הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/52983

⸱

7 ביולי 2015

 ,  , 
1Department of Neurology, University of Washington, 2Therapeutic Innovation Group, School of Life and Medical Sciences, University College London, 3Department of Neuroinflammation, University College London

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מיקרוגליה יכולה להשפיע על נוירונים וגליה אחרת בתרבית על ידי מנגנונים אוטונומיים שונים שאינם תאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול סלקטיבי של מיקרוגליה מתרביות עצביות ראשוניות. לשיטה זו יש פוטנציאל להבהיר את תפקידן של אינטראקציות מיקרוגליאליות-עצביות, עם השלכות על מצבים ניווניים שבהם דלקת עצבית היא מאפיין סימן היכר.

תקציר

מיקרוגליה, התאים החיסוניים של מערכת העצבים המרכזית, ממלאים תפקידים רב-פנים בוויסות ובקרה של תפקוד עצבי, כמו גם בתיווך חסינות מולדת. מודלים ראשוניים של תרביות תאי מכרסמים קידמו מאוד את הבנתנו את האינטראקציות העצביות-גליה, אך רק לאחרונה נעשה שימוש בשיטות לסילוק ספציפי של מיקרוגליה מתרביות מעורבות. טכניקה אחת כזו - המתוארת כאן - היא השימוש ב-L-לאוצין מתיל אסטר, חומר ליזומטרופי המופנם על ידי מקרופאגים ומיקרוגליה, שבו הוא גורם להפרעה ליזוזומלית ובהמשך לאפופטוזיס13,14. ניסויים המשתמשים ב-L-לאוצין מתיל אסטר יכולים לזהות את תרומת המיקרוגליה לסביבה התאית הסובבת בתנאי תרבית מגוונים. באמצעות פרוטוקול המותאם במעבדה שלנו, אנו מתארים כיצד לחסל מיקרוגליה מתרבית תאי גרגירי מוח קטן של מכרסמים P5. גישה זו מאפשרת להעריך את ההשפעה היחסית של מיקרוגליה על נתונים ניסיוניים, כמו גם לקבוע אם מיקרוגליה ממלאת תפקיד נוירו-פרוטקטיבי או נוירוטוקסיק במודלים תרביים של מצבים נוירולוגיים, כגון שבץ מוחי, אלצהיימר או מחלת פרקינסון.

מבוא

המוח האנושי מורכב 85 מליארד נוירונים משוערים ותאים שאינם עצביים 85 מיליארדים נוספים כוללים גליה 1. לחלק הגדול יותר של 100 השנים האחרונות מדעני המוח התמקדו בעיקר באוכלוסיית התאים העצבית, תאי גליה להאמין להיות קצת יותר מאשר תאים פסיביים תמיכה שספקו תמיכה מבנית לנוירונים - ומכאן האטימולוגיה היוונית של "גליה" תורגמה לאנגלית כ "דבק". לאחרונה, עם זאת, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי אינטראקציות עצביות-גליה עשויות להיות הרבה יותר בסיסיות להיבטים בסיסיים של נוירוביולוגיה, נוירופיזיולוגיה, והראשית וההתקדמות של מחלות ניווניות רבות. תאי המוח הקטן גרגיר (CGCs), האוכלוסייה הומוגנית העצבית הנפוצה ביותר במוח האנושי, שולטים במוח הקטן ומהווים יותר מ -90% מהבוחרים הסלולריים שלה. כתוצאה מכך, תאים אלה היו בשימוש נרחב במבחנה כמערכת מודל לtהוא חקר התפתחות עצבית, פונקציה, ופתולוגיה 2-6.

עם זאת, תרבויות CGC עדיין מכילות מיקרוגלים וגליה אחרות בפרופורציות לטעון משמעותיות. כתוצאה מכך, נתוני CGC putatively מוצגות תגובות עצביות ישירות לטיפולי תאים שונים עשויים למעשה מתעוררים - בחלקו או בסך הכל - מהתגובה המשנית העקיפה של השכן גליה בתרבות. כדי להעריך את זה, אנחנו סלקטיבי בוטלו microglial מתרבויות עצביות CGC עם הסיוע של אסתר L-לאוצין תיל (LME). LME הוא סוכן lysomotropic שימש במקור כדי להרוס באופן סלקטיבי מקרופאגים 7, ומאז משמש לרוקן גם באופן סלקטיבי מיקרוגלים מעצביים, astrocyte, ותרבויות גליה מעורבות 8,9,10. LME מופנם על ידי מקרופאגים ומיקרוגליה, שבו היא גורמת להפרעת lysosomal ואפופטוזיס לאחר מכן 13,14. המקרופאגים ומיקרוגליה הם אופייני עשירים בlysosomes, גורמים להם להיות particularly פגיע בחשיפה לטיפול LME. פרוטוקול זה מספק דרך רבת עוצמה, אך פשוטה וקלה לברר את התרומה של מיקרוגליה בניסויי ניצול CGC ומערכות אחרות עצביות / גליה תרבות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים המתוארים במסמך זה בוצעו בהתאם לבעלי חיים בריטניה (הליכים מדעיים) Act of 1986.

1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, ומנות

  1. הכן שני מספריים מעבדה הנירוסטה לנתח ושני מלקחיים מעבדה נירוסטה. החיטוי כל המכשירים והמקום בO מכסה המנוע התרבות / N תחת אור אור (UV) אולטרה סגול לעיקור.
  2. הפוך 500 מיליליטר של תקשורת חיונית בינוני מינימום (ממ) תרבות (10% עובריים שור [FBS] סרום, 20 מ"מ KCl, 25 מ"מ NaHCO 3, 30 מ"מ D-גלוקוז, L-גלוטמין 2 מ"מ, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו -6 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין) ולסנן לעקר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים.
  3. הכן 24 צלחות תרבות היטב המכילות 14 מ"מ, עובי coverslips מספר 1. החיטוי coverslips ומעיל ב/ L 100 מ"ג פולי-ד-ליזין (PDL) כפי שתואר קודם לכן 3. אור UV לעקר O / N.

2. הכנת פתרונות CGC תרבות

  1. הכן 'פתרון' (100 מיליליטר) בautoclaved אור UV, טופל, סטרילי DH 2 O המכיל 250 מ"ג של גלוקוז, 300 מ"ג של סרום שור אלבומין [BSA], 955 מ"ג של בופר פוספט [PBS] (Ca 2 + ו Mg + חינם), ו 1 מיליליטר של 3.8% MgSO 4 · 7H 2 O.
  2. הכן 'פתרון ב' (10 מיליליטר) מכיל 1 מיליליטר של 5 מ"ג / מיליליטר טריפסין המדולל ב9 מיליליטר של א 'הפתרון
  3. הכן 'C פתרון "(10 מיליליטר) מכיל DNase 1,000 יחידות, 0.5 מ"ג של מעכבי טריפסין הסויה, של 3.8% MgSO 4 · 7H 2 O 100 μl, בדילול מלא עד 10 מיליליטר עם א' הפתרון
  4. הכן 'D פתרון "(20 מיליליטר) מכיל 3.2 מיליליטר של C פתרון, בדילול מלא עד 20 מיליליטר עם א' הפתרון
  5. הכן הפתרון מאוזן של BSA / ארל תמיסת מלח (EBSS) המכיל EBSS, 25 מ"מ NaHCO 3, 3 מ"מ MgSO 4 · 7H 2 O, ו4 BSA%, pH 7.4, כפי שתואר לעיל 3.
  6. הכן LME ידי הוספת LME הטהור לתוך 5 מיליליטר של מדיום תרבות ממ לתת ריכוז סופי של 150 מ"מ LME, להחזיר את הפתרון לpH 7.4 באמצעות מד pH benchtop, ומסנן לעקר באמצעות sulfone 28 מ"מ polyether (PES) 0.2 מיקרומטר מזרק מסנן.

3. Culturing CGCs

  1. לאסוף cerebella מגורי חולדה ישנים 4-7 יום כפי שתואר בעבר 3. הנח מייד בצלחת פטרי המכילה 5 מיליליטר פתרון על קרח.
  2. יוצקים את הפתרון עודף מרקמת המוח קטנה ומקום במכסה צלחת פטרי.
  3. קוצצים דק רקמה עם סכין גילוח בערה היטב בלפחות שלושה כיוונים שונים.
  4. להוסיף רקמה קצוצה לפתרון B (לשטוף צלחת פטרי עם פתרון כדי להבטיח רקמה מוגבלת אבד) ומקום באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ללחוץ בעדינות כל כמה דקות.
  5. להוסיף D פתרון (20 מיליליטר) לצינור כדי לנטרל את טריפסין, לרעוד ואחוזיםrifuge ב 65 XG במשך 5 דקות.
  6. יוצקים את supernatant.
  7. Resuspend ב 4 מיליליטר של תמיסת ג Triturate היטב (כ 10 פעמים כל אחד) עם שלוש טפטפות זכוכית הלוהבת של הפחתת קוטר, עד ההשעיה היא הומוגנית ככל האפשר.
  8. לאט ובעדינות להוסיף כמה טיפות של homogenate זה על גבי BSA / EBSS. אם זה מתחיל לשקוע דרך BSA / EBSS, triturate יותר ו / או להוסיף פתרון יותר קטן ג homogenate צריך לשבת בשכבה על גבי BSA / EBSS. לא לרעוד. ספין ב 100 XG במשך 5 דקות.
  9. הסר supernatant וגלול גלולים (רך) ב 1 מיליליטר של מדיום ממ.
  10. ספירת תאים באמצעות haemocytometer וצלחת ב800,000 תאים / coverslip ב500 μl של מדיום ממ. מקום בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 6% CO 2.
  11. לשנות את המדיום למחרת (24-36 שעות לאחר ההכנה). הפוך פתרון של מדיום ממ המכיל 10 מיקרומטר של cytidine מחזור התא arabinofuranosyl המעכב (ARAÇ).
    1. לכל אחדcoverslip, לשמור על 250 μl של המדיום הישן בצלחת גם טרי 24, לשאוב את השאר, להוסיף 250 μl של מדיום ממ הנורמלי ולשאוב זה לשטוף את התאים, ולאחר מכן להוסיף 250 μl של מדיום ישן חזרה לתאים והעליונים עד עם 250 μl של מדיום המכיל ARAÇ.
      הערה: ניתן להשתמש בתאים מ6 ימים במבחנה (DIV).

4. סלקטיבי וכלת Microglia (הנערכת בשעה 6 DIV)

  1. להוסיף LME הטהור עד 5 מיליליטר של aliquot נפרד של מדיום ממ לתת ריכוז סופי של 150 מ"מ LME.
  2. להחזיר את הפתרון לpH 7.4 ומסנן לעקר באמצעות sulfone 28 מ"מ polyether (PES) מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק.
  3. לדלל פתרון לריכוז של 50 מ"מ (2 x LME) במדיום ממ ומקום באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות יחד עם מדיום ממ רגיל לתרבויות שליטה.
  4. הסר מחצית (250 μl) בינוני ממ מתרבויות CGC ולשמור על 37 מעלות צלזיוס.
  5. תאי פינוקעם מדיום ממ המכיל 2 x LME (250 μl), כלומר דילול 1: 1 נותן ריכוז טוב של 25 מ"מ, או עם מדיום מראש חימם ממ ללא LME (250 μl) לתרבויות שליטה.
  6. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified עם 6% CO 2 עבור שעה 1.
  7. לשטוף את תאי פעמיים במדיום ממ טרי מראש חימם להסיר תקשורת LME המכיל, ולאחר מכן להחליף את מדיום התרבות נשמרת ונפח שווה של מדיום ממ הטרי מראש חימם לבארות המקבילות.
  8. חזור תרבויות לחממה (humidified עם 6% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס) ולהשאיר למנוחה למשך 24 שעות לפני כל טיפול נוסף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היכולת של טכניקה זו כדי לחסל באופן סלקטיבי מיקרוגלים מCGC ו / או תרבויות מעורבות מסתמכת על היכולת העתידית של החוקר לזהות בצורה מדויקת ולהבדיל מיקרוגלים מהתאים המקיפים אותם. זה יכול להיות מושגים באמצעות יצרנית תא microglial הספציפי, כגון isolectin-B4, כפי שמודגם באיור 1. כפי שהודגם באיור 2, לא חל שינויים נצפים לastrocyte וצפיפות עצבית ומורפולוגיה נרשמו ביחס לכל אחת מקבוצות הטיפול העיקריות. חשוב לציין, לא חל שינוי משמעותי במורפולוגיה עצבית או astroc...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הצעדים החשובים ביותר כדי להבטיח את הסילוק בררני המוצלח של מיקרוגלים מCGC ו / או תרבויות מעורבות הן: 1) שמירה על תרבות CGC סטרילי ובריאה; 2) מסנן חיטוי הבינוני LME המכיל וחוזר הפתרון לpH 7.4; 3) שמירה על תקשורת CGC נשמרת וLME המכיל תקשורת ב 37 ° C כדי למנוע הלם חום; ו 4) עובד במהירות כדי לצמצם את זמן תאים נשמרים מחוץ לחממה.

אנחנו השתמשנו 25 מ"מ LME לרוקן מיקרוגלים מתרבויות CGC - ריכוז מותאם בעבר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי Aims2Cure, בריטניה ופרס UCL Impact Award לדוקטורט ל-JMP ודוקטורט לבניית יכולת MRC בדמנציה ל-JMP.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מלקחיים סיגמא-אולדריץ'F4142הקצה המעוקל מקל על הסרת המוח הקטן 
מספריים מיקרו-חיתוכיםSigma-AldrichS3146נקודה ישרה וחדה מקלה על דיסקציה של מכרסמים P4-7 
L-לאוצין מתיל אסטר הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'7517-19-3
תמיסת EBSS Sigma-AldrichE7510-500 מ"ל
פולי-D-ליזיןSigma-Aldrich27964-99-4כיסויי מעיל יום אחד לפני השימוש 
אלבומין בסרום בקר (BSA)Sigma-AldrichA9418
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Sigma-AldrichP4417
DNaseSigma-AldrichD5025
מעכב טריפסין פולי סויה Sigma-AldrichT6414
עכבר נוגדן נגד ED1 אבקםab31630

מקורות

  1. Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
  2. Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
  3. Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
  4. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  5. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  6. Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
  7. Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
  8. Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
  9. Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
  10. Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
  11. Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
  12. Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
  13. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
  14. Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
  15. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
  16. Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.