מאמר שיטה

הקלטת פוטנציאל עוררה חזותית במודל עכברוש של demyelination עצב אופטי הניסויי

DOI:

10.3791/52934

⸱

29 ביולי 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 2Save Sight Institute, The University of Sydney

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דה-מיאלינציה מוקדית מושרה בעצב הראייה באמצעות מיקרו-הזרקת ליזולציטין. פוטנציאלים מעוררים חזותיים נרשמים באמצעות אלקטרודות גולגולת המושתלות מעל קליפת המוח הראייתית כדי לבחון את הולכת האות לאורך מסלול הראייה in vivo. פרוטוקול זה מפרט את ההליכים הכירורגיים העומדים בבסיס השתלת אלקטרודות ומיקרו-הזרקת עצב הראייה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקלטת הפוטנציאל המעורר החזותי (VEP) נמצאת בשימוש נרחב בפרקטיקה הקלינית כדי להעריך את חומרת דלקת עצב הראייה בשלב החריף שלה, ולניטור מהלך המחלה בתקופת המעקב. שינויים בפרמטרים של VEP נמצאים בקורלציה הדוקה עם נזק פתולוגי בעצב הראייה. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט על מודל המכרסמים של מיקרו-הזרקה של עצב הראייה, שבו נוצר נגע דמיאלינציה חלקי בעצב הראייה. טכניקות הקלטת VEP נדונות גם כן. באמצעות אלקטרודות מושתלות בגולגולת, אנו מסוגלים לרכוש עקבות VEP הניתנים לשחזור תוך ובין מפגשים. ניתן לרשום VEPs על בעלי חיים בודדים לאורך תקופה כדי להעריך את השינויים התפקודיים בעצב הראייה לאורך. מודל הדמיאלינציה של עצב הראייה, בשילוב עם פרוטוקול ההקלטה של VEP, מספק כלי לחקירת תהליכי המחלה הקשורים לדמיאלינציה ורמיאלינציה, וניתן להשתמש בו כדי להעריך את ההשפעות של תרופות רמיאלינציה חדשות או טיפולים נוירו-פרוטקטיביים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דלקת עצב הראייה היא אחת הצורות הנפוצות ביותר של נוירופתיה אופטית, הגורמת לאובדן ראייה מלא או חלקי1. מבחינה היסטולוגית, הוא מתאפיין בדמיאלינציה דלקתית, אובדן אקסונלי של תאי גנגליון ברשתית ודרגות שונות של רמיאלינציה בעצב הראייה2. דלקת עצב הראייה היא בדרך כלל ההופעה הגלויה של טרשת נפוצה. הפוטנציאל המעורר הוויזואלי (VEP) הוא כלי לא פולשני לחקירת תפקוד מערכת הראייה. הוא משקף את התפקוד הפוסט-רשתית מהרשתית לקליפת הראייה הראשונית ומושפע במצבים רבים של מחלת עצב הראייה3. ה-VEP שימש בעיקר בחולי דלקת עצב הראייה כדי להעריך את תקינות מסלול הראייה4.

ההשהיה של VEP, המשקפת את מהירות הולכת האות לאורך מסלול הראייה, נחשבת למדידה מדויקת של רמת השינויים הקשורים למיאלין בעצב הראייה5; בעוד שמאמינים כי המשרעת של VEP קשורה קשר הדוק לנזק אקסונלי של תאי הגנגליון ברשתית (RGC)6. השערה זו הוכחה היטב באמצעות מודל העכברוש של דה-מיאלינציה של עצב הראייה המושרה על ידי ליזולציטין5.

כאן, אנו מסבירים פרוטוקול מקיף של טכניקת מיקרו-הזרקה של עצב הראייה במכרסמים, שיכול למזער את הנזק הקשור למניפולציה כירורגית לעצב כשלעצמו כמו גם לרקמות הסמוכות כגון שרירים חוץ עיניים וכלי דם. כמו כן, ניתוח השתלת אלקטרודות הגולגולת תואר להקלטת VEP בבעלי חיים7. ניתן לבצע את הקלטות ה-VEP שוב ושוב על בעלי חיים לאורך תקופה מסוימת כדי להעריך שינויים הקשורים לדמיאלינציה/רמיאלינציה וכן את ההשפעה על שלמות האקסונל בעצב הראייה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרת אתיקה: כל הנהלים הקשורים בעלי חיים נערכו בהתאם לקוד האוסטרלי עיסוק לטיפול והשימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות וההנחיות של הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים ברפואת עיניים ומחקר חזון, ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים מאוניברסיטת Macquarie.

1. VEP אלקטרודה השרשה

  1. להרדים את החיה עם זריקת intraperitoneal של קטמין (75 מ"ג / קילוגרם) וmedetomidine (0.5 מ"ג / קילוגרם).
    שים לב: בעקבות אינדוקציה של הרדמה, להתבונן רפלקסים נסיגה (מבחן קמצוץ, רפלקס מצמוץ וpalpebral, וכו ') והיעדרם כאינדיקציה לניתוח מתחילה. הרף לפקח בעלי החיים במהלך הניתוח ולנהל תרופה נוספת הרדמה (10% ממינון קטמין הראשוני לעליון למעלה) אם רפלקסים נמצאים. חולדות בוגרות (> 12 שבועות) משמשות בניסויים.
  2. לגלח את העור של אזור הניתוח.מניחים את החיה על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס) כדי לשמור על טמפרטורת גוף במהלך הניתוח. להכין את העור באמצעות יישום מקומי של povidone- יוד. החל כורך כירורגית. החל משחת עיניים אקטואלי למנוע יובש בקרנית בהרדמה כללית. לשמור asepsis ידי שימוש במכשירים סטריליים.
  3. לעשות חתך בעור אורך על קו האמצע של עור הראש. נקה את רקמת חיבור כדי להשיג חשיפה טובה של הגולגולת.
  4. זהירות, לקדוח חורים בר קטנים באמצעות מקדח יד מיקרו באופן ידני בשעה 7 מ"מ מאחורי גבחת ו -3 מ"מ לרוחב קו האמצע.
  5. אלקטרודות שתל בורג דרך הגולגולת לקליפת המוח (אזור 17), חודר הקליפה עד לעומק של כ -0.5 מ"מ. שתל אלקטרודה בורג התייחסות בקו האמצע מקורי מ"מ 3 לגבחת. החל מלט שיניים ללשים בארגז ולתקן את הברגים (לא תמיד חובה).
  6. לתפור את העור של הראש, לנהל משחה אנטיביוטית על העור ומאפשר לבעלי החיים לRecoVer מהרדמה על כרית חימום.
    הערה: לחלופין, ניתן להשאיר חשופות אלקטרודות, כך עור שלא צריך להיות מחדש בכל הקלטה. מייד עם ההפסקה של ניתוח, אבל לפני התאוששות הרדמה, לנהל תרופה שאינה סטרואידים אנטי דלקתית (NSAID) (אם לא מנוהל מראש אופרטיבי) או משככי כאבים אופיואידים. צג בעלי החיים כל הזמן עד להחלמה מלאה מההרדמה ואמבולטורי באופן מלא.
  7. הרשה שבוע לבעלי החיים להתאושש מהניתוח לפני הקלטת VEP לפחות 1.

2. הזרקת עצב הראייה

  1. להרדים את החיה, להכין את העור ולהחיל כורך כאמור לעיל (1.1 ו -1.2).
  2. לעשות חתך 1 ל -1.5 סנטימטר בעור מעל המסלול של עין שנבחרה באקראי. פתח את הרקמה התת עורית להגיע חלל מסלולית באמצעות מספריים איריס בסדר. פתח את הלחמית וקדמית הכמוסה של שֶׁגֶם מתחת למיקרוסקופ ההפעלה.
  3. לחזור extraocularשרירים ובלוטות דמעות intraobital לחשוף אורך מ"מ כ 3 של עצב הראייה. פתח את שכבות דורה ועניין הארכניאיד סביב עצב הראייה longitudinally באמצעות להב עיניים.
  4. הכנס את פיפטה הזכוכית לעצב הראייה במרחק של 2 מ"מ אחורי לגלובוס. Micropipette הזכוכית מחובר למזרק המילטון.
  5. הזרק lysolecithin 1% (0.4 - 1.0 מיקרוליטר, עם 0.02% הכחול של אוון שאין לי השפעות על myelination) לאט לתוך העצב על פני תקופה של 30 שניות בערך.
  6. לתפור את החתך בעור. החל משחה אנטיביוטית למניעת זיהום. יכולות להיות מוגשות עיני בחור כמו בקרות פנימיות להקלטות אלקטרופיזיולוגיה.
  7. מניחים את בעלי החיים על כרית חימום להתאושש מהרדמה.

3. VEP הקלטה

  1. להרדים את החיה ולהכין את העור כמו 1.1 ו -1.2.
    הערה: במינון נמוך יותר של חומרי הרדמה יכול לשמש לReco אלקטרוrding (40 מ"ג / קילוגרם קטמין וmedetomidine 0.25 מ"ג / קילוגרם).
  2. מניחים את החולדה בחדר חשוך ולאפשר לו להסתגל לחשכה במשך 5 - 30 דקות. במקרים מסוימים חולדות יכולות להיות בהתאמה O הכהה מותאם / N לscotopic או אור מותאם להקלטות VEP photopic 8.
  3. לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 ± 0.5 מעלות צלזיוס על ידי שמיכת מערכת homoeothermic עם בדיקה מדחום רקטלי.
  4. להרחיב את התלמידים עם טיפות עיני tropicamide 1.0%. פתח את העור מעל הגולגולת לגשת באלקטרודות בורג אתר-הונח מראש.
  5. חבר את הבורג מעל נגדי קליפת הראייה של העין מגורה ובורג ההתייחסות למגבר. הכנס אלקטרודה מחט לתוך הזנב כקרקע. למדוד ולשמור על עכבת אלקטרודה להלן 5 ק"ג-אוהם.
  6. הנח ממריץ מיני Ganzfeld ישירות על העור סביב העפעפיים לספק בידוד עין מעולה 7. הארת ממריץ צריכה להיות מכוילת מראשעל ידי פוטומטר.
  7. לספק גירוי photic באמצעות הבזקי אור פי 100 בתדירות של 1 הרץ, עם הגדרות מסנן להקה עוברת נמוכות וגבוהות של 1 הרץ ו -100, בהתאמה. קצב דגימת האות הוא בשעה 5 kHz.
    הערה: יש שנדגמו אותות לפחות בכ 250-300 הרץ על מנת להבטיח שיותר ששתי דגימות שנאספו במהלך כל מחזור.
  8. לתפור את העור בחזרה ולשמור על בעלי החיים על כרית חימום להתאושש מהרדמה. הקלטה ניתן להקליט שוב ​​ושוב על בעלי חיים בודדים לעקוב אחר שינויים פונקציונליים על פני תקופה של זמן.
  9. בנקודת הסיום, לנהל הזרקה מנת יתר של pentobarbitone נתרן (100 מ"ג / קילוגרם, IP) להרדימו. לאשר המתת חסד על ידי דום לב, דום נשימה וירידה של טמפרטורת גוף.

4. רקמות הכנה והיסטולוגיה

  1. הסר את עצבי ראייה מבעלי חיים מומתים מתחת למיקרוסקופ ולתקן הרקמות ב1% O paraformaldehyde / N.
  2. לשטוף את הרקמה ביסודיות עם מי מלח. פנק את הרקמות במעבד רקמות אוטומטיות ולהטביע בפרפין. חלקים חתוכים (5 - 10 מיקרומטר) באמצעות microtome סיבובי.
    הערה: מחקר אימונוהיסטוכימיה, לתקן רקמות בparaformaldehyde 1%, לשטוף עם מי מלח ודגירה עם 30% O סוכרוז / N. רקמת שבץ ב אוקטובר הטבעה בינונית ולעשות cryosections באמצעות cryostat.
  3. סעיפי דגירה בפתרון 0.1% כחולים מהיר כגון Luxol O (באתנול 95%) / N ב 56 מעלות צלזיוס. להבדיל הסעיפים ב0.05% ליתיום קרבונט למשך 30 שניות ולאחר מכן אתנול 70% למשך 30 שניות נוספות. לבסוף, counterstain 0.1% בפתרון סגול cresyl למשך 30 שניות לפני ההרכבה החלקים. השתמש בכתמים הכחולים מהירים לזהות המיאלין בעצב הראייה 5.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עקבות VEP התוך sessional שחזור מוצגות באיור 1 ועיכוב משמעותי בהשהית N1 ניתן לראות לאחר הזרקת עצב הראייה. נגעי עצב ראייה חלקיים של demyelination ניתן לצפות בקטעים היסטולוגית באמצעות מכתים הכחול מהיר Luxol 5. איור 2 מראה קטע נציג עם נגע demyelinated מוקדי קטן במרכז של עצב הראייה. שים לב שהחתך אינו מייצג נפח כולל של נגע. אזור demyelinated ניתן למדוד בכל חתך ברציפות של העצב להסיק באמצעות שחזור תלת ממדי נפח הנגעים. אנחנו הוכחנו מתאם חזק בין ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצב הראייה רגיש מאוד לנזק מכני. פגיעה בריסוק עצב הראייה במשך 1 שניות יכולה להוביל לאובדן של כ-75% של RGC במשך תקופה של שבועיים10. לכן, נדרשת זהירות רבה בעת ביצוע ההליכים הכירורגיים. על פי ניסיונם של המחברים, עדיף בהרבה לאמץ גישת דיסקציה קהה כדי לחשוף ולפנות דרך הרקמות סביב עצב הראייה לאורך כיוון העצב, מאשר לחדור בכיוון מאונך לעצב הראייה. כמו כן, יש לפרוש את הדורה והארכנואיד לאורך כדי למנוע נזק דמוי אקסוטומיה לאקסוני ה-RGC. הכחול של אוון משמש בדרך כלל כדי להקל על המיקרו-הזרקה, מכיוון שנוכחות הצבע הופכת את העצב ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאף אחד מהכותבים אין אינטרסים מתחרים או אינטרסים מנוגדים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי רפואת עיניים מכון המחקר של אוסטרליה (אוריה). אנו מודים לפרופ 'Algis Vingrys וד"ר המפץ וי, אוניברסיטת מלבורן, בתחילה עוזר לנו לפתח את טכניקת הקלטת VEP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קטמין 100 מ"ג/מ"ל (קטמיל)Troy LaboratoriesAC 116
Medetomidine 1 מ"ג/מ"ל (Domitor)פייזרsc-204073
טרופיקמיד 1.0% (Mydriacyl)Alconsc-202371
מערכת שמיכה הומו-תרמיתהרווארד מכשירNC9203819
מד עכבה דשאF-EZM5
אלקטרודות בורג מיקרו מחבריםM1.0&; חריץ Csk 3 מ"מ M/T 304 S/S
אלקטרודות מחט תת-עוריות דשאF-E3M-72
תיקון מהיר DeguDent GmbH
דיודה פולטת אור NichiaNSPG300A
BioamplifierCWE, Inc.מערכת BMA-400
CEDקיימברידג' עיצוב אלקטרוני, בע"ממזרק Power1401
המילטון המילטון87930
ליזולציטיןסיגמאL4129
אוון s כחול סיגמאE2129

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balcer, L. J. Clinical practice. Optic neuritis. N Engl J Med. 354 (12), 1273-1280 (2006).
  2. Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
  3. Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
  4. Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
  5. You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
  6. You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662(2012).
  7. You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
  8. Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
  9. You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
  10. Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
  11. Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
  12. Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
  13. Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
  14. Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
  15. Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
  16. Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
  17. Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
  18. Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VEPLuxol Fast Blue

מאמרים קשורים