מחסום הדם-מוח. לאחר מכן מוזרקים עוקבי דרכי כדי לחקור שינויים בקישוריות המוח בהשפעת החלבון.
מאמר שיטה
השרשה של Miniosmotic משאבות ומשלוח של קליעים נותבים בדרכי לחקר מוח בארגון מחדש תנאי pathophysiological
במאמר זה
סיכום
תקציר
טיפול תרופתי במודלים של מחלות מוח בבעלי חיים מטיל את הבעיה של פרוטוקולי הזרקה חוזרים ונשנים שעלולים לגרום ללחץ בבעלי חיים ולגרום לרמות רקמה ארעיות של התרופה. בנוסף, העברת תרופות למוח עדינה בשל מחסום הדם המוחי (BBB), ובכך מפחיתה משמעותית את הריכוזים התוך-מוחיים של תרופות סלקטיביות לאחר מתן סיסטמי. לכן, מערכת המאפשרת גם מתן תרופות קבוע ללא רמות שיא וגם עקיפת ה-BBB היא על מנת להשיג ריכוזים תוך-מוחיים גבוהים מספיק של תרופות אטומות ל-BBB. בהקשר זה, משאבות מיניאוסמוטיות מייצגות מערכת אידיאלית לאספקה מתמדת של תרופות בקצב קבוע וידוע החומק מבעיית הלחץ היומי בהזרקה בבעלי חיים ואשר עשוי לשמש גם לאספקה ישירה של תרופות למוח. כאן, אנו מתארים שיטה להשתלת משאבה מיניאוסמוטית וטיפול לאחר ניתוח שיש לתת לבעלי חיים על מנת ליישם בהצלחה טכניקה זו. אנו מטמיעים את פרדיגמת הניסוי הנ"ל בהליכים סטנדרטיים המשמשים לחקר נוירופלסטיות במוחם של עכברי C57BL6. לפיכך, חשפנו בעלי חיים לאוטם מוחי של 30 דקות והשתלנו משאבות זעירות המחוברות לגולגולת באמצעות צינורית על מנת לספק תרופה פרו-פלסטית. בדיקות התנהגותיות נעשו במהלך 30 יום של טיפול. לאחר ההסרה, החיות קיבלו זריקות של עוקבי דרכי אנטרוגרדיות כדי לנתח את הפלסטיות העצבית בשלב הכרוני של ההחלמה. התוצאות הצביעו על כך שההגנה העצבית על ידי התרופה המועברת לוותה בעלייה בסיבים מוטוריים החוצים את קו האמצע של המוח במבני מטרה. התוצאות מאשרות את הערך של טכניקות אלה למתן תרופות ומחקרי פלסטיות מוחית במדעי המוח המודרניים.
מבוא
אספקת חלבונים ותרכובות פרמקולוגיות למוח הן אסטרטגיות חשובות לחקר המנגנונים העומדים בבסיס מחלות מוח ולהערכת מולקולות מועמדות לטיפולים חדשים 1,2. במדעי המוח הניסיוניים, העברת וקטורים כגון פלסמידים או אדנו-וירוסים הפכה לכלי חשוב לחקר פעולות ארוכות טווח של חלבונים במוח 3,4. הזרקות בודדות של וקטורים מציגות את היתרון של מערכת אשר כשלעצמה תשמור על רמות יציבות ביותר של החומר הטיפולי במוח 4. עם זאת, עבור ניסויים ארוכי טווח עם תרופות מטוהרות, מתן מערכתי על ידי הזרקה תוך צפקית גורם ללחץ בעכברים או חולדות, ואינו הבחירה הטובה ביותר כאשר יש צורך בתגובה מוחית ממוקדת, הדורשת גם מינונים גדולים של תרופה5. משאבות מיניאוסמוטיות מייצגות מערכת אידיאלית לאספקה ישירה ממושכת של תרופות למוח על ידי עקיפת הנגישות הנמוכה למוח וגם שיאי ריכוז התרופות, שכן אספקת התרופה מתרחשת ישירות למקום ממוקד במוח ובקצב זרימה קבוע שנקבע על ידי מודל המשאבה שנבחר2,6,7. ואכן, מערכת זו אפשרה לנו לחקור בהצלחה את התאוששות המוח לאחר שבץ מוחי על ידי מתן מספר תרופות כגון אריתרופויטין אנושי רקומביננטי (rhEpo) וגורם גדילה אנדותל כלי דם 6,7.
פלסטיות מוחית חיונית לחיווט מחדש של קשרים בתגובה לפגיעות מוחיות. פלסטיות היא מושג רחב שנע בין היווצרות או חיסול של מגעים סינפטיים, צמיחה של קוצים דנדריטיים וגם התארכות או נסיגה של קשרים למרחקים ארוכים8,9. בעבר האמינו שהמוח אינו מסוגל לשחזר קשרים לאחר נגע. עם זאת, גישות רבות הראו שאם מגורה כראוי היא יכולה להחזיר את הקישוריות 6,7,10. טכניקה אחת שימושית במיוחד לחקר זה היא השימוש במעקב אחר דרכי מסלול. עוקבי דרכי אנטרוגרד הם תרכובות שיכולות להיכנס לתאי עצב בסומה ואז להתפשט לאורך כל האקסונים עד שאלה מגיעים למבני המטרה שלהם. שתי דוגמאות הן כחול מפל (CB) ודקסטרן אמין ביוטיניל (BDA). לעומת זאת, עוקבי דרכי נסיגה, כגון רעלן כולרה B (CTB) או פלואורוגולד (FG) נכנסים לנוירון דרך מסוף האקסון ואז מתפשטים בחזרה לסומה ובכך חושפים את אתר המוצא של נוירונים המכוונים לאתר ההזרקה.
כאן, אנו מציגים את השיטות בהן אנו משתמשים להשתלת משאבות מיניאוסמוטיות לאספקה ישירה של חלבונים או תרופות שיש להן השפעות פוטנציאליות על הפלסטיות העצבית, כמו גם הזרקת BDA ו-FG כדי לחשוף קשרי קלט ופלט לקליפת המוח המוטורית. BDA ישמש גם כדוגמה לעוקב אחר דרכי המשמש להדגמת פלסטיות מוגברת של אקסונים היוצאים מה-co לאחר שבץ מוחי תחת טיפול rhEpo.
פרוטוקול
ניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור הממשלה (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 וG1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung דיסלדורף) המבוסס על NIH הנחיות לטיפול והשימוש בחי מעבדה.
1. הכנת Miniosmotic משאבות
- בסביבת סטרילית (כלומר., מכסה המנוע תרבית תאים), להשיג את המשאבה, קטטר, לזרום מנחה, צינורית עירוי מוח ודיסקי spacer לשמש (איור 1).
- למשלוח של תרופות ישירות לתוך החדרים להשתמש דיסק spacer אחד, כך שרק קצה מחט הצינורית הוא במגע עם החדר. החזק את הצינורית הפוכה עם מלקחיים. להוסיף שתי טיפות של דבק cyanoacrylate (CA) ולהציג את דיסק spacer אחד.
- השאר את הצינורית על משטח שטוח כלפי מעלה כך שהדבק בין דיסק spacer ומתייבש הצינורית.
- חותך את הצנתר בסעיפים של כ -2.5 סנטימטר.
- עבור EAמשאבת ch, להכין מינימאלית של 300-350 μl של הפתרון של עניין כפי שיהיה צורך למלא לחלוטין את המשאבה כך extruding כל האוויר בתוכו כדי למנוע את היווצרותן של בועות בתוך קטטר. בועות תהיה לעכב את זרימת פתרון למוח.
- להתחבר בזהירות את הצנתר לזרימת המנחה.
- באמצעות מזרק 2 מיליליטר מחובר למחט הניתנת על ידי ערכת עירוי המוח, למלא את המשאבה עד כמות קטנה של פתרון בורחת המשאבה, ובכך למנוע בועות אוויר בתוכו.
- למלא בזהירות את זרימת המנחה וקטטר לשים לב כדי למנוע כל בועות שנותרו בתוך קטטר.
- להציג את תזרים המנחה בתוך המשאבה.
- ברגע שמלא, להתחבר בזהירות את הצינורית לסוף קטטר. אם הוא ציין כי בועה נוצר להסיר את הצינורית ובזהירות למלא את הצנתר עם רכב או פתרון סמים ולאחר מכן להחזיר את הצינורית.
- מניחים את puחבר פרלמנט במכל עם תמיסת מלח סטרילית ולהשאיר אותו על 37 מעלות CO / N.
- לפני ההשתלה לבדוק שוב להיווצרות בועה. במידת הצורך (כלומר., בועות הם נצפו) להסיר את הצינורית ולמלא את הצינור. חבר מחדש את הצינורית. זה אמור לקחת רק כמה מיקרוליטר של פתרון.
2. השרשה של Miniosmotic משאבות
הערה: בעלי החיים בניסויים אלה היו מורדמים ידי isoflurane 1% (30% O 2, 70% O N 2). עם זאת, אם זה אינו זמין, השימוש בזריקות intraperitoneal של הרדמה הוא גם אפשרית 11.
- אתר את בעלי החיים במכשיר stereotactic תחת הרדמה ולכסות את העיניים במשחת מגן כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לאשר הרדמה על ידי התבוננות חוסר התגובה בhindpaw כשלוחצים עם האצבעות או עם מלקחיים. לא להמשיך עד שהחיה היא ישנה לחלוטין.
- חותך את הפרווה מעליומודעה או במספריים או מכונה גילוח. חותך ככל האפשר מבלי לפגוע בעור.
- נקה את העור עם 70% אתנול וחומר חיטוי עם תכונות אנטיבקטריאליות ופטריות.
- עם אזמל לפתוח חתך 1 סנטימטר מעט ימינה של קו האמצע ולחשוף את הגולגולת.
- נקה את הגולגולת עם מקלון צמר גפן. משרים אותו עם 70% אתנול ולהעביר אותו מעל הגולגולת. זה יגרום לגולגולת לייבוש.
- אם הגולגולת יש דימום קל, להשתמש cauterizer לחסל את כל נקודות דימום. דם מונע CA מהתייבשות כראוי על העצם אחת הצינורית מושתלת.
- השתמש במכשיר stereotactic לעשות סימן על הנקודה של הגולגולת שבו הצינורית תהיה מושתלת. לאינפוזיות חדרית על קואורדינטות ההמיספרה השמאלית הם -0.2 הזנב מ"מ, 0.9 מ"מ לרוחב גבחת (איור 2 א).
- בעדינות לקדוח מעל גולגולת יצירת זווית 45 מעלות; זה מונע את התרגיל מהולך בטעות לתוך brain. שוב ושוב לקדוח לכמה שניות ולאחר מכן לבדוק כמה עמוק החור הוא. עצור קידוח פעם הגולגולת כבר דלילה אבל עדיין לא חדרה באופן מלא.
- לשבור את קרומי המוח עם קצה מחט סטרילית עד גישה מלאה למוח מושגת. לעשות זאת בעדינות, כדי לא לגרום נזק למוח.
- נקה את הגולגולת עם אתנול 70% באמצעות מקלון צמר גפן.
- להציג את מלקחיים ישר מתחת לעור של החיה בכיוון Antero-הזנב. השתמש במלקחיים כדי לפתוח את החלל שמתחת לעור בחלק האחורי של בעלי החיים שבו המשאבה תהיה מושתלת. להציג את המשאבה לחלק האחורי של החיה עוזבת את הקטטר וצינורית בחוץ (איור 2). המשאבה תישאר בתפקיד זה עד להסרה ואינה זקוק לכל סוג של קיבעון.
- בזהירות במקום ארבע טיפות קטנות של דבק ליד המחט בצינורית.
- להציג בזהירות את המחט דרך הגולגולת בלי לזוז הצידה את זה. להחזיק אותו בעמדה במשך 15-30 שניות until הצינורית מחוברת לחלוטין (איור 2C.1). פעם אחת במקום, הצינורית תגיע 2.5 מ"מ בכיוון הגחון dorso אם דיסק spacer אחד כבר בשימוש. אם מחובר כראוי, הצינורית תישאר מחוברת לעצם עד סוף הניסוי.
- מניחים אצבע אחת על הכרטיסייה הנשלפת ולאחר מכן השתמשתי ביד השנייה כדי לחתוך אותו בצווארו עם סט של מספריים (איור 2C.2).
- לסגור את הפצע על העור עם תפר 5-0 ולהוסיף כמה טיפות של תמיסת povidone- יוד (PVP-I) על גבי הפצע כדי למנוע זיהום (איור 2 ד).
- הזז את בעלי החיים לכלוב חדש. אל תניח חיות פעולה עם בעלי חיים שעדיין לא הופעלו. לשמור על חיות שכבר מושתלות עם משאבות לבד בכלובים שלהם בזמן מתן תרופה.
- אל תשאירו עכברים ללא השגחה עד שהם ערים ויש לי חזרו כיבה sternal.
3. המשאבה Removal
הערה: בדרך כלל הניסוי יסתיים בסוף זמן האספקה אפשר על ידי המשאבה, אבל זה אפשרי כדי להסיר את המשאבה כדי לעשות ניסויים משניים כמעקב למשלוח הסמים. כדי לעשות זריקות נותב בדרכיו היא בכך צורך להסיר את המשאבה.
- מניחים את החיה במכשיר seterotactic תחת הרדמה ולכסות את העיניים עם משחה מגן כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לאשר הרדמה על ידי התבוננות חוסר התגובה בhindpaw כשלוחצים עם האצבעות או עם מלקחיים. לא להמשיך עד שהחיה היא ישנה לחלוטין.
- לפתוח בזהירות את העור על ידי חיתוך דרך החתך נעשה ביום השתלת המשאבה.
- עם מהדק כירורגית מחזיק את הצינורית ולמשוך אותו החוצה. יש להסיר אותו בקלות מהגולגולת. הדימום עדין צפוי, לעצור אותו על ידי הנחת מקלון צמר גפן ולחכות 1-2 דקות.
- משוך את המשאבה על ידי הצנתר. הוּאLP לצאת ידי דחיפתו, יצירת לחץ על העור.
- לסגור את הפצע שוב עם תפר 5-0 ולהוסיף כמה טיפות של PVP-אני.
- הזז את בעלי החיים לכלוב חדש. לא לשים את בעלי החיים פעולה עם בעלי חיים שעדיין לא הופעלו. ניתן לשים בעלי חיים שעברו ניתוח יחד.
- אל תשאירו עכברים ללא השגחה עד שהם ערים ויש לי חזרו כיבה sternal.
- לאפשר לבעלי החיים להתאושש במשך 10 ימים לפני שתמשיך להזרקה נותב בדרכי.
4. לחץ הזרקה בדרכי נותב על 45 מעלות זוויות בימין Motor Cortex
- מניחים את החיה על מכשיר stereotactic תחת הרדמה ולכסות את העיניים במשחת מגן כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה. לאשר הרדמה על ידי התבוננות חוסר התגובה בhindpaw כשלוחצים עם האצבעות או עם מלקחיים. לא להמשיך עד שהחיה היא ישנה לחלוטין.
- פתח את הפצע בראש.
- גלהישען הגולגולת עם 70% אתנול באמצעות מקלון צמר גפן.
- להציג את מזרק זכוכית 5 μl (26s ga) על בעל האנכי של המכשיר. ודא שהקצה התחתון של בעל הזכוכית הוא דווקא בקטע החזקה. המזרק לא חייב להיות רחוק מדי מתחתיו כאז זה יהיה בלתי אפשרי לשים אותו על 45 מעלות מהמצב האנכי ולבצע ההזרקה.
- כוון את המזרק ישירות על גבחת ולאחר מכן אתר את הקואורדינטות הרצויות. להזרקה בקואורדינטות הקורטקס המוטורי הם: נקודת מס '1: 0.5 מ"מ מקורי ו -2.5 מ"מ לרוחב ביחס לגבחת. נקודת מס '2: 1.34 מקורי מ"מ, 2.5 מ"מ לרוחב ביחס לגבחת.
- ברגע שקואורדינטות אותרו, מצביע על עמדתם מעל הגולגולת עם סמן עם קצה דק. הפוך רק נקודה אחת בגולגולת כשחרור דיו מוגזם עלולים להסתיר לתאם הנכון.
- לקדוח בזהירות את הגולגולת מחזיקה תרגיל על 45 מעלות. כמו בשלב 2.8, לבדוק את הגולגולת בתדירות גבוהה כל כך שזה לא Perf מלאצטט כדי למנוע נזק למוח שנגרם על ידי התרגיל. השתמש בקצה מזרק כדי להבטיח שכל העצם הוסר.
- לטעון 600 NL של דילול נותב בדרכי לתוך המזרק.
- התאם את המצב האנכי ל° 45 לכיוון צד ימין של בעלי החיים. מתחת למיקרוסקופ, למקם את קצה מחט המזרק של ממש מול החור.
- להעביר אותו בכיוון האנכי של 1.5 מ"מ. בואו המחט יציבה בעמדה זו במשך 30 שניות עד 1 דקות לפני שאני עושה זריקות לחץ.
- להזריק 300 NL של דילול נותב בשלושה שלבים של 100 NL המופרד אחד מהשני על ידי 30 שניות. לאחר הזריקה האחרונה, לעזוב את המזרק יציב למשך 30 שניות עד 1 דק 'על מנת למנוע נותב לזרום החוצה של המוח.
- לאט לאט למשוך את המזרק, מעביר אותו מעל החור השני ולחזור על אותו התהליך עם 300 NL נותר שנמצאים בתוך המזרק.
- לאחר הזריקה השנייה, להסיר את המזרק ולהמשיך לסגור את wound עם תפר 5-0 ולהוסיף כמה טיפות של PVP-אני.
- הזז את בעלי החיים לכלוב חדש. לא לשים את בעלי החיים פעולה עם בעלי חיים שעדיין לא הופעלו. ניתן לשים בעלי חיים שעברו ניתוח יחד. אל תשאירו עכברים ללא השגחה עד שהם ערים ויש לי חזרו כיבה sternal.
- לאפשר לבעלי החיים להתאושש במשך 10 ימים לפני ההקרבה.
5. בדרכי Tracer תצפית
- להרדים את החיה באופן מלא להנחיות מוסדיות. לאשר הרדמה על ידי התבוננות חוסר התגובה בhindpaw כשלוחצים עם האצבעות או עם מלקחיים. לא להמשיך עד שהחיה היא ישנה לחלוטין.
- Perfuse בעלי החיים עם 4 paraformaldehyde% ב PBS (pH 7) תחת פרוטוקולים סטנדרטיים 6.
- הסר את תיקון המוח ולפרסם אותו על ידי O / טבילת N paraformaldehyde 4%.
- Cryoprotect מוח בסוכרוז 30% עד המוח לשקוע. ואז להסיר את המוח ולהקפיא אותם ב -10 שניות immersion בחנקן נוזלי. לשמור על המוח ב -80 ° C עד חלקים מיוצרים.
- לייצר חלקים ב 20 מיקרומטר לניתוח נותב בדרכי מדרדר וב 40 מיקרומטר לניתוח נותב בדרכי אנטרוגרדית על ידי חתך בcryostate.
הערה: ניתן לצפות נוירונים FG שכותרתו תאים לבנים תחת עירור אור אולטרה סגול. BDA הוא זוהה על ידי O / דגירה N עם avidin ביוטין-peroxidase מורכב וdiaminobenzidine 3,3 'עם תוספת של ניקל ב-0.4% כדי לשפר את הניגודיות של הסיבים 6,7.
תוצאות
הגשנו בעלי חיים עד 30 דקות של חסימת עורק המוח אמצעית בשיטת תפר intraluminal התרמה נגע בסטריאטום עזב ולאחר מכן נמסר rhEpo ישירות לתוך המוח באמצעות משאבות miniosmotic (איור 1, איור 3) במהלך 30 ימים מתחילים 3 ימים לאחר שבץ 6. איור 4 מראה סכמטי של מערכת השדרה cortico שאותר לאחר הזרקת CB וBDA והאזור שבו קליעים נותבים הוזרקו. הראינו שיפור של כוח אחיזה וביצועי מנוע (איור 5) לאחר 14 ו -42 ימים של משלוח rhEpo בהתאמה. משלוח BDA לקליפת המוח המוטורי תקין של בעלי חיים שקיבלו שבץ בסטריאטום השמאל, הראה עלייה בסיבים מוטוריים חוצה את קו אמצע ברמה של הגרעין האדום ופן (איור 5), מדגים מכתים מוצלחת של הנבטה סיבים כ תוצאה של טיפול תרופתי עם miniosmot IC משאבות. טיפול rhEpo גדל גם הישרדות עצבית, עיכב astrocytosis המפוזר, מופחת היווצרות צלקת גליה וגדל אנגיוגנזה בתקופה למדה 6. על ידי שימוש באותה טכניקה זו להזרקה נותב בדרכי שאנחנו יכולים לזהות בהצלחה גרעיני התלמוס שמחוברים לקליפת המוח על ידי הזרקה של FG נותב בדרכי המדרדר (איור 6).
ניתן להבחין באיור 1. רכיבים של משאבת miniosmotic שימוש בפרוטוקול זה. דיסק spacer, צינורית וכרטיסייה נשלפת, קטטר, לזרום מנחה ומשאבת miniosmotic. ההיבט של המשאבה התאספו מלא ניתן לראות באיור 2 א. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ithin עמודים = "1"> 
איור 2. סיכום של נקודות מפתח השתלת משאבה. () העכבר מוצג כמונח על מכשיר stereotactic עם משאבת miniosmotic נבנה באופן מלא לצד זה. חץ מציין את הקואורדינטות שנבחרו להשתלה. (ב) המשאבה כבר הציג על הגב של החיה ורק הצינורית נשארה בצד החיצוני. היבט הגולגולת כבר קדחה. (ג) לראש לאחר השתלה. (ג .1) הצינורית היא בעמדה אבל הכרטיסייה הנשלפת לא נחתכה. (ג .2) הכרטיסייה הנשלפת נחתכה ותפירה של הפצע יכול עכשיו להתחיל. (ד) הכוכבית תערוכות בעלי חיים מושתלים לאחרונה בהשוואה לבעלי חיים 30 ימים לאחר השתלה (#). כאשר שוכנו בצורה נכונה, הפצע צריך להישאר סגור עד סוף ההליך, כפי שמוצג בתמונה."Target =" _ ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. מכתים Nissl המציין את האתר של השתלה בקליפת המוח. חתך קטן ניתן לצפות בחלק מקליפת המוח השמאלי (חץ). הרוחב של אזור חדרה הוא כ -50 מיקרומטר. אין שינויים ברקמה קשים ניכרים על בסיס צביעת Nissl בהשוואה לאזור המקביל הנגדי (*). R: אונה ימנית. L: אונה שמאלית. סרגל = 300 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בדרכי 4. איוראסטרטגית הזרקה נותב כפי שפורסם בעבר על ידי et al Reitmeier. 6,7. (א) באתרי הזרקה מצביעים סכמטי לנותב בדרכי BDA בקליפת המוח המוטורי הנגדית ואילו CB הוזרק בקליפה המוטורית של חצי הכדור בהתקף הלב. סיבים היו במעקב לגרעין האדום (לא מוצג) וגרעין פנים (ראה איור 5). אתר ההזרקה של נותב בדרכי אנטרוגרדית BDA ליד קליפת המוח המוטורי (B) מוצג. שים לב לחץ האדום מציין את מסלול המחט ואילו החץ השחור מראה כמה תאים בקליפת המוח שכותרתו עם BDA. CX: Cortex. CC: כפיס מוח. V: חדר. FN: גרעין פנים. בר סולם בB = 200 מיקרומטר. איור 4 א הוא לשכפל באישור סוג 6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
שחזור איור 5. של מוח בהתקף לב לאחר הלידה של rhEpo. () BDA מוזרק בקליפת המוח המוטורי contralesional לאחר מכן זוהה בסיבי corticobulbar ברמה של גרעין הפנים (גבחת מ"מ -5.8 מ"מ ל-6.3). קווי צומת בכל חצי הכדור נמשכו במקביל לקו האמצע והסיבים חוצים כל קו בכיוון חצי הכדור ipsilesional וcontralesional נספרו והביע כאחוז מסך סיבים שכותרתו בדרכי corticospinal. אריתרופויאטין מוגבר מעברי סיבים בכיוון לנתונים גרעין הפנים contralesional אמצעים + - SD. הנתונים נותחו על ידי כיוון אחד ANOVA ואחרי בדיקות לפחות משמעותיות הבדלים, §P <0.05 בהשוואה לעכברים שאינם איסכמי שטופל רכב. (ב) מנוע התנהגות הראתה שיפור של כוח אחיזת יד ותיאום במבחן מוט רוטה. הנתונים הם ממוצע values + - SD. הנתונים נותחו על ידי מדידות חוזרות דו כיוונית ANOVA, ואחריו בכיוון אחד ANOVA / בדיקות הבדלים משמעותיות לפחות עבור כל נקודת זמן. §P <0.05 לעומת בסיס טרום איסכמי; * P <0.05 בהשוואה לעכברים שטופל רכב איסכמי. איורים 5A ו- B לשכפל באישור סוג 6. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מבני 6. יעד איור הגיעו לאחר ההזרקה של fluorogold (FG). () אתר הזרקה של FG ליד הקורטקס המוטורי כפי שצוין באיור 1. שימו לב לחץ האדום מציין את מסלול המחט וחץ הלבן מצביע על כמה תאים שכותרתו ב הקליפה. (ב) FG מוזרק ליד המנועקליפה מזוהה בVPL. אינטרנט אלחוטי: fimbria. IC: כמוסה פנימית. RT: גרעין התלמוס רשתי. VPL: גרעין posterolateral הגחון התלמוס. סרגל = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דיון
במשך שנים רבות, מחקר על תנאים ניווניות כמו שבץ איסכמי או פגיעה מוחית טראומטית התמקד בפיתוח של טיפולי נוירו שמטרתם לקדם את ההישרדות עצבית בשלב השבץ החריף. הרוב המכריע של טיפולים תרופתיים שנמצאו כיעיל במודלים של מכרסמים נכשלו כאשר תורגמו למרפאת. סיבות לכישלון טיפולי זו כוללות, אך אינן מוגבלות לחוסר השפעת סמים נגרמו כתוצאה מכך נמשך התאוששות נוירולוגית תפקודית. מכיוון שכך, חשוב לפתח אסטרטגיות לקידום שיפוץ מוח בטווח הארוך. בגלל הקידום של הישרדות עצבית הוא לבדן אינו מספיק כדי לאפשר התאוששות שבץ מוצלחת, כפי שהוצע על ידי מספר רב של ניסויי neuroprotection לא מוצלחים, הגירוי של פלסטיות עצבית לאחרונה הושג עניין גדול בתחום.
אמצעים למשלוח סמים הם זריקת intraperitoneal, אני intravascular זנבnjection, הזרקת הירך, זריקה אחת stereotactic של וקטורים לתוך המוח והמשיך מסירה קבועה על ידי משאבות miniosmotic. האחרון יכול כולל משלוח מערכתי, אם המשאבה אין צינורית, או שיכולה להיות איבר מכוון, כפי שהראינו למסירה למוח. למעט משאבות miniosmotic והשימוש בוקטורים ויראליים, כל האסטרטגיות האחרות תגרומנה לריכוזי תרופת תנודות. בניסויים ארוך טווח ובכך הופך אותו צורך להגיש את החיה ללחץ של קבלת זריקות תכופות. BBB מטיל מכשול חשוב לספיגת המוח של חלבונים או תרופות מהדם, וכתוצאה מכך על הצורך של מינוני חלבון או סמים ענקיים כדי להגיע לריכוזים טיפוליים במוח. לדוגמא אל פלגריני et. (2013) 5 נמסרו rhEpo בזריקת intraperitoneal במינון שווה ערך ל 75 / יום IU לבעלי חיים של 30 גרם (750 IU / יום לחולדת 300 ז). לשם השוואה, ממוקד משלוח של rhEpo למוח אפשר לנו להשתמש במינון נמוך בהרבה של רק 10 IU / יום בלימוד שלנו להתאוששות שבץ מוצלחת, שאיפשר לנו להשיג התאוששות על ציר זמן גדול בשיעור קבוע של 0.25 μl / שעה.
בעבודה זו הראינו את השיטה של השתלה של minipumps עם צינורית המחוברת לגולגולת כדי לספק חלבון קידום פלסטיות rhEpo ישירות לתוך החדר, וכך לעקוף את BBB. לפי שיטה זו, rhEpo קידם התאוששות נוירולוגית במספר הדרכים, כולל הפחתה של גודל אוטם, הפחתת היווצרות צלקת גליה ואינדוקציה של אנגיוגנזה. rhEpo גם קידם הישרדות עצבית והגדיל את התחזיות מהקורטקס המוטורי contralesional כלפי הגרעין האדום denervated וגרעינים פנים. ההנבטה של הסיבים התגלתה על ידי הזרקה של נותב בדרכי אנטרוגרדית BDA לקליפת המוח המוטורי (איורים 4 א ו5A). לתאם פונקציונלי להנבטה של הסיבים הוא יחסי הציבורovided על ידי שיפור מיומנויות מוטוריות (איור 5). בנוסף, יש לנו הראינו כי באותה הגישה להזרקה נותב בדרכי יכולה להיות מיושמת לחשוף קשרי thalamo-קליפת המוח על ידי הזרקה של FG נותב בדרכי המדרדר (איור 6).
בהכנה של משאבת miniosmotic, זה קריטי לשקול נקודת היעד והשימוש במפרידים. אנו משתמשים בspacer אחד כדי להפחית את אורכו של המחט על ידי 0.5mm כמו בדרך זו העצה מאוד של המחט היא במגע עם החדר בקואורדינטות נתון (הזנב -0.2 מ"מ, 0.9 מ"מ לרוחב, 2.5 מ"מ dorso הגחון, עם ביחס לגבחת). עם זאת, אם מבנים עמוקים יותר הם היעד של המחקר, אז אין מפרידי יהיו צורך. כמו כן, אם נקודת מסירה חיצונית יותר היא רצויה (כלומר., הקליפה), ולאחר מכן יותר דיסקי spacer יהיה צורך. קטטר צריך להיות ארוך מספיק כדי שהמשאבה לא קרובה מדי לראש, כפי שהוא יהיה לעכב תנועות של mouse, אלא גם באורך מוגזם מושתל לא ארוך מדי כמו פעם עלול לגרום לקטטר להתכופף, ובכך להגדיל את הסיכון להסרת צינורית על ידי התנועה הטבעית של העכבר. סעיף של 2 סנטימטר של קטטר נותן תוצאות טובות מאוד במונחים של ניידות ויציבות של השתל (איורים 1 ו -2). דגירה של המשאבה על 37 מעלות CO / N מאפשרת המשאבה לשאיבה להתחיל מייד התרופה לתוך המוח ברגע של השתלה.
בהשתלת משאבת miniosmotic זה הוא קריטי כדי להבטיח שהגולגולת היא יבשה כראוי לפני השתלת הצינורית. בדרך כלל ניקוי עם 70% אתנול יגרום העצם להתייבש, אבל אם דימום מתמשך נמצא, נוגע בגולגולת בעדינות עם cauterizer יהיה לייבש אותו לחלוטין. זה קריטי כדי להבטיח כי הנהגת המחט היא אנכית וכאיטי ככל האפשר. פעם אחת בעמדה, ואילו הדבק מתייבש, הצבת האצבע על גבי הצינורית מונעת ממנו לזוז הצידה OVאה הגולגולת. טיפול מיוחד צריך להינתן לפצע והמיקום של הצינורית. חשוב שהחתך לא מבוצע בדיוק על קו האמצע של הגולגולת אבל מעט לצד ימין. בעת סגירת הפצע, אם החתך נעשה בקו האמצעי, העור יהיה מתוח יתר על המידה, ובכך להגדיל את הסיכון לפתיחת פצע. ביצוע החתך מעט לצד אחד יאפשר נקודות התפר להיות מהחלק הגבוה ביותר של הצינורית. כתוצאה מכך יהיו פחות מתח בנקודות התפר והפצע להחלים כראוי. בעלי חיים צריכים להיות בכלוב לבד ובדקנו כל יום, במיוחד במהלך 10-15 הימים הראשונים לאחר ההשתלה. במקרה של בקיעת פצע, פצעים צריכים להיות סגורים בהקדם האפשרי. אם הצינורית היא שהוסר או בעלי החיים מציג זיהום, הניסוי שהופסק. מחדש השתלת הצינורית אינה מומלצת. זה מאוד חשוב להשתלה מוצלחת להשתמש בכמויות נאותות של מודעת רקמהhesive (לא יותר מדי!) כפי שהוא מפרק את העצם ומגביר את הסיכון להסרת צינורית. עם זאת שימוש בדבק קטן מדי גם לא להחזיק את הצינורית מחוברת לעצם. משאבות miniosmotic יכולות לשאת תרופות מומסים במגוון רחב של חומרים, להיות המגבלה היחידה לכך שהממס הוא ביולוגית. בנוסף, בהתחשב בכך שהנפח קטן אחד (200 μl) חייב לקבוע אם הריכוז הנדרש לניסוי מתאים ולא יגרום למשקעים בתוך המשאבה.
מערכת מעקב עם קליעים נותבים או אנטרוגרדית או מדרדר היא טכניקה שהוקמה היטב ללמוד קישוריות מוח וגמישות. טיפול חייב להינתן למסגרות stereotactic השימוש בעת הזרקה כדי להבטיח דיוק במיקוד האזור במוח שרוצה ללמוד (כלומר, כדי למנוע זריקה על כפיס המוח כאשר הזרקת הקליפה).
לכל ההתערבות כירורגית וכדי להפחית את הכאב ודלקת, יש להתייחס אל בעלי חיים עם 0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות לפני ההתערבות וCaprofen ב 4 מ"ג / קילוגרם פעם ביום למשך שלושה ימים לאחר ההתערבות.
לסיכום, גישה זו מספקת כלי ראוי ללימוד השפעה של חלבונים או תרכובות תרופתיות במוח נפגע, המייצג את שיטה שמתאימה גם ללימודים בפלסטיות של המוח.
גילויים
עמלות פרסום ייצור וגישה פתוחה הניתנות על ידי חברת DURECT, אשר מייצרת משאבות miniosmotic בסעיף זה.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי קרן ד"ר ורנר ג'קשטדט (לאדוארדו סאנצ'ס-מנדוסה), שירות החילופין האקדמי הגרמני (DAAD; לג'יסמר קרבלו), מועצת המחקר הגרמנית (HE3173/2-1, HE3173/2-2, ו-HE3173/3-1; לדירק מ. הרמן), קרן היינץ ניקסדורף (לדירק מ. הרמן).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| משאבה מיניאוסמוטית של Alzet. דגם 2004. | Alzet | 000298 | Drug Container |
| ערכת עירוי מוח 3 1-3 מ"מ | Alzet | 0008851 | מערכת העברת מוח תרופתית |
| Loctite 454 ג'ל פריזמה | דבק ציאנואקרילט Loctite | 45404 | להדבקת צינורית לגולגולת |
| מזרק זכוכית 75N | המילטון | 87900/00 | הזרקת עוקבי דרכי |
| ביוטין דקסטרן אמין (10,000 מגה-וואט) | בדיקות מולקולריות | N-7167 | עוקב אחר דרכי אנטרוגרד |
| פלואורוגולד | פלואורוכרום, LLC. | Retrograde tract | |
| tracer Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | מכשיר סטריאוטקטי לקביעת קואורדינטות, השתלת משאבה והזרקת עוקב דרך. |
מקורות
- Doeppner, T. R., et al. MicroRNA-124 protects against focal cerebral ischemia via mechanisms involving Usp14-dependent REST degradation. Acta Neuropathol. 126, 251-265 (2013).
- Hoyo-Becerra, C., et al. Rapid Regulation of Depression-Associated Genes in a New Mouse Model Mimicking Interferon-alpha-Related Depression in Hepatitis C Virus Infection. Mol Neurobiol. , (2014).
- Puntel, M., et al. Gene transfer into rat brain using adenoviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, Unit 4.24(2010).
- Miao, J., et al. Overexpression of adiponectin improves neurobehavioral outcomes after focal cerebral ischemia in aged mice. CNS Neurosci Ther. 19, 969-977 (2013).
- Pellegrini, L., et al. Therapeutic benefit of a combined strategy using erythropoietin and endothelial progenitor cells after transient focal cerebral ischemia in rats. Neurol Res. 35, 937-947 (2013).
- Reitmeir, R., et al. Post-acute delivery of erythropoietin induces stroke recovery by promoting perilesional tissue remodelling and contralesional pyramidal tract plasticity. Brain. 134, 84-99 (2011).
- Reitmeir, R., et al. Vascular endothelial growth factor induces contralesional corticobulbar plasticity and functional neurological recovery in the ischemic brain. Acta Neuropathol. 123, 273-284 (2012).
- Hermann, D. M., Chopp, M. Promoting brain remodelling and plasticity for stroke recovery: therapeutic promise and potential pitfalls of clinical translation. Lancet Neurol. 11, 369-380 (2012).
- Overman, J. J., et al. A role for ephrin-A5 in axonal sprouting, recovery, and activity-dependent plasticity after stroke. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E2230-E2239 (2012).
- Wolf, W. A., Martin, J. L., Kartje, G. L., Farrer, R. G. Evidence for Fibroblast Growth Factor-2 as a Mediator of Amphetamine-Enhanced Motor Improvement following Stroke. PLoS One. 9, e108031(2014).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
הדפסות חוזרות והרשאות
