מאמר שיטה

דגם של רקמות עצביות מקוטב מבוסס משי-קולגן מהונדס 3D

12.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52970

⸱

23 באוקטובר 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Tufts University, 2Department of Pediatrics, University of Connecticut Health Center & Connecticut Children's Medical Center

במאמר זה

סיכום

תובנה לגבי הפעולות המורכבות של המוח דורשת כלי מחקר מתקדמים. כאן אנו מדגימים מודל תלת מימדי חדש מבוסס משי-קולגן של רקמה עצבית הדומה לארכיטקטורה דמוית מוח. המודל יכול לשמש לחקר הרכבת רשת עצבית, הנחיה אקסונלית, אינטראקציות תא-תא ופעילות חשמלית.

תקציר

למרות מאמצים כבירים לפענח את האנטומיה, ההרכב והתפקוד של המוח, הוא נותר האיבר הכי פחות מובן בגוף האדם. כדי להשיג הבנה מעמיקה יותר של המערכת העצבית, מדענים שואפים לשחזר את הרקמה באופן פשטני על ידי הרכבתה במבחנה מאבני בניין בסיסיות באמצעות גישה של הנדסת רקמות. הקבוצה שלנו פיתחה מודל תלת-ממדי דמוי מוח מבוסס משי וקולגן מהונדס רקמות הדומה לחומר הלבן והאפור של קליפת המוח. המודל מורכב מספוג נקבובי משי, שנזרע מראש בתאי עצב שמקורם במוח של חולדות, שקוע במטריצת קולגן רכה. צמיחה עצבית מקוטבת והיווצרות רשת נצפית עם לוקליזציה אקסונלית וגוף תא נפרדת. ארכיטקטורה מדורית זו מאפשרת פיתוח ייחודי של נישות המחקות רקמה עצבית מקומית, ובכך מאפשרת מחקר על הרכבת רשת עצבית, הנחיה אקסונלית, אינטראקציות תא-תא ומטריצת תא ותפקודים חשמליים.

מבוא

מערכת העצבים המרכזית (CNS) יכולה להיות מושפעת ממגוון רחב של הפרעות מעורבות כלי דם, מבניים, תפקודי, מדבקות או ניוונית. 6.8 מיליון אנשים מתים בכל שנה כתוצאה מהפרעות נוירולוגיות, המייצגת את נטל כלכלי-חברתי גובר בעולם 1. עם זאת, יש לי רק מעטים מן ההפרעות טיפולים זמינים. לכן, יש צורך קריטי לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות לחולים הסובלים מהפרעות נוירולוגיות. למרבה הצער, תרופות ממוקדות במערכת העצבים המרכזית רבות נכשלות במהלך ניסויים קליניים, בין שאר בשל השימוש במודלים לקויים פרה-קליניים מחקר, אשר אינו מאפשרים הערכה של השפעות אקוטיות וכרוניות עם קריאות פונקציונליות מבחינה פיזיולוגית-רלוונטיות.

למרות מאמצי מחקר משמעותיים בעשורים האחרונים, יש כמות עצומה לא ידועה על המבנה והתפקוד של מערכת העצבים המרכזית. על מנת לקבל יותר ידע, מודלים של בעלי החיים הם לעתים קרובותאד מודל מצבים פתולוגיים, כגון פגיעה המוחית טראומטי (TBI) או דמנציה, במיוחד במחקרים פרה-קליניים. עם זאת, בעלי חיים שונים באופן משמעותי מבני אדם הן באנטומיה של מערכת העצבים המרכזית, כמו גם בתפקוד, ביטוי גנים וחילוף חומרים 2-4. מצד השני, תרבויות 2D במבחנה הן השיטה הנפוצה לחקור ביולוגיה של תא ומשמשות באופן שגרתי לגילוי סמים. עם זאת, בתרביות תאי 2D חסרות מורכבות ורלוונטיות פיסיולוגיים לעומת המוח האנושי 5-7. אמנם אין תחליף לעלות הנמוכה ופשטות של לימודי תרבות תא 2D או המורכבות הניתנות על ידי מודלים של בעלי חיים, הנדסת רקמות 3D יכולה ליצור מודלים מחקר משופרים כדי לסגור את הפער שקיים בין 2D במבחנה ובגישות vivo. הנדסת רקמות 3D מספקת תנאי ניסוי יותר מבחינה פיזיולוגית-רלוונטיים שהושגו על ידי אינטראקציות תא-תא 3D ורמזים תאיים הניתנים על ידי הפיגומים ביולוגי. DespITE הראיות משמעותיות מאחורי הערך של תרבויות 3D, יש כיום רק כמה מודלים 3D במערכת העצבים המרכזית רקמות כגון תרבויות מקורן בתאי גזע organoid 8-10, neurospheroids 11 ופזרו תרבויות הידרוג'ל 12,13. שיטות טכניות מתקדמות, כולל ליתוגרפיה הרבה השכבתית 14, והדפסת 3D 15 כבר נוצלו ללימוד ריאות, כבד, ורקמת כליה. עם זאת, יש חוסר של מודלים 3D של מערכת העצבים המרכזית, המאפשרים לצמיחה עצבית ממודרת, כגון מחקה את האדריכלות וביולוגיה בקליפת המוח. צמיחה של מופרד neurites מגופי תא עצביים כבר הוכיחה בעבר בתרבויות 2D באמצעות microfabrication 16,17 מאפשר המחקר של מעקב מערכת האקסון, זרימת סידן, ארכיטקטורת רשת ופעילויות. רעיון זה נתן לנו השראה לפיתוח רקמה עצבית מקוטבת 3D שבו גופי תא ושטחי axonal נמצאים בתאים שונים מחקה את הארכיטקטורה שכבתית של המוח 18 . הגישה שלנו מבוססת על השימוש בעיצוב פיגום משי ייחודי אשר מאכלס בצפיפות גבוהה של תאים בנפח מוגבל ומאפשר תולדה של רשת axonal הצפופה לג'ל קולגן. כאן אנו מדגימים את הליך הרכבה המלא של רקמות כמו מוח כוללים ייצור הפיגום והתרבות עצבית.

פרוטוקול

פרוטוקול בידוד רקמת המוח אושר על ידי ועדת בעלי החיים המוסדית אוניברסיטת טאפטס הטיפול ושימוש ועומד במכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת השימוש B2011-45).

1. משי פיגום הכנה

  1. הכנת פתרון משי מפקעות טוואי משי כפי שתוארה לעיל 19,20.
    1. חותך כל גולם לתוך 8 חתיכות שווים באמצעות מספריים. השתמש בכ -11 פקעות ל5 גרם של פקעות מקוטעות. (15 דקות)
    2. הכן 2 ליטר של 0.02 M Na 2 CO 3 פתרון ולהביא אותו לרתיחה תוך שימוש בצלחת חמה. (15 דקות)
    3. שוקל 5 גרם של פקעות מקוטעות ולהרתיח אותם בNa 2 CO 3 פתרון למשך 30 דקות. מערבבים את המשי הרותח כל כמה דקות עם מרית. צעד זה, הנקרא גם דה-קאמינג, מטהר fibroin משי מחלבונים, sericins הידרופילי. (30 דקות)
    4. סחטו את fibroin ביד ולשטוף אותו במים מזוקקים לפחות שלוש פעמים כדי לשטוף את כל sericin וכימיקלים שנותר. (5 דקות)
    5. מניחים את fibroin הרטוב בצלחת פטרי ולייבש את תמצית fibroin בO זרימת מכסה המנוע / N.
    6. למחרת לשקול את מסת fibroin היבשה ומניח fibroin בכוס זכוכית. (15 דקות)
    7. על מנת לפזר את fibroin בפתרון 9.3 M LiBr, לחשב את הנפח הנדרש (במ"ל) של LiBr על ידי הכפלת המסה של fibroin היבש על ידי 4. יוצקים לאט פתרון LiBr על fibroin המשי ולטבול את כל סיבי fibroin באמצעות מרית. מכסה את הכוס כדי למנוע אידוי ומניח אותו על 60 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות כדי לאפשר לסיבים לפזר. (15 דקות)
    8. שימוש במזרק, לאסוף את פתרון fibroin מהכוס ולטעון אותו לתוך קלטות הדיאליזה MWCO 3500. לבצע דיאליזה נגד מים מזוקקים למשך 48 שעות. להחליף את המים כל כמה שעות.
    9. שימוש במזרק, לאסוף את פתרון fibroin מהקלטות לצינורות 50 מיליליטר ו צנטריפוגות חרוטי פעמיים ב9,000 סל"ד (~ 12,700 XG) על 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. יוצקים את supernatant לתוך צינור טרי אחרי כל צעד צנטריפוגה וזורקים את הכדור. (40 דקות)
    10. למדוד את הריכוז של fibroin ידי אומדן המשקל היבש. יוצקים 1 מיליליטר של תמיסת משי לתוך סירה לשקול. ייבש את המדגם בתנור על 60 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. לשקול את fibroin המשי היבש ולחשב את הריכוז של פתרון fibroin משי על ידי הכפלת המשקל שהושג על ידי 100. הריכוז הצפוי של פתרון משי הוא 6-9% (w / v).
    11. התאם את ריכוז המשי עד 6% (w / v) על ידי דילולו במים מזוקקים.
      נקודת עצירה: fibroin המשי הנוזלי יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך עד חודש בכלי סגור.
  2. הכנת פיגומים נקבוביים מפתרון משי.
    1. מסננת NaCl גרגירים להפריד את הגרגרים בגודל 500-600 מיקרומטר, אשר ישמש בשלבים מאוחר יותר. מחק את גרגירשל הגודל להלן 500 מיקרומטר ומעל 600 מיקרומטר. (15 דקות)
    2. יוצקים 30 מיליליטר של 6% פתרון משי לתוך תבנית polytetrafluoroethylene (PTFE) (איור 1). בעדינות לפזר 60 גרם של NaCl הסתנן על המשי. הקש המכל להשיג שכבה אחידה של מלח. דגירה 48 שעות ב RT לפלמר המשי.
    3. מניחים את תבנית PTFE המכיל פיגום בתנור על 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לסיים את פילמור ולהתאדות כל נוזל שנותר.
    4. הנח את התוכן של עובש PTFE בכוס המכילה 2 ליטר של מים מזוקקים למשך 48 שעות לסנן את המלח. להחליף את המים 2-3 פעמים ביום. הסר את פיגומי ספוג מהתבניות כאשר מלח דלף החוצה לחלוטין עצירת נקודה:. ניתן לאחסן ספוגים שקועים במים ב 4 מעלות צלזיוס במכל סגור כדי למנוע את הפיגומים מהתייבשות.
    5. כאשר מוכן, לחתוך את הפיגומים עם ביופסית קוטר 5 מ"מ. לחתוך מראש הפיגומים להגיע לכ 2 מ"מ הגובה. פוNCH ​​את מרכז הפיגום עם אגרוף 2 מ"מ ביופסית קוטר (איור 2 א). (1 שעה)
    6. החיטוי הפיגומים שקועים במים לעקרם (מחזור רטוב, 121 ° C, 20 דקות) עצירת נקודה:. ניתן לאחסן ספוגים שקועים במים ב 4 מעלות צלזיוס במכל סגור כדי למנוע את הפיגומים מהתייבשות.
    7. לפני זריעת התאים המתוכננת, לטבול את הפיגומים ב0.1 מ"ג פתרון סטרילי / פולי-D ליזין מיליליטר (PDL). דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס.
    8. שטוף את הפיגומים 3x עם מי מלח פוספט (PBS) כדי להסיר PDL-מחויב שאינו. (30 דקות)

2. בידוד של עכברוש נוירונים קליפתיים

  1. לנתח הקורטקס מיום עוברי 18 חולדות (E18) Sprague-Dawley כפי שתואר בעבר על ידי פצ'יפיצ'י ו -27 Peruzzi לאחר פרוטוקול בעלי חיים אושר מתקבל. (2 שעות)
  2. דגירה 10 הקורטקס ב 5 מיליליטר של טריפסין 0.25% עם DNase 0.3% אני (מלבלב שור) במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. להשבית טריפסין ידי הוספת נפח שווה 1 מ"ג / מיליליטר של חלבון סויה.
  4. Triturate הקורטקס באמצעות 10 מיליליטר פיפטה פסטר על ידי pipetting למעלה ולמטה 20 פעמים עד השעיה תא בודדה נוצרה. להיות עדין ולמנוע היווצרות בועת אוויר. (10 דקות)
  5. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 127 XG במשך 5 דקות.
  6. (בינוני Neurobasal, תוסף B27 1x, 1x Glutamax, 1% פניצילין / סטרפטומיצין). מחדש להשעות את התא גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום התרבות ספירת התאים. ריכוז התא הצפוי הוא כ 2x10 7 מיליליטר /. (20 דקות)

3. לבנות הרכבה ותרבות

  1. זריעת פיגום עם תאים.
    1. הזז את הפיגומים סטריליים וכל כלים הנדרשים בתוך ברדס תרבית תאים. מלקחיים סטריליות שימוש למקם את הפיגומים בצלחת תרבית תאי 96-גם הקצאת פיגום אחד בכל טוב. (10 דקות)
    2. לטבול את הפיגומים במדיום תרבית תאים לאזן אותם לפני תא זרעING. דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. (10 דקות)
    3. לשאוב את עודף הבינוני מהפיגומים.
    4. החל מהשעית התא / פיגום 100 μl. (10 דקות)
    5. דגירה התאים ב 37 מעלות CO / N כדי לאפשר מצורף תא לפיגום.
    6. למחרת בבוקר לשאוב התאים מצורפים שאינו ולהחיל 200 μl / טוב של מדיום תרבות טרי. (10 דקות)
  2. פיגום הטבעה עם מטריצת קולגן. (2 שעות)
    1. הנח 10x PBS, מים, 1 N NaOH ועכברוש זנב אני קולגן על קרח. הכן פתרון עבודה של קולגן לפי הוראות היצרן. לשמור על קרח עד בונה-זרע התא מוכנה (עד שעה 1).
    2. הסר את מבני משי תא-זרע מהחממה ולשאוב את עודף בינוני.
    3. מלקחיים סטריליות באמצעות העברת הפיגומים לבארות הריקות על הצלחת היטב ולטבול כל פיגום בשל 3 מ"ג / מיליליטר פתרון קולגן 100 μl. מניחים את צלחת תרבית רקמה בחזרהבחממה במשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור של קולגן.
    4. החל מתרבית תאים בינונית מחוממת מראש 100 μl / טוב. תרבות בונה במשך שבוע אחד לשנות את המדיום בכל יום על ידי החלפה רק חצי הנפח של המדיום.

4. מיקרוסקופית ניתוח

  1. צביעה חי / מת (1 שעה)
    1. הכן פתרון מניות של יודיד propidium (PI) 1 מ"ג / מיליליטר (1.5 מ"מ) במים מזוקקים.
    2. הכן פתרון מניות של diacetate והעמסת (FDA) 2 מ"ג / מיליליטר באצטון.
    3. הכן פתרון עובד המכיל 10 מיקרומטר PI ו0.15 מיקרומטר FDA מדולל PBS. טרום חם הפתרון ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    4. לשטוף את התאים עם PBS מראש חימם להסיר את esterases הסרום. לשאוב את PBS.
    5. ליישם את הפתרון עובד מראש חימם על התאים למשך 2 דקות ולשטוף אותו עם PBS.
    6. השתמשו במיקרוסקופ epifluorescent לתמונת התאים (לשעבר PI λ = 490 ננומטר, λ = 570 ננומטר; ה- FDA לשעבר λ = 490 nמ ', אותם λ = 514 ננומטר). הכתם נשאר יציב לאורך 40 דקות. צביעה ממושכת עלולה לגרום להכתמה נוקבים כתוצאה מספיגת PI על ידי התאים ושיתוף הלוקליזציה של PI / FDA בתאים.
  2. Immunostaining
    1. בנקודת הזמן הרצויה של התרבות לתקן את התאים עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 30 דקות ב RT. בשל הרעילות של PFA רותח צעד התיקון צריכה להתבצע במנדף הכימי.
    2. לשטוף פיגומים עם 3x PBS נקודת עצירה:. ניתן לאחסן מבנים קבועים PFA PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לפני שתמשיכו עם צעדים נוספים.
    3. דגירה הפיגומים ב0.2% טריטון, 0.25% אלבומין בסרום שור (BSA) בPBS המכילים O נוגדן ראשוני / N ב 4 ° C.
    4. למחרת לבטל את הפתרון מכתים ולשטוף את הפיגומים 3 x 30 דקות עם PBS להסיר הנוגדן מאוגד העיקרי.
    5. דגירה הדגימות עם נוגדנים משני בדילול מלא 0.2% טריטון, BSA 0.25% ב PBS עבור 2שעות ב RT.
    6. הסר את הפתרון מכתים ולשטוף את הפיגומים 3 x 30 דקות עם PBS להסיר נוגדנים משני מאוגד.
    7. תמונת הפיגומים באמצעות מיקרוסקופ confocal עם מטרת 20X על ידי לקיחת 100 מיקרומטר Z-סעיפים של המדגם עם שלב 1 מיקרומטר. כדי להמחיש את neurites דקה רזולוציית התמונה צריכה להיות של 1,024 x 1,024 פיקסלים מינימום.
  3. RNA, DNA ובידוד חלבון
    הערה: RNA, DNA ובידוד חלבון מתבצע באמצעות ערכת מיני AllPrep DNA / RNA / חלבון מסחרי בהתאם להוראות היצרן.
    1. מלקחיים סטריליות באמצעות העברת הפיגומים מצלחת התרבות לצינור סטרילי 2 מיליליטר. הנח פיגום אחד לכל צינור.
    2. הוסף 200 μl של חיץ RLT על צינור אחד.
    3. לשבש את המבנה על ידי פיצולו עם microscissors סטרילי.
    4. לhomogenize הרקמה שיבש, להעביר את התוכן של הצינור לעמודת הספין. ספין 2 דקות במהירות מלאה בmicrocentrifuge.Lysate הוא הומוגני כשהוא עובר דרך טור הספין.
    5. לאסוף את הזרימה דרך ולהשתמש בו באופן מיידי כדי לבודד RNA, DNA וחלבונים הבאים הפרוטוקול של היצרן.
    6. לכמת את התשואה של חומצות גרעין בכל שיטה תואמת אחרת (לדוגמא, NanoDrop).
    7. לכמת את תשואת החלבון באמצעות assay חלבון BCA בהתאם להוראות היצרן. למדוד את התוצאה של assay באמצעות microplate קורא באורך גל 562 nm.
      הערה: התשואה הצפויה של חומצות וחלבון למבנה ביחס לצפיפות תאי גרעין מוצגת באיור 4.

תוצאות

חתוכי ספוגים משי מוצקים לצורת הסופגנייה מייצג רעיון ייחודי ופשוט להשגת ארכיטקטורה ממודרת דומות רקמה (איור 2 א) העצביים. המבנה הנקבובי ביותר של הפיגום עם הגודל הנקבובית של כ -500 מיקרומטר תוצאות בשטח גבוה במיוחד ומאפשרות זריעה וצמיחה של צפיפות גבוהות תאים בתוך נפח קטן (2x10 7 / מיליליטר) (איור 2). בנוסף, הנקבוביות הגבוהה של הפיגום מאפשר דיפוזיה בלתי מוגבלת של חומרים מזינים ופסולת וכתוצאה מכך כדאיות מעולה של תרביות תאים צפופות על מסגרות זמן ממושכות. על זריעת תאי העצב במהירות אחידה ולצרף אל פני השטח של נקבוביות הפיגום.

לאחר מצורף תא שלם ותאי equilibrated על מצע המשי, פיגום ספוג מלא במטריצת קולגן הרכה על מנת לספק סביבת 3D להיווצרות רשת axonal (איור 3 ). בהעדר מטריצת קולגן המידור של אקסונים וגופי תא אינו אפשרי כתאי עצב לגדול הרחבות רק על פני השטח של הנקבוביות וכתוצאה מכך מעורבות רשתות כפי שנמצא עם משטחי 2D (איור 3). לעומת זאת, ג'ל קולגן מספק meshwork התומך בתוצאת axonal נרחבת ב3D, בעוד גופי תא עצביים נשארים צמודים לפיגום המשי (איור 3 ג). דפוס צמיחה זה מוביל למידור של גופי תא ורשתות axonal טהורים (איור 3D), שדומה לחומר האפור ולבן של קליפת המוח במוח.

מלבד מיקרוסקופיה, ניתן להעריך את המבנים עם מגוון רחב של שיטות אחרות 18, בהתאם לשאלה מאחורי הניסוי. לדוגמא, הבידוד של DNA, RNA וחלבון מהבונה יכול להיות בקלות בוצע באמצעות ערכות מסחריות (איור 4). התשואה של חומצות גרעין והחלבונים PEמבנה r תלוי במספר תאי זרע בתחילה על פיגומי משי. יותר תאי זרע גבוה יותר התשואה של ה- DNA, RNA וחלבון.

figure-results-1
עובש איור 1. PTFE משמש להכנת פיגום ספוגי משי הממדים:.. 10 סנטימטרים קוטר, 2 סנטימטרים גובה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2. מודל 3D רקמות כמו מוח. () פיגום ספוגי משי נקבובי. הכתמה (ב) בשידור חי / המתה של תאי עצב ביום 1 על זריעה על פיגום משי לפני קולגן הטבעה (תאים ירוקים-חיים, תאים אדומים-מתים). פנלים בצד ימין מראים magnification של האזור שנתפס במסגרות אדומות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3. עצבי תולדה ממודרת במודל הרקמות כמו המוח-3D () תאי פיגום:. תא גוף אדום-תא, תא הכחול-axonal. דפוס צמיחה עצבי ביום 1 על זריעה לפני הטבעת קולגן (ב '). (ג). תולדה עצבית ביום 7 על זריעה בתא גוף תא. תולדה עצבית ביום 7 על זריעה בתא axonal (ד '). ירוק -. ΒIIITubulin אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זהדמות.

figure-results-4
תשואת איור 4. צפוי של RNA () ו- DNA, וחלבון (ב) למבנה ביחס לכמות תאי זרע לפיגום (± סטיית תקן, n = 5). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

דיון

כאן תיארנו את ההנחיות להרכבת מודל תלת-ממדי של רקמות דמויות מוח ממודרות. המודל מאופיין בתרבית מקוטבת צפופה של נוירונים וכתוצאה מכך התפתחות של שני תאים שונים מבחינה מורפולוגית: האחד מכיל גופי תאים צפופים, והשני מכיל רשתות אקסונליות טהורות. בסך הכל, ארכיטקטורת הפיגומים ודפוס הצמיחה מחקים רקמת קליפת המוח כולל שש השכבות הלמינריות ודרכי החומר הלבן21.

מודל הרקמות המבוסס על חלבון משי בצורת סופגנייה מאפשר שינויים וכוונון של תכונות מכניות, צורות מבניות מגוונות, חומרי מילוי הידרוג'ל ורכיבים תאיים. לפיכך, מודל רקמה זה מקים פלטפורמה בסיסית למגוון רחב של מחקרים. משי הוא מועמד מועדף לפלטפורמות ביו-חומרים בשל התאימות הביולוגית שלו, עיבוד מבוסס מים ותכונות מכניות ופירוק חזקות22. מטריצת המשי משמשת גם כעוגן יציב להפחתת התכווצות ג'ל הקולגן לאורך זמן בתרבית. המאפיינים כגון ריכוז המשי והנקבוביות של הפיגום המשמש במודל זה הותאמו בעבר כדי להשיג צמיחת תאים אופטימלית ותכונות מכניות וכתוצאה מכך גמישות רקמות דמויות מוח18,23,24. אנו מציעים לשמור על פרמטרים אלה קבועים כדי להבטיח את התוצאה המוצלחת ואת יכולת השחזור של הניסויים.

היווצרות הרשת העצבית התלת-ממדית הושגה על ידי שילוב של שני סוגים של ביו-חומרים בעלי תכונות מכניות שונות: פיגום קשיח המספק עיגון עצבי ומטריצת ג'ל רכה יותר המאפשרת חדירת אקסונים וקישוריות בתלת מימד. העדפות חומר סלקטיביות של פיגום המשי וההידרוג'ל הרך מספקות את העיקרון הבסיסי למידור הנוירונים מהחיבורים האקסונליים. בשל האופי האינרטי של פיגום המשי, נדרשת פונקציונליזציה עם פולי-D-ליזין להתקשרות עצבית. עם זאת, ניתן ליישם גורמים אחרים המקדמים הידבקות תאים כגון RGD25 או פיברונקטין26. כדי להשיג את היווצרות הרשת התלת מימדית, יש למלא את פיגום המשי בהידרוג'ל בזמן ברגע שתאי העצב מחוברים לפיגום. כמו כן, ניתן להחליף את מילוי מטריצת הקולגן בהידרוג'לים אחרים, ובכך לאפשר לחקר ההשפעה של סביבות חוץ-תאיות תלת מימדיות על היווצרות רשת אקסונלית לשמש פלטפורמה להערכת הידרוג'לים חדשים מבחינת תאימות עצבית. בנוסף, מלבד נוירונים בקליפת המוח של חולדות ניתן להשתמש במקורות עצביים אחרים כגון נוירונים בהיפוקמפוס או נוירונים שמקורם בתאים פלוריפוטנטיים מושרים (iPSc). יתר על כן, ניתן להשתמש במודל הרקמות כדי לחקור אינטראקציות הטרו-תאיות על ידי הכללת תאי גליה יחד עם נוירונים וכדי לבנות רקמה מורכבת יותר דמוית מוח.

כפי שהוצג קודם לכן, ניתן להשתמש במודל שלנו כדי להעריך פונקציונליות עצבית במיקרו-סביבה תלת מימדית עם מגוון בדיקות כגון כדאיות תאים, ביטוי גנים, LC-MS/MS ואלקטרופיזיולוגיה, ובכך להדגים את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודל18. שיטות אחרות, המשמשות לעתים קרובות להערכת מבנים מהונדסי רקמות תלת מימדיים, כגון צביעה חיסונית ומיקרוסקופיה8,9,11 יכולות לשמש גם להערכת התפלגות התאים והיקף היווצרות הרשת האקסונלית. עם זאת, יש לציין, כי בשל הצפיפות הגבוהה של מטריצת הקולגן, חדירת הנוגדנים ועומק ההדמיה מוגבלים לכמה מאות מיקרומטרים. יתר על כן, יחס האות לרעש עשוי להיות מושפע מפלואורסצנטיות רקע לא ספציפית. ניתן להתגבר על כך על ידי שימוש בעקבות תאים ליפופיליים וחלבונים פלואורסצנטיים המתבטאים גנטית המפחיתים את הצורך בצביעה חיסונית11. לחלופין, ניתן לבצע את ההדמיה במיקרוסקופיה של 2 פוטונים במקום בטכניקה רגילה של פוטון אחד, מה שעשוי להפחית את אובדן האות, פוטו-הלבנה, וניתן להרחיב אותו לעומק של כמה מאות מיקרומטרים.

לסיכום, הרקמה דמוית המוח המבוססת על משי וקולגן מציעה פלטפורמה חזקה לחקר רשתות עצביות בתלת מימד ומהווה נקודת התחלה לפיתוח מודלים מתקדמים יותר של הפרעות נוירולוגיות בעתיד. ללא תלות באופן ההערכה, הפשטות היחסית של מודל רקמות זה תומכת בתועלתו, בהצלחתו וביכולת השחזור שלו.

גילויים

הפרסום של מאמר וידאו זה ממומן על ידי קורנינג.

תודות

אנו מודים למעבדה של ד"ר סטיבן מוס על אספקת רקמות מוח עובריות של חולדות. M.D.T. עיצב את הפרוטוקול המקורי. עבודה זו מומנה על ידי מענק מרכז המשאבים להנדסת רקמות P41 של המכונים הלאומיים לבריאות P41 EB002520. K.C. נתמך במלגת פוסט-דוקטורט מקרן המחקר הגרמנית (DFG) (CH 1400/2-1).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Na2CO3Sigma-Aldrich223530
LiBrSigma-Aldrich213225
MWCO 3500 קלטות דיאליזה תרמו פישר66110
צלחת חימוםפישר סיינטיפיקאיזוטמפ
צנטריפוגה 5804 Rאפנדורף
מסננתפישר מדעימס' 270, מס' 35, מס' 30
תבניתתוצרת בית (<חזקה>איור 1) קוטר 10 ס"מ, גובה 2 ס"מ
NaClסיגמא-אולדריץ'71382
ביופסיה אגרוף 5  מ"ממכשיר דיוק עולמי501909
ביופסיה אגרוף 2  מ"ממכשיר דיוק עולמי501908
פולי-D-ליזיןסיגמא-אולדריץ'P6407-5MGריכוז סופי 10 & # 160; μ גרם/מ"ל, מומס במים
PBSSigma-AldrichD1283-500ML
טריפסיןסיגמא-אולדריץ'T4049-500ML
DNaseRoche10104159001ריכוז סופי 0.3%
חלבון סויהSigma-AldrichT6522-100MGריכוז סופי 1  מ"ג/מ"ל
מדיום נוירו-בזאליGibco21103049להתחמם עד 37  ° C לפני השימוש
תוסף B27 50xGibco17504-044
GlutamaxGibco35050-061
פניצילין סטרפטומיציןקורנינג30-002-CI
קולגן I, זנב עכברוש, 100  מ"גקורנינג354236ריכוז סופי 3  מ"ג/מ"ל
NaOHSigma-AldrichS2770קורוזיבי
פרופידיום יודידסיגמא-אולדריץ'P4170-10MG
פלואורסצאין דיאצטטרעיל סיגמא-אולדריץ'F7378-5G
אולימפוס MVX10אולימפוס
פרפורמלדהידסיגמא-אולדריץ'P6148רעיל, ריכוז סופי 4%
בקר סרום אלבומיןSigma-AldrichA7906-10G
אנטי-ובטא; IIIנוגדן טובולין סיגמא-אולדריץ'T2200ארנב 1:500
אנטי ארנב Alexa-546בדיקות מולקולריותA11010עז עז 1:250
סרום עזיםסיגמא-אולדריץ'G9023-5ML
Leica SP2 מיקרוסקופ קונפוקליLeicaאובייקטיבי 20X
QIA מגרסהQiagen79654
AllPrep DNA / RNA / חלבון מיני ערכתQiagen80004
אלכוהול אתילי,סיגמא-אולדריץ'E7023 
2-MercaptoethanolSigma-Aldrich63689
NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis ספקטרופוטומטרThermo Scientific
BCA בדיקת חלבוןThermo Scientific23225
קורא צלחות Spectramax M2מכשיריםספיגה 562 ננומטר
מספריים מיקרו, כלכלה, TedPella 1346 מסוג Vannas
PTFE טהור מולקולריים

מקורות

  1. Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. Neurological Disorders. , World Health Organization. Geneva. (2005).
  2. Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).
  3. Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).
  4. Wesseling, H., et al. A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).
  5. Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures. Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).
  6. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  7. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  8. Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).
  9. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  10. Hogberg, H. T., et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S4(2013).
  11. Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly. Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).
  12. Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel. Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).
  13. Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells. Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).
  14. Gurkan, U. A., et al. et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures. Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).
  15. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).
  16. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature. 2 (8), 599-605 (2005).
  17. Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity. J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).
  18. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).
  19. Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).
  20. Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  21. Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts. Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).
  22. Vepari, C., Kaplan, D. L. Silk as a biomaterial. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).
  23. Yao, D., et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).
  24. Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).
  25. Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).
  26. Hopkins, A. M., et al. Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering. Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).
  27. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol. Vis. Exp. (63), e3965(2012).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דגם של רקמות עצביות מקוטב מבוסס משי-קולגן מהונדס 3D
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.