הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

11.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52976

⸱

13 בינואר 2016

 ,  ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Biology, Spanish National Research Council (CSIC), Spanish National Biotechnology Centre (CNB-CSIC), 2Hospital de Santa Cristina, Healthcare Research Institute Princesa Hospital (IIS-Princesa)

במאמר זה

סיכום

הנה פרוטוקול מוצג למדוד לכידת חיידקים על ידי תאי CD4 + T אשר מתרחש במהלך מצגת אנטיגן באמצעות transinfection מהתאים נגועים מראש דנדריטים (DC). אנו מראים כיצד לבצע את הצעדים הדרושים: בידוד של תאים ראשוניים, של היווצרות זיהום המצומד תא DC, DC / T, ומדידה של transfection תא T חיידקים.

תקציר

לאחרונה, הראנו, בניגוד למה שמתואר, שתאי CD4+ T, הפרדיגמה של תאי חיסון נרכשים, לוכדים חיידקים מתאים דנדריטיים נגועים (DCs) בתהליך הנקרא טרנס-זיהום. כאן, אנו מתארים את הניתוח של תהליך הזיהום, המתרחש במהלך הצגת האנטיגן. תהליך זה נחשף על ידי שימוש בתאי CD4+ T מעכברי OTII טרנסגניים, הנושאים קולטן תאי T (TCR) ספציפי לפפטיד של אובולאבומין (OVAp), ולכן יכול ליצור קומפלקסים חיסוניים יציבים עם תאים דנדריטיים נגועים טעונים ב-OVAp הספציפי הזה. ניתן לנטר את הדינמיקה של חיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) במהלך העברת תאי DC-T על ידי הדמיית תאים חיים וכימות זיהום חיידקי יכול להתבצע על ידי ציטומטריית זרימה. בנוסף, ניתן לכמת זיהום טרנס-הדבקה בשיטה רגישה יותר המבוססת על שימוש בגנטמיצין, אנטיביוטיקה אמינוגליקוזיד לא חדירה שהורגת חיידקים חוץ-תאיים אך לא תוך-תאיים. שיטה קלאסית זו שימשה בעבר במיקרוביולוגיה כדי לחקור את יעילותם של זיהומים חיידקיים. אנו מסבירים בזאת את הפרוטוקול של התהליך השלם, מבידוד התאים הראשוניים ועד לכימות זיהום טרנס.

מבוא

כאשר הפתוגן מדביק המארח שלה, בדרך כלל יש הפעלה של המערכת החיסונית המולדת ובעלי כושר הסתגלות, הכרחי לקבלת אישור בקטריאלי. חסינות מולדת היא קו הגנה הראשון המונע הזיהומים ביותר. חסינות מולדת להבחין באלמנטים מדויקים דרך שהשתמרו בקרב קבוצות רחבות של מיקרואורגניזמים (הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, PAMPS) 1. המנגנונים של מערכת חיסון מולדת כוללים מחסומים פיזיים כגון עור, מחסומי כימיקלים (פפטידים מיקרוביאלית, יזוזים) וכדוריות דם לבנות המולדים, הכוללים את phagocytes (מקרופאגים, נויטרופילים, ותאים דנדריטים), תאי פיטום, אאוזינופילים, בזופילים, ותאי הרג טבעיים 2. תאים אלה לזהות ולחסל פתוגנים, בין אם על ידי תוקף אותם באמצעות מגע או באמצעות phagocytosis, הכולל מחולל האופפת והרג. מערכת זו אינה מאפשרת הגנה לכל החיים, בניגוד לחסינות אדפטיבית, המעניק זיכרון חיסוני כנגד עמ 'athogens. המערכת החיסונית אדפטיבית היא קו הגנה השני, והוא מסוגל לזהות ולהגיב לאנטיגנים ספציפיים של חיידקים מרובים וחומרים שאינם חיידקים 3. המרכיבים העיקריים של המערכת החיסונית אדפטיבית הם לימפוציטים, הכוללים תאי B ו- T. תאי B מעורבים בתגובת הלחות, מפריש נוגדנים נגד פתוגנים או חלבונים אקסוגניים. עם זאת, תאי T מייצגים את חסינות התא בתיווך, ויסות התגובה החיסונית עם הפרשת ציטוקינים או תאים נגועים בפתוגן הרג 4.

תאי הצגת אנטיגן (נגמ"שים) כוללים תאים דנדריטים או מקרופאגים, מרכיבים של מערכת החיסון המולדת, יכול לזהות פתוגנים phagocytose ורכיבי חיידקי תהליך לאנטיגנים, המוצגים על פני התא על ידי histocompatibility סרן מורכב (MHC) 5-7. לאחר נגמ"שים שphagocytized פתוגנים, הם בדרך כלל להעביר לבלוטות הלימפה ניקוז, שבו הם מתקשרים עם Tתאים. לימפוציטים מסוג T יכול לזהות מתחמי פפטיד-MHC ספציפיים על ידי קולטני תאי T שלהם. סינפסה החיסונית (IS) מתרחשת בממשק שבין APC-עמוס אנטיגן והלימפוציטים במהלך מצגת אנטיגן 8,9. חיידקים מסוימים יכולים לשרוד phagocytosis ולהפיץ באופן שיטתי בתוך נגמ"שים. בתצוגה זו, נגמ"שים נגועים לשמש כמאגרי חיידקים או "סוסים טרויאניים" המאפשרים התפשטות חיידקי 10. קשר האינטימי בין נגמ"שים וימפוציטים שיתקיימו במהלך ההיווצרות גם לתפקד כפלטפורמה להחלפה של חלק מקרומים, חומר גנטי וexosomes ויכול להיות שנחטף לכמה וירוסים להדביק תאי T; תהליך זה נקרא transinfection 11-13.

כמה חיידקים פתוגניים (חיידקי ליסטריה, סלמונלה enterica וflexneri Shigella) יכולים לפלוש לימפוציטים מסוג T in vivo ולשנות את ההתנהגות שלהם 14-16. יש לנותאר לאחרונה כי לימפוציטים מסוג T הוא גם מסוגל לתפוס חיידקים על ידי transinfection מהתאים דנדריטים נגועים בעבר (DCS) במהלך הצגת אנטיגן 16. תא T ללכוד חיידקים על ידי transinfection מאוד יעיל יותר (1,000-4,000x) מאשר זיהומים ישירים. הפתוגן T ללכוד תאים וחיידקים שאינם פתוגן המציין מ transinfection הוא תהליך מונע על ידי תאי T. באופן מפתיע, transinfected T (ציצי) תאים נהרגו במהירות את החיידקים שנתפסו ועשו זאת בצורה יעילה יותר מאשר phagocytes המקצועי 16. תוצאות אלו, שתשבורנה דוגמה לאימונולוגיה, מראות כי התאים של חסינות אדפטיבית יכולים לבצע פעולות שהיו כביכול בלעדיים של החסינות המולדת. בנוסף, הראינו כי תאי ציצי מפרישים כמויות גדולות של ציטוקינים פרו-דלקתיים ולהגן מפני זיהומים חיידקיים בvivo.

כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים השונים המשמשים ללימוד תהליך transinfection חיידקים במודל עכבר. מודל זה מבוסס על השימוש בתאים מסוג CD4 + T מעכברים מהונדסים OTII, אשר נושאים ספציפי TCR לפפטיד 323-339 של OVA (OVAp) בהקשר של I-17 Ab כי אינטראקציה ספציפית עם עצם חיידקים נגוע מארו DCs נגזר (BMDCs) 18,19 עמוס OVAp, יוצר סינפסות חיסוני יציבה.

transinfection תא T ניתן דמיין ומעקב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בנוסף, cytometry הזרימה יכול לשמש לזיהוי תאים נגועים על ידי ניצול של הקרינה הנפלטת ידי חיידקים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 16,20. יתר על כן, transinfection תא T ניתן לכמת על ידי גישה רגישה יותר, assay הישרדות גנטמיצין המאפשר מדידה של מספר גדול של אירועים. גנטמיצין הוא אנטיביוטיקה שלא יכול לחדור תאים האיקריוטים. לכן, שימוש באנטיביוטיקה זו מאפשרת בידול של חיידקים תאיים ששרד את fr בנוסף לאנטיביוטיקהאלה תאיים אום שנהרגו 21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: נהלי ניסוי אושרו על ידי הוועדה לחקר אתיקה של Universidad de האוטונומית מדריד ונערכו בפיקוחו של Universidad de האוטונומי מדריד ראש רווחת בעלי החיים והבריאות בהתאם להנחיות ספרדיות ואירופאיות. עכברים גדלו בדיור ספציפי הפתוגן חופשי (SPF) והם מורדמים על ידי צוות מיומן ומוסמך באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) שיטת שאיפה.

1. עכבר מח עצם נגזר DCs בידול וזיהום

הערה: איור 1 מסכם הצעד הראשון הזה. צריכה להתבצע כל הנהלים בברדס מנקודה זו ואילך, רק באמצעות תקשורת, מכשירים, טיפים פיפטה סטרילית ומנות תרבות.

  1. בידול DCs נגזר מח עצם עכבר
    1. לנתח tibias ועצמות ירך מאחד C57 / BL6 עכבר 22 ולהעביר לתוך צלחת פלסטיק עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI.
    2. חותך כל epiphysis את, עם מספריים סטרילי ולחשוף מח עצם, שבו יש צבע אדום בהיר אופייני.
    3. להשרות את החלק הפנימי של העצם עם 10 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS) המכיל 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) וחומצת 5 מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (חיץ / BSA / EDTA PBS) באמצעות מזרק סטרילי על פטרי סטרילי צַלַחַת.
    4. אסוף את ההשעיה תא צנטריפוגות בצינור ב 600 XG בצנטריפוגה בקירור (4 מעלות צלזיוס).
    5. Resuspend תאי 1 מיליליטר של אמוניום-כלוריד-אשלגן חיץ (ACK) lysing (0.15 מ '4 Cl NH, 10 מ"מ KHCO 3 ו 0.1 mM EDTA) דגירה במשך 30 שניות בRT כדי לחסל תאי דם אדומים.
    6. הוסף 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) ולסנן דרך מסננת תא (70 מיקרומטר) כדי להסיר שברי עצמות וגושי תא לפני צנטריפוגה באותה המהירות (600 XG) כי גושים בוטלו על ידי סינון.
    7. ספירת התאיםד להתאים ל5 x 10 5 תאים / מיליליטר עם RPMI 10% FBS (B-mercaptoethanol 50 מיקרומטר המכיל, פירובט נתרן 1 מ"מ) ולהוסיף 20 ng / ml גורם רקומביננטי עכברי granulocyte-מקרופאג שולט בקולוניה- גירוי (RM-GM-CSF) כריכוז סופי.
    8. הוסף השעיה זו לאיכות סטרילי, מיקרוביולוגים, 15 סנטימטר צלחת פטרי, ותרבות בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
    9. כל שלושה ימים, ספין למטה שני תאים שאינם חסיד ותאים מנותקים עם 5 מ"מ EDTA ב PBS וגלול בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר של צפיפות תאים, עם מדיום טרי המכיל 20 ng / ml RM-GM-CSF.
  2. התבגרות של טעינת DCs וAntigen
    1. ביום 9, resuspend התאים בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר של צפיפות במדיום המכיל 20 ng / ml RM-GM-CSF. ואז להוסיף 20 ng / ml של lipopolysaccharide (LPS) כדי לאפשר ביטוי גבוה MHC-II בתאי דגירה בצלחת שטופלה תרבות הלא-רקמת סטרילי 15 סנטימטר פטרי במשך 24 שעות.
    2. לאחר אחדיום של LPS-גירוי, להכתים כמה תאי DC עם נוגדנים נגד CD11c עכבר, MHCII וGr-1 כדי לבדוק בידול DCs על ידי cytometry זרימה. דוגמא לניתוח cytometry הזרימה של DCs מוצגת באיור 3 א ו3B.
      1. דגירה DCS (5 x 10 5 תאים / מדגם) עם נוגדנים חד שבטיים נגד העכבר-CD16 / CD32 על 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר של ריכוז סופי ב -50 μl PBS / BSA EDTA חיץ / לדגימה. לאחר מכן, להוסיף 50 μl של הנוגדנים נגד MHCII (IA / IE), CD11c וGr-1 מצומדות עם fluorochromes שונה ב1: 100, 1: 200 ו- 1: 500 ב- PBS / BSA / חיץ EDTA בהתאמה.
      2. לבסוף, לשטוף DCs עם PBS / BSA / חיץ EDTA ולנתח ידי cytometry זרימה על פי הפרוטוקול של היצרן.
        הערה: אם התאים מובחנים היטב, תאים מוכנים לטעינת אנטיגן.
    3. לשטוף DCs עם RPMI 10% FBS (ללא אנטיביוטיקה) דגירה אותם עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) בצינור פלסטיק 1 מיליליטר של RMPI 10% בינוניים FBS לכל 5 x 10 6 DCs עבור שעה 1 המינימום ב 37 מעלות צלזיוס. כביקורת שלילית, לעזוב DCs ללא דוגרים עם OVAp.
  3. זיהום של DCs
    1. להדביק DCs על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 חיידקים (10 חיידקים לDC) לשעה 1 בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
    2. לשטוף את תאי DC פי 3 ב- PBS ו1x בFBS 10% RMPI צנטריפוגות ב 450 XG כדי לשטוף את רוב החיידקים תאיים. לבסוף, תאים גלולים ב 10% בינוניים RMPI FBS (ללא אנטיביוטיקה) בשעת 20 x 10 6 תאים / מיליליטר.

2. בידוד של CD4 + T לימפוציטים מעכברים הטרנסגניים OTII

הערה: איור 1 מסכם שלב שני זה. יש להשתמש בבלוטות הלימפה במקום טחול לבודד תאי CD4 + T, כי חלקם של לימפוציטים מסוג CD4 + בבלוטה לימפהs (~ 50%) הוא גדול יותר מאשר בטחול (~ 25%) ולכן הטיהור תהיה יעילה יותר.

  1. הפוך השעיה תא בודד של בלוטות לימפה
    1. הסר מפשעתי, בבית השחי, זרוע, צוואר רחם וימפה mesenteric צמתים 23 מעכברים מהונדסים OTII ולהעביר לתוך צלחת פלסטיק עם 10 מיליליטר של 10% בינוניים FBS RPMI.
    2. בלוטות לימפה לטחון מתחת למכסת מנוע סטרילי באמצעות שתי שקופיות מיקרוסקופ חלבית. הנח בלוטות לימפה בצד חלבית של שקופית מיקרוסקופ אחד, ולשפשף עם צד חלבית של השקופית השנייה ועד איברים היו קרקע.
    3. לשטוף השעיה תא בודדת במאגר PBS / BSA / EDTA.
    4. סנן את התאים למרות מסננת תא (70 מיקרומטר) כדי להסיר רקמות חיבור ולשטוף עם PBS / BSA / חיץ EDTA.
    5. Resuspend תאי 1 מיליליטר של חיץ תמוגה ACK דגירה דקות 1 ב RT כדי לחסל תאי דם אדומים.
  2. בידוד של תאי CD4 + T
    1. לשטוף שוב כמו בשלב 2.1.3 וספירהתאי resuspend אותם ב 100 x 10 6 תאים / מיליליטר PBS / BSA / חיץ EDTA. להוסיף נוגדני biotinylated נגד CD8, IgM, B220, CD19, MHC class II (I-Ab), CD11b, CD11c וDX5 ב 1: 250 במשך 30 דקות על קרח לבחירה מאוחר יותר שלילית של תאי CD4 + T.
    2. לשטוף את התאים בPBS / BSA / חיץ EDTA דגירה התאים (100 x 10 6 תאים / מיליליטר) עם microbeads streptavidin בריכוז מומלץ בפרוטוקול של היצרן במשך 15 דקות על קרח.
    3. לשטוף את התאים בPBS / BSA / חיץ EDTA ולסנן אותם למרות שמסננת תא (30 מיקרומטר) לפני הבידוד של תאי CD4 +.
    4. בודד תאי CD4 + T על ידי סלקציה שלילית באמצעות מכונה הפרדת תא מגנטית על פי הפרוטוקול של היצרן.
    5. ספירת התאים ולהתאים עד 4 x 10 6 תאים / מיליליטר עם 10% בינוניים RPMI FBS (ללא אנטיביוטיקה).
    6. לתקן ולשמור על תאי קרח מבודד CD4 + T (3 x 10 5 תאים) כדי לבדוק את טוהר על ידי זרימהcytometer כמתואר 24. דוגמא לטיהור תאי CD4 + T מוצגת באיור 3 ג.

3. תא T Transinfection מדידה על ידי assay הגנת גנטמיצין

הערה: איור 2 מסכם שלב שלישי זה של הפרוטוקול.

  1. Transinfection תא T
    1. דגירה תאי CD4 + T מבודדים עם תאים נגועים DC (1: 1) (חיידקים חופשיים DCs נדבקו לשעת 1 ורחץ לחסל) למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות הסינפסה חיסונית בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
    2. הוסף 0.5 מיליליטר של תאים מבודדים CD4 + T (2 x 10 6 תאים) ושל 0.1 מיליליטר של DCs הנגוע (2 x 10 6 תאים) על צלחת תרבות 24 גם. כביקורת שלילית, להדביק ישירות 0.5 מיליליטר של תאי CD4 + T במשרד פנים של 10 חיידקים למשך 30 דקות.
    3. כולל בקרות נוספות הפרדת DCs נגוע מתאי T באמצעותמחסום transwell פוליקרבונט (עם 3 מיקרומטר של גודל נקבובית), מונע מגע פיזי DC-T. להוסיף 0.1 מיליליטר של DCs בתוך transwell ו 0.5 מיליליטר של תאי CD4 + T לתא התחתון של הקידוח (24 גם צלחת).
    4. לבסוף, להשלים עם מדיום RMPI עד שיש 0.6 מיליליטר בכל טוב לעשות כמויות שווה בכל הדגימות.
    5. לאחר 30 דקות של היווצרות הסינפסה חיסונית, להוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר של גנטמיצין ודגירה עבור שעה 1 לפני איסוף תאים בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
  2. Re-הבידוד של תאי CD4 + T
    1. איסוף תאים שאינם חסיד וresuspend אותם במאגר PBS / BSA / EDTA. רוב DCs נשאר צמוד לצלחת תרבות הפלסטיק. צינורות מערבולת בעדינות כדי להבטיח disaggregation תא. שמור 500 μl של supernatant תא בקרה כדי להראות שגנטמיצין עבד היטב.
    2. לבודד-מחדש תאי CD4 + T מדגימות המכילות DCs ותאי T יחד כמו בשלב 2.2, אם כי רוב DCs צריך מצורף על הצלחת. שמור את דגימות שליטה על קרח. קח בחשבון רק ניסויים עם זיהום פחות מ -2%. דוגמא לסוג CD4 + T טיהור תאים לאחר transinfection מוצגת באיור 3D.
  3. תאי T Lyse וזרעם על חיידקים צלחות בינוניים-אגר.
    1. לשטוף את תאי CD4 + T פעמיים עם PBS.
    2. ספירת תאי resuspend אותם ב 2 x 10 6 תאים / מיליליטר ב PBS.
    3. הוסף 500 μl של 0.1% Triton X-100 ב -500 μl של תאי T לlyse ב1 x 10 6 תאים / מיליליטר, משחרר את החיידקים מחוץ לתאי T תאיים.
    4. לעשות 3 דילולים עשרוניים סידוריים של תאי lysed וזרע 50 μl של כל דילול על צלחות אגר בינוניות חיידקים. לחלק צלחות ל -4 חלקים וזרע דילולים השונים של תאי lysed בכל חלק. תוצאות נציגים מוצגות באיור 4.
      1. כביקורת, גם צלחתsupernatant מאוחסן תא של conjugates על אגר, כדי להבטיח גנטמיצין שעבד היטב. גם צלחת DCs הנגוע כבקרה נוספת. במקרה זיהום DCs נמוך מתרחש (<2%), להפחית את יחידות המושבה להרכיב (CFUs) המתאימות לזיהום DC נמוך.

4. כימות Transinfection תא T על ידי cytometry הזרימה

הערה: איור 2 מסכם את הצעד הזה.

  1. Transinfection תא T
    1. להדביק BMDCs כמו בשלב 1.3, אבל להשתמש בחיידקי GFP להביע במקרה זה.
    2. תאי CD4 + T הכתם (מבודדים מבלוטות לימפה בשלב 2.2) עם aminocoumarin chloromethyl גשש תא (CMAC) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס פי הפרוטוקול של היצרן.
    3. לשטוף את תאי CD4 + T שכותרתו פעמיים עם FBS RMPI 10% (ללא אנטיביוטיקה).
    4. דגירה DCs הנגוע (לאחר דגירה 1 שעות עם חיידקים) עם CD4 + כותרתתאי T למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות הסינפסה חיסונית על 37 מעלות צלזיוס כולל את כל הבקרות והסבירו בשלב 3.1.1.
  2. צביעת תאי CD4 + T נגועים
    1. לאחר 30 דקות של היווצרות הסינפסה חיסונית DC-T, לאסוף תאים ולשטוף אותם בPBS / BSA / EDTA.
    2. לאחר שתי שטיפות עם PBS חיץ / BSA / EDTA, תאים מצטברים נפרדים בעדינות על ידי vortexing הצינורות.
    3. תקן את הדגימות ב0.2 מיליליטר / שפופרת של PBS המכיל 3% PFA במשך 15 דקות ב RT. לאחר מכן לשטוף אותם בPBS.
    4. דגירה עם נוגדן אנטי עכבר CD16 / CD32 חד שבטי (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ב -50 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 15 דקות על קרח כדי לחסום קולטני Fc של תאים דנדריטים.
    5. הוסף ארנב נגד חיידקי נוגדן (10 מיקרוגרם / מיליליטר כריכוז סופי) ב -50 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 30 דקות על קרח להכתים חיידקים תאיים.
    6. לשטוף את התאים עם PBS / BSA / EDTA ודגירה עם נוגדן נגד CD11c עכבר מצומדות עם Phycoerythrin (PE) וseנוגדן condary נגד ארנב מצומדות עם fluorochrome אחר כמו Alexa-פלואוריד 647 ב 1: 200 ב100 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 30 דקות על קרח.
    7. לשטוף את התאים ולנתח דגימות על ידי cytometry זרימה. אל תשכח לכלול מדגם של תאי T transinfected באמצעות חיידקים הלא ניאון שליטה שלילית וכדגימות שכותרתו עם רק אחד מכל fluorochrome השתמש בניסוי כדי לפצות את הדגימות ולהתאים את הזרימה cytometry הגדרות 25. ניתוח נציג מוצג באיור 5.
      הערה: אם חיידקים אינם מבטאים GFP, להבחין תאית וחיידקים תאיים, חיידקים תאיים תווית, לתקן, וpermeabilize דגימות עם טריטון X-100 ברמה של 0.5% ב- PBS במשך 5 דקות. לאחר מכן כתם חיידקים כולל (תאית + תאי) עם fluorochrome שונה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

במסמך שתארנו כיצד לבצע transinfection חיידקי תא T עכברי ממח עצם נגוע נגזר DCs ואיך למדוד transinfection חיידקים באמצעות שתי גישות שונות: cytometry הזרימה וגנטמיצין הישרדות assay איור 1 מסכם את ההליך כדי לקבל את התאים.. DCs מופקים על ידי דגירה של תאי מח עצם עם GM-CSF ל9 ימים. אז, DCS הם maturated עם LPS להגדיל MHCII על קרומו כדי לטעון אותם מאוחר יותר על עם פפטיד ספציפי של OVA (OVAp). כביקורת, כמה DCs אינם עמוס OVAp. DCs שני (OVAp-הט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תאי T או התאים T הם סוג של כדוריות דם לבנות שתפקיד מרכזי בחסינות תא בתיווך ושייך לתגובה החיסונית אדפטיבית 26. תאי T הם עקשן ללהידבק במבחנה אבל כמה דיווחים מצביעים על כך שהם יכולים להיות נגועים בvivo 14,15. הקשר האינטימי של תאי APC ו- T בסינפסה החיסונית לשמש פלטפורמות להחלפת חומר ביולוגי 13, כוללים כמה וירוסים כגון HIV 11. לאחרונה הוצגו כי בניגוד לדוגמא, תאי T, את הפרדיגמה של תאים של חסינות אדפטיבית, הם גם מסוגל ללכוד בי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC ממשרד המדע והחדשנות הספרדי ו-PIES201020I046 מ-Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
RPMIFisher ScientificSH3025501
r-GMCSFPeprotech315-03
LPSSIGMAL2630-10mg
ו-PyruvateThermo ScientificSH3023901
2-MEGibco31350-010
OVAp OTII (323– 339)מסננת תאים GenScript
70uMBD352350
  30 uM מזרק Filcons סטריליBD340598
AutoMacs קלאסיMiltenyi Biotec130-088-887
GentamicinNormon624601.6
TranswellCostar3415
LBPronadisa1231
AgarPronadisa1800
Paraformaldehyde 16%Electron Microscopy Sciences15710
Triton X-100
CD8 biotBD Biosciences553029
IgM BiotImmunoStepClone RMM-1
B220 BiotBD Biosciences553086
CD19 biotBD Biosciences553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)BD Biosciences553622
CD11b biotImmunostep11BB-01mg
CD11c biotImmunostep11CB3-01mg
DX5 biotBD Biosciences553856
Gr-1 biotBD Biosciences553125
CD16/CD32ImmunoStepM16PU-05MG
אנטי סלמונלהABD Serotec8209-4006
CD11cPEBD Biosciences553802
CD4-APCTonbo Biosciences20-0041-U100
Gr-1 APCBD Biosciences553129
MHC-II (I-A/I-E) FITCBD Biosciences553623
Alexa-Fluor 647 נוגדן IgG (H+L) נגד ארנב עזים,Invitrogenנספג מאודA-21245
CMAC (7-אמינו-4-כלורומתילקומרין)טכנולוגיות חייםC2110
BSASIGMAA7030-100G
סטרפטווידין מיקרו-חרוזיםMiltenyi Biotec130-048-101
BD FACSCanto IIBD Biosciences

מקורות

  1. Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
  2. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. , Garland Science. New York. (1989).
  3. Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
  4. Rhoades, R. A., Bell, D. R. Medical Phisiology. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).
  5. Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
  6. Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
  7. Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
  8. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
  9. Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
  10. Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
  11. Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
  12. Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740(2010).
  13. Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
  14. McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
  15. Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
  16. Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
  17. Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
  18. Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
  19. Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  20. Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
  21. Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
  22. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1(2008).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765(2013).
  24. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
  25. Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
  26. Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TTrans wellSalmonella Enteritidis
תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.