מאמר זה מדגים נהלים כירורגיים של ריפלוקס גסטרו-ויזפאגי עם עכברים. מודלים אלו הם כלים שימושיים למחקר על מנגנונים וטיפול במחלת ריפלוקס גסטרו-ויזפאגי ופוטנציאלית בבריטי’ס הוושט ובסרטן הוושט.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודלי כירורגי של Gastroesophageal Reflux עם עכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
דיווחים רבים על פרוצדורות כירורגיות גרמו לריפלוקס גסטרו-וופאגי בבעלי חיים. כאן, אנו מדווחים על שלושה מודלים כירורגיים עם עכברים שמטרתם לגרום לריפלוקס של תוכן קיבה, תוכן תריסריון או תוכן מעורב. הפרוצדורות הכירורגיות והעקרונות הכלליים תוארו בפירוט. חוקר עם ניסיון כירורגי אמור להיות מסוגל לתפוס את הטכניקה לאחר תקופת תרגול קצרה. לאחר הניתוח, רוב העכברים יכולים לשרוד ולפתח דלקת הוושט ריפלוקס הדומה לזו בבני אדם. עם זאת, יש לציין כי הבדלים היסטולוגיים בין הוושט של עכבר לאדם הם המגבלות הטבועות של מודלים כירורגיים אלו. אם משתמשים בהם למחקר על הוושט של בארט ואדנוקרצינומה, ייתכן שיהיה צורך לשלב את הפרוצדורות עם שינוי גנטי.
מבוא
מחלת ריפלוקס גסטרו-ווגינלית (GERD) היא הפרעה כרונית הנגרמת כתוצאה מחשיפה ממושכת של החלק התחתון של הוושט לתוכן קיבה או גסטרו-תריסרי1. חשיפה ממושכת לחומרים רעילים אלו פוגעת בהגנות הטבעיות בתוך האפיתל של הוושט ובכך גורמת לדלקת הוושט2. הוושט של בארט נוצר במסגרת ריפלוקס כרוני, והוא נגע טרום-סרטני עם סיכון מוגבר לסרטן הוושט3,4. למרות החשיבות הקלינית, המנגנונים של GERD, הוושט של בארט וסרטן הוושט לא הובנו היטב.
מודלי בעלי חיים הם חיוניים למחקר על אטיולוגיה, פתולוגיה, מנגנונים מולקולריים, מניעה וטיפול במחלות אדם. עד כה, פותחו מודלי בעלי חיים שונים של GERD, הוושט של בארט וסרטן הוושט באמצעות בעלי חיים מודליים5,6. הוושט של העכבר מרופד באפיתל קשקשי מרובד שדומה היסטולוגית לזה של הוושט האנושי. למרות שהוושט של העכבר שונה מזה האנושי מבחינת קרטיניזציה והעדר בלוטות תת-ריריות, העכבר הוא עדיין מודל חיית ניסוי מושך בשל עלות התחזוקה הנמוכה יחסית והפוטנציאל שלו לשינויים גנטיים מתוחכמים. שתי גישות נפוצות למודל של GERD, הוושט של בארט וסרטן הוושט בעכברים: ניתוח ריפלוקס ושינויים גנטיים. ניתוח ריפלוקס הוא הדרך הטובה ביותר לגרום לריפלוקס ושינויים גנטיים מדמים שינויים מולקולריים5,7. ניתוח ריפלוקס ניתן לשלב עם שינויים גנטיים כדי להבין עוד יותר את מנגנוני המחלה8.
על ידינו ועל ידי אחרים6,9 דווחו על רבים מהליכים כירורגיים: (1) ריפלוקס קיבה: קשירת פילורוס, צמצום פילורוס עם קשירת הקיבה הקדמית, קרדיופלסטיקה של ונדל ואנסטמוזה אסופגו-גסטרית; (2) ריפלוקס מעורב: אנסטמוזה אסופגו-גסטרו-דואודנלית, אסופגו-דואודנוסטומי (או אסופגו-ג'ג'ונוסטומי); (3) ריפלוקס תריסרי: אנסטמוזה אסופגו-גסטרו-דואודנלית בתוספת גסטרקטומיה; (4) ריפלוקס של רכיבים כימיים: ריפלוקס מרה, ריפלוקס לבלב, השקיה של הוושט; ו (5) השתלת הוושט5. לאחרונה דווח על מודל עכבר מיקרו-כירורגי להפקת ריפלוקס תריסרי דרך אסופגו-ג'ג'ונוסטומיה עם מגנטים10. למודלי ניתוח אלו יתרונות על פני מודלי תרבית תאים in vitro או מודלי תרבית אורגנוטיפיים. In vitro, תאי הוושט אינם יכולים לסבול מדיום עם חומציות גבוהה או ריכוזים גבוהים של חומצות מרה. חומצות מרה לא מצומדות המשמשות בדרך כלל כדי לייצר שינויים בתאי האפיתל של הוושט in vitro אינן קיימות בדרך כלל בריפלוקס התריסרי in vivo. לכן יש ליטול בזהירות מסקנות הנגזרות ממחקרים in vitro כאלה.
ניתוח על הוושט של העכבר נותר אתגר טכני בגלל גודלו הקטן. שיעור נמוך של הישרדות לאחר ניתוח אינו מאפשר ניסויים הדורשים גודל מדגם מסוים כדי להגיע למסקנות סטטיסטיות מוצקות. בעבר פיתחנו והגדרנו בהצלחה מודלים כירורגיים של ריפלוקס קיבה, ריפלוקס מעורב, ריפלוקס תריסרי עם עכברים בניסויים ארוכי טווח9,11,12. אנו גם סיפקנו ייעוץ לכמה קבוצות אחרות בניתוח העכבר שלהם. כאן, אנו מתארים שלוש פרוצדורות כירורגיות בעכברים על מנת לעזור לקהילה להקים את המודלים האלו במעבדות שלהם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים.
1. עכבר הכנה
- השתמש בעכברים על ~ 20 גרם במשקל גוף או מעל ~ 6 שבועות בגיל לניתוח.
- לפני הניתוח, לתת עכברים כרצונך אוכל ומי מודעת מעבדה ולשמור על מחזור אור-חושך 00:12 שעות.
- לגלח את אזור הניתוח עם גוזז שיער. להרדים עכברים בזריקת intraperitoneal של 80 מ"ג / קילוגרם קטמין ומ"ג 12 / קילוגרם xylazine. מינון זה מעמיד את העכברים לתוך שינה בכמה דקות ומספק הרדמה מספיק לניתוחים הבאים.
- לאשר הרדמה נכונה המבוססת על היעדר רפלקס קרנית והכחשת איבר כאשר שודדים הוא צבט. החל הסיכה משחה עיניים על עיניים כדי למנוע יובש.
- לעקר עור עם פתרון בבטאדין.
2. קיבה Reflux דגם (איור 1)
- הפוך עליוןחתך קו האמצע של ~ 2 סנטימטר החל מxiphoid מצביע על פי הטבעת.
- פתח את חלל הבטן דרך קו האמצע. הסר את xiphoid כדי לשפר את החשיפה עם זוג מספריים.
- נפרד ולחתוך את רקמות חיבור בין הכבד והקיבה. לקשור ולחתוך את חבילת הכלי בין הטחול וקרקעית העין כדי בחינם לגמרי קרקעית העין.
- הפעל קרקעית העין מעט שמאלה ולחשוף את צד השמאל של צומת גסטרו בתחום. לעשות חתך אורכי 5 מ"מ על השריר לאורך הוושט הדיסטלי באמצעות מספריים חדים לחשוף את האפיתל.
- גזור לפתוח את האפיתל לאורך אותו הכיוון (חתך 1, איור 1). הפוך שלושה חתכים בforestomach (חתך 2, 3 ו -4, איור 1) לחתוך את רוב forestomach עם מספריים הפעלה חדים. אם הבטן אינה ריקה, להסיר בזהירות את תוכן קיבה.
- הנח sutu 8-0 proleneמחדש (עם נקודה להתחדד מחט) דרך נקודה (בוושט) ונקודה "(על forestomach) עם רירית מדויקת לרירית אופוזיציה. כמו כן תפרי מקום דרך נקודת B ונקודה ב ', וזוגות אחרים של נקודות, בהתאמה. באופן שווה בחלל תפרים אלה 3-4 מ"מ אחד מהשני.
- שטוף את חלל הבטן עם מלח רגיל לנקות דם ותוכן קיבה. סגור את דופן בטן עם תפרי משי ועור עם קליפים מתכת.
3. Reflux דגם מעורב (איור 1 ג)
- בצע את השלבים 2.1-2.4 לחשוף את צומת גסטרו.
- בעדינות להפריד את צד הגב של הוושט מכלי הדם מאחורי הוושט. לעבור קצה כותנה קטן בין כלי הוושט ודם.
הערה: הכותנה ניתן להסיר באופן חלקי מהקצה כדי להקטין את הגודל שלה. טיפ כותנה זה משרת שתי מטרות, מרים את הוושט והגנה על כלי הדם. - הפוך Inc שני 5 מ"מ האורךisions כל בצומת גסטרו והקצה הפרוקסימלי של התריסריון הסמוך לשוער עם מספריים הפעלה חדים. לחתך בתריסריון, להימנע מכלי דם ולהציב בגבול נגד mesenteric.
- Anastomose החתכים עם רירית מדויקת לרירית אופוזיציה עם 8-0 תפרי Prolene שהופסקו. בדרך כלל למקם 3-4 תפרים בצד הגב ו2-3 תפרים בצד הקדמי.
- הסר את קצה הכותנה. שטוף את חלל הבטן עם מלח רגיל ולסגור את דופן הבטן והעור.
4. התריסריון Reflux דגם (1D איור)
- עקוב צעד 3.1-3.4 ליצור מעורב ריפלוקס.
- בזהירות להרים את הבטן לחשוף הצד האחורי שלה. אונה של הכבד עלולה להיתפס על ידי רקמות חיבור בין הכבד והחלק האחורי של הבטן. בזהירות לחתוך רקמות חיבור, כראוי להגן על הכבד, ולחשוף את כלי הדם בצד הגב של הוושט.
- ולקשורלחתוך את כלי הדם. לקשור ולחתוך את הוושט בצומת גסטרו.
- לקשור את תריסריון בשוער. לקשור ולחתוך את mesenterium. הסר את כל הבטן.
- שטוף את חלל הבטן עם מלח רגיל. סגור את דופן הבטן והעור.
טיפול 5. לאחר ניתוח
- לאחר הניתוח לשמור על טמפרטורת גוף עם כרית חימום. רק לאחר שהשיב את כיבה sternal, למקם את העכברים חזרה עם בעלי חיים אחרים.
- תן אנטיביוטיקה ומשככי כאבים כדי למנוע זיהום ולהקל על כאב. הזרק Baytril (10 מ"ג / קילוגרם, IP, QD, במשך 3 ימים) כדי למנוע זיהום, וhydrochloride עצירות (0.05 מ"ג / קילוגרם, SC, הצעה. במשך יומיים) כמשכך כאבים. הצום הוא לא הכרחי לאחר ניתוח.
דיאטה נוזלית או רכה עלולה להיות נתון. - להעריך את מצב בריאות הכללי בbasis.If היומי העכברים להראות הסימנים הבאים (הפסד דרמטי במשקל> 15%, חוסר האפליקציהetite, ניקוד, לפרוק מהפה, האף או עיניים, חווה כפופה, חוסר הפעילות, פעילות טיפוח חריגה), להרדים את העכברים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
רוב העכברים (> 95%) יכולים לשרוד את הניתוח. בתקופה סביב הניתוח, סיבות מוות המובילות כוללות מנת יתר של חומרי הרדמה, דימום ומסיבות לא ידועות.
ארבעה שבועות לאחר ניתוח,> 90% עכברים עם ריפלוקס קיבה או מעורב ריפלוקס ו> 80 עכברי% עם ריפלוקס התריסריון יכולים לשרוד. במהלך תקופה זו, עכברים בעיקר מתים מצרות וחוסר היכולת לאכול בושט. עכברים אלה מראים סימנים של לחץ חמור (יציבה כפופה, חוסר פעילות, הקאות, עיניים שקועות,...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
דגמים ניתוחיים שונים הוקמו לחקות קיבה, התריסריון ומעורב ריפלוקס במכרסמים. שלושת נהלים אלה שתוארו כאן הם מתאימים לניסוי ארוך טווח עם מחירים סבירים של הישרדות לאחר ניתוח. חוקר עם ניסיון ניתוחי צריך להיות מסוגל לתפוס את הטכניקה לאחר תקופה קצרה של תרגול.
דימום יכול לנבוע מזריקת intraperitoneal של הרדמה לפני הניתוח, חתך של הכבד בהפרדה של רקמות חיבור בין הכבד והקיבה, והנזק מכוון של כלי הדם. זו יש להימנע ככל האפשר. מיני...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אחד המחברים (XC) קיבל מימון שסופק על ידי חברת תרופות טקדה בע״מ אשר תומכת במחקר בסיסי הקשור למחלת ריפלוקס גסטרו-ופאגי. אף אחד מהמגיבים או המכשירים המשמשים במאמר זה אינם מיוצרים על ידי חברה זו.
תודות
אנו נתמכים על ידי מענקי מחקר מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס' 81400590), המכונים הלאומיים לבריאות (U54 CA156735) וחברת התרופות טקדה בע״מ (MA-NC-D-156).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock.6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
מקורות
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59(2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
