מאמר שיטה

מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

DOI:

10.3791/52948

⸱

12 ביוני 2015

 ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, California State University, Long Beach, 2Ximedica, 3School of Engineering, Brown University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדידת תאים היא חלק חשוב בהתפתחות ובחיים האנושיים. על מנת להבין את המנגנונים שיכולים לשנות את נדידת התאים, אנו מציגים מערכת דיפוזיה של שיפוע מישורי כדי לחקור כימוטקסיס במטריצת קולגן תלת מימדית, המאפשרת להתגבר על מגבלות תא הדיפוזיה המודרניות של מבחנים קיימים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן לראות את חשיבות נדידת התאים דרך התפתחות חיי האדם. כאשר תאים נודדים, הם מייצרים כוחות ומעבירים את הכוחות הללו לסביבתם, מה שמוביל לתנועת תאים ונדידה. על מנת להבין את המנגנונים שיכולים לשנות ו/או להשפיע על נדידת התאים, ניתן לחקור את הכוחות הללו. בתיאוריה, הבנת המנגנונים והכוחות הבסיסיים העומדים בבסיס נדידת התאים טומנת בחובה הבטחה לגישות יעילות לטיפול במחלות ולקידום השתלת תאים. למרבה הצער, תאי כימוטקסיס מודרניים שפותחו מוגבלים בדרך כלל לשני ממדים (2D) ויש להם שיפועי דיפוזיה מורכבים המקשים על פירוש הניסוי. לשם כך, פיתחנו, ותיארנו במאמר זה, תא צפייה ישירה למחקרי כימוטקסיס, המאפשר להתגבר על מכשולים מודרניים בתא הכימוטקסיס המסוגלים למדוד כוחות תאים וריכוז ספציפי בתוך התא בסביבה תלת מימדית כדי לחקור נדידת תאים תלת מימדית. משכנעת יותר, גישה זו מאפשרת למדל בהצלחה דיפוזיה באמצעות מטריצות קולגן תלת מימדיות ולחשב את מקדם הדיפוזיה של חומר כימואטרקטיבי באמצעות ריכוזים שונים מרובים של קולגן, תוך שמירה על המערכת פשוטה וידידותית למשתמש עבור ניתוח מיקרוסקופ כוח משיכה (TFM) ומתאם נפח דיגיטלי (DVC).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התנועה העדיפה תאי כיוון מפל ריכוזים, הידוע בשם chemotaxis, ממלאת תפקיד חשוב בתהליכים פתולוגיים ופיסיולוגיים בגוף. דוגמאות כאלה הן ריפוי עור ורירית פצע 1, המורפוגנזה 2, דלקת 3, ו4,5 צמיחת גידול. כמו כן, הוכיח כי תאים סרטניים יכולים לנדוד דרך שתי אסטרטגיות תא-ההגירה האישיות וקולקטיביות 6. יתר על כן, מנגנוני חוסר יציבות diffusional יכולים לגרום להפרדה של תאים בודדים או התקבצו מגוף / אובייקט tumorous ואז יכול לעלות לכיוון מקור של חומרים מזינים ובכך לפלוש אזורים ורקמות 7 רחבים יותר.

יתר על כן, הוכיח כי מנגנוני ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיצוב עובש 1. 3D וחלקים

  1. עובש
    1. לפני העבודה, לקבל ערכת אלסטומר סיליקון, חדר הדמיה תא חי, coverslip זכוכית 22 מ"מ, וקוביית מתכת אלומיניום במכונה עם ממדים 10.07 מ"מ x 3.95 מ"מ x 5.99 מ"מ. הכן את חדר ההדמיה תא החי לדפוס על ידי הצבת coverslip בבעל תחתית והרכבה שאר הקאמרית בבימויו של כספק.
    2. בשלב הבא, באמצעות מלקחיים, למקם את קוביית מתכת ואלומיניום במכונה באמצע דיור תא ההדמיה תא החי ועל גבי coverslip, ולאחר מכן ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת של assay זה להעריך את ההגירה של התאים במדויק מסתמכת על הגדרה טובה של המערכת. לכן, זה קריטי עבור לוודא לעצב את תבנית מערכת דיפוזיה מדויקת ודואגים גדולים בהצבת coverslips שני הידרופובי והידרופילי, כפי שמודגם באיור 1. אם המערכת מתוכננת כראוי ובשלב דוגמנות דיפוזיה הבטחה למצוא מאוד טוב קו הזינוק ליניארי, אחד הוא מסוגל להשיג נחמד מאיר תמונות, כמתואר באיור 2, לניתוח דיפוזיה של המערכת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים ביותר לניסויי דיפוזיה מוצלחים עם או בלי תאים הם: כראוי הקמת ההרכבה העובש; פיתוח המיומנות הידנית הנחוצה כדי למנוע נזק במהלך החילוץ של coverslips הידרופובי; הבטחה למצוא קו זינוק ליניארי טוב מאוד כדי לחשב את מקדם הדיפוזיה כראוי; לתקן חישובים ניסיוניים של שני קולגן וchemoattractant; נכון להשתמש במערכת הדמיה תא חי כדי להבטיח מטריצה ​​לא להתייבש; ושמירה על תרבות סטרילי, בריאה.

בעת ביצוע ניסויי דיפוזיה, .......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לד"ר ג'ונתן רייכנר ואנגל בירד על תובנות הניסויים בתאים. תוכנית מלגות המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע (GRFP) תמכה בעבודה זו.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת אלסטומר סיליקוןDow Corning Corp182 SIL ELAST KIT .5KGמיסטור דו-חלקי עם תא הדמיה של תא חי מעורב 10:1
מכשיר תא חיCM-B18-1CMB ל-18  כיסויים עגולים מ"מ
22  מ"מ כיסוי זכוכיתFisher ScientificNC0180281Neuvitro Corp. תלוש כיסוי 22  מ"מ 1.5
מתכת אלומיניום במכונה
סכין שירות תחביבX-ActoX3201
3-(אמינופרופיל) trimethoxysilaneSigma-Aldrich281778-5ML
GlutaraldehydePolysciences, Inc00216A-10Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 מ"ל צינורFisher Scientific14-432-22קומה סטנדרטית צנטריפוגות דגם ושולחן
צלחת פטרי מזכוכיתפישר סיינטיפיק08-747Aכלי פטרי לשימוש חוזר: שלם (60 x 15  מ"מ)
מלקחייםפישר סיינטיפיק22-327-379משקפי כיסוי מלקחיים עדינים
פישר סיינטיפיק12-518-105Aמלבן; 30 x 22  מ"מ; עובי מס' 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctylג'לסטSIT8174.0
חומצה אצטיתסיגמא-אולדריץ'320099מגיב ACS חומצה אצטית, ≥ 99.7%
הקסאןסיגמא-אולדריץ'296090נטול מים, 95%
אלכוהול אתיליסיגמא-אולדריץ'E7023200 הוכחה, לביולוגיה מולקולרית
כלי שרבוט יהלומים דיוק גבוהLunzerPV-081-3סופר קצה מורחב ישר, .020 אינץ' (.50  מ"מ) בקוטר של 0.200 אינץ' (5.0  מ"מ) אורך קצה
גריז ואקוםדאו קורנינג14-635-5Cגריז ואקום
גבוה 15 מ"ל צינורפישר סיינטיפיק14-959-49D15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים עם משטח הידרופובי, אינרטי ביולוגית
10x תמיסת חוצץ פוספטפישר סיינטיפיקBP399-5001.37 מ' נתרן כלורי, 0.027 מ' אשלגן כלורי ו-0.119 מ' מאגר פוספט
1  N נתרן הידרוקסידSigma-Aldrich38215תרכיז נתרן הידרוקסיד
קולגן I, זנב עכברושBD Biosciences354236זנב חולדה 
צינור מיקרו צנטריפוגהפישר סיינטיפיק02-681-332נפח: 2.0 מ"ל;
OD x L: 13  x  40  מ"מ;
סטרילי; עטיפה
[header]
מיקרוספירות שעברו שינוי קרבוקסילטInvitrogen  F-8813מיקרוספירות שעברו שינוי קרבוקסילאט, 0.5 ומיקרו; m, פלואורסצנטי צהוב-ירוק (505/515), 2% מוצקים
רודמיןסיגמא-אולדריץ'83689רודמין B לפלואורסצנטי
קוביית אחת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225 (2), 236(1997).
  2. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8 ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים