נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

סיכום

הטכניקות המוצגות לקצירת כבד, קנולציה וזלוף באמצעות המכשיר הקנייני שלנו מאפשרות מערכי זלוף מתוחכמים לשיפור ניסויי דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה בכבד של חולדות.

תקציר

דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה של איברים פרנכימליים עשויים לאפשר יצירת איברים פונקציונליים במבחנה, ומספר פרוטוקולים לדה-סלולריזציה של כבד מכרסמים כבר פורסמו. מטרתנו הייתה לשפר את תהליך הדה-סלולריזציה על ידי בניית מכשיר זלוף קנייני המאפשר זלוף סלקטיבי דרך וריד הפורטל ו/או עורק הכבד. יתר על כן, ביקשנו לבצע זלוף בתנאי לחץ מסביב מתנודדים כדי לשפר את ההומוגניות של דה-סלולריזציה. ההומוגניות של דה-סלולריזציה של פרפוזיה הייתה גורם לא מוערך עד כה. במהלך דה-סלולריזציה, אזורים בתוך האיבר שחדרו בצורה גרועה עשויים עדיין להכיל תאים, בעוד שהמטריצה החוץ-תאית (ECM) באזורים עם חדירה טובה עשויה כבר להיות מושפעת מחומרי ניקוי אלקליין. שינויי לחץ מתנודדים יכולים לחקות את שינויי הלחץ התוך בטני המתרחשים במהלך הנשימה כדי לייעל את המיקרו-פרפוזיה בתוך הכבד. במחקר המוצג כאן, מטריצות כבד חולדות נטולות תאים נותחו על ידי צביעה היסטולוגית, ניתוח תכולת DNA ויציקת קורוזיה. זלוף דרך עורק הכבד הראה תוצאות הומוגניות יותר מאשר זלוף ורידי פורטלי. היישום של תנאי לחץ מתנודדים שיפר את היעילות של דה-סלולריזציה של פרפוזיה. כבדים שהוחדרו דרך עורק הכבד ובתנאי לחץ מתנודדים הראו את התוצאות הטובות ביותר. הטכניקות המוצגות לקצירת כבד, קנולציה וזלוף באמצעות המכשיר הקנייני שלנו מאפשרות מערכי זלוף מתוחכמים לשיפור ניסויי דה-סלולריזציה ורסלולריזציה בכבד של חולדות.

מבוא

Decellularization וrecellularization עשוי לאפשר את הדור של איברים פונקציונליים, השתלה במבחנה ^1. על ידי תאי הסרת וחומר אנטיגני (למשל., DNA, epitopes אלפא-גל) מאיבר, ניתן להשיג את המטריצה ​​הלא פחות או-חיסונית תאית (ECM). מטריצה ​​זו חוסכת microanatomy תלת ממדי של איברים ויכולה לשמש כbiomatrix האידיאלי לאכלוס עם תאים ממוצא שונה, ואולי xenogeneic ^2. כך, מטריצת כבד חולדה decellularized יכולה להיות אוכלס מחדש עם תאי כבד אנושיים. מיקרו-כבד אנושי זה יכול לשמש כמודל vivo לשעבר למחקר על מחלות (למשל., מחלות מטבוליות מולדות, מחלות ויראליות או ממאירות) או לבדיקת תרופות פרה ^3.

כמה פרוטוקולים שונים לdecellularization זלוף כבד חולדה כבר פורסמו ^4-13. בכל הפרוטוקולים, decellularלמען האזרוח הושג על ידי טפטוף של חומרי ניקוי יוניים או שאינם יוניים בסיסיים דרך וריד פורטל cannulated. למיטב ידיעתנו, היינו הקבוצה הראשונה לדווח decellularization כבד חולדה על ידי זלוף סלקטיבית דרך וריד הפורטל ו / או עכברוש העורק כבד ^14. מאפשר זלוף סלקטיבית של מערכות כלי דם השונות בכבד עשוי לאפשר תוצאות decellularization טובות יותר ו, יתר על כן, עשוי לשחק תפקיד חשוב באכלוס סלולארי.

במחקר המפורט כאן, כבדים היו perfused במכשיר זלוף קניינית מותאם אישית, המאפשרים זלוף בתנאי לחץ נדנוד. תנאי לחץ אלה מחקים את זלוף נשימה תלויה הפיזיולוגי של הכבד: באתר, הכבד נתקע מתחת לאוגד של הסרעפת, תנועה שבנשימה יש השפעה ישירה על זלוף כבד. השראה במיוחד מובילה להורדת של הסרעפת ולסחוט של הכבד, אופטימיזציהיצוא hepato-ורידים, ואילו פקיעה מובילה להעלאה של הכבד והורדה של לחץ intraabdominal כדי לייעל יבוא פורטל-ורידים ^15.

המטרה שלנו הייתה להעריך אם יש להם תנאי לחץ נדנוד השפעה על ההומוגניות של decellularization זלוף כבד חולדה על ידי חיקוי תנאי intraabdominal vivo לשעבר. ההומוגניות של תהליך decellularization עשויה להיות גורם לזלזל בdecellularization זלוף. כל הסוכנים הידועים המשמשים לשינויי סיבת decellularization הכבד לECM. תאים באזורי perfused גרוע יישארו בECM, ואילו באזורים אחרים כבר decellularized לחלוטין. לפזר את התאים הנותרים, משך זלוף או לחץ חייב להיות מורם, גורם ליותר שינויים באזורי perfused היטב. לפיכך, חומרי ניקוי לdecellularization צריך להיות מופץ homogenously בתוך האיבר.

פרוטוקול

בעלי חיים הוחזקו במתקן לרפואה ניסויית (FEM, Charité, ברלין, גרמניה), ואת כל פרוטוקולי הניסוי היו נבדקו ואושרו על ידי משרד המדינה לענייני בריאות ומקומי (LAGeSo, ברלין, גרמניה;. רג O מס '0365 / 11).

קציר 1. כבד

1. הכנה טרום ניתוחית
   1. השתמש בצלחת פקק לקיבעון. שים וילון רפואי על הצלחת. באמצעות ארבע מחטים, לתקן מסכת משאיפת על צלחת הפקק להרדמת משאיפת במהלך ניתוח.
2. סידור מכוון של פורטל ורידי הצינורית
   1. חבר צנתר ורידים היקפי (G-20) לברזלי שלוש-דרך. צנתר הוורידים יש לחתוך באלכסון, באורך של כ. 1.5 סנטימטר.
   2. דה-אוויר למערכת באמצעות מזרק 10 מיליליטר מלא פתרון רינגר. זה מאוד חשוב לזהירות דה-האוויר כי תסחיף גז עלול להשפיע לרעה על decellularization זלוף.
3. סידור מכווןשל צינורית העורקים
   1. השתמש צינורית פרפר ולחתוך את המחט לאורך של 5 מ"מ. להתאים צינור 5 סנטימטר (ID 0.58 מ"מ; OD 0.96 מ"מ) למחט 5 מ"מ ולתקן את זה עם דבק מגע. הכנס צינור 2 ס"מ ארוך (ID 0.28 מ"מ; 0.61 מ"מ OD) לתוך הצינור הגדול ולתקן את זה עם דבק מגע.
   2. להחליק צינור אחר על בנייה זו כבסיס גשר ולתקן את זה עם דבק מגע. דה-אוויר צינורית העורקים עם מזרק 5 מיליליטר מלא פתרון רינגר.
4. הרדמה ושיכוך כאבים
   1. לגרום להרדמה של החולדה בחדר האינדוקציה ההרדמה על ידי isoflurane 3.5% בחמצן בקצב זרימה של 1.5 ליטר / דקה.
   2. כדי להבטיח שיכוך כאבים בטוחים במהלך המבצע, להזריק metamizol (100 מ"ג / קילוגרם מסת גוף) וקטמין במינון נמוך / medetomidine (10 מ"ג / 0.1 מ"ג לכל קילוגרם מסת גוף) intraperitoneally.
   3. לספק isoflurane 1.5% בחמצן / דקה 1 ליטר באמצעות מסכת משאיפת לתחזוקה הבאה של הרדמה כירורגית.
5. הסדרים לפני ניתוח
   1. לגלח את הבטן בנדיבות עם מכונה גז חשמלית. להרטיב את אתר החתך המגולח בבטן עם אתנול 70% לחיטוי.
   2. מניחים את החיה במצב שכיבה על הצלחת מוכנה, להכניס את הראש לתוך מסכת משאיפת ולתקן את הגפיים עם קלטת רפואית וסיכות. הסר אתנול ופרווה עודפים עם תחבושות.
6. הערכת הרדמה
   1. להעריך את עומק ההרדמה על ידי צפייה בקצב הנשימה. כאשר ההרדמה נראית עמוקה מספיק (40-60 נשימות / דקה), לבדוק אם כאבים די בניסיון לעורר את רפלקס קמצוץ הבוהן באמצעות מלקחיים כירורגיים לצבוט את העור בין האצבעות של שני גפיים האחוריות.
7. גישת בטן
   1. לעשות חתך החציוני בקיר בטן הזנב מעל שלפוחית ​​השתן. לחתוך מנקודה זו לשתי קשתות costal הרוחב באופן בצורת V. יש להיזהר שלא לחתוך לסרעפת. משוך את דופן הבטן לחתוך מעל החזה.
   תקן את xiphoid עם מהדק אוברהולט, למשוך אותו cranially ולתקן את זה עם גומייה. השתמש צמר גפן רטוב לפנות את המעי. לעטוף את המעי בתחבושת גזה רטובה. יתר על כן, לכסות את כל השוליים הבטן עם תחבושות רטובות.
8. כבד הכנה
   1. לנתח את רצועת falciform. השתמש בתחבושת גזה רטובה כדי להחזיק את האונה של הכבד המדיאלי ועזבה cranially מתחת לכיפה של הסרעפת. לחשוף את רצועת hepatoduodenal ואונת כבד omental העליונה.
   2. השתמש בשני microforceps ומספריים באביב כדי לנתח בזהירות את הרצועה הצמודה לאונה העליונה omental עד האונה היא ניידת. הזז את האונה באמצעות צמר גפן רטוב מתחת לתחבושות, מחזיק אונות המדיאלי והשאירו במקום.
   3. לאחר הגיוס של אונת כבד omental העליונה, להעביר את הבטן בצד השמאל. תקן את הבטן עם מהדק ולנתח את omentum הקטין עם microforceps והמספריים באביב.
   4. לגייס את omenta הנמוךl אונת כבד עד שהוא נייד ולאחר מכן להעביר את האונה אחורית לתוך החלל שלה. השתמש מהדק בקהאוס כדי לשמר את תריסריון. הזז את תריסריון לשמאל כדי למתוח ולחשוף את רצועת hepatoduodenal. להותיר את צינור מרה המשותף ברצועת hepatoduodenal המתוחה.
   5. לנתח את צינור המרה מהשומן ורקמת לבלב. חותך את צינור המרה של 1.5 סנטימטר מהסתעפות צינור מרה. לנתח את וריד השער מרקמת השומן שמסביב. לחשוף את וריד gastroduodenal.
   6. לקשור את וריד gastroduodenal פעמיים עם משי 6-0 ולחלק את הווריד בין 2 חיבורי האותיות. לנתח את תא מטען צליאק ועורק כבד הנפוץ מן הרקמה הסובבת עד שכל רמי העורקים מתגלים.
   7. לשחרר את עורק gastroduodenal מן הרקמה הסובבת. לקשור את עורק gastroduodenal פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את עורק gastroduodenal בין 2 חיבורי האותיות.
   8. לשחרר את עורק הטחולמהרקמה הסובבת. לקשור את עורק הטחול פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את עורק הטחול בין 2 חיבורי האותיות.
   9. לשחרר את עורק הקיבה שמאל מהרקמה הסובבת. לקשור את עורק הקיבה שמאל פעמיים עם משי 6-0, עם הקשרים רחוקים אחד מהשני. לנתח את העורק בין 2 חיבורי האותיות.
   10. להותיר את וריד caval הנחות בין הכליה הימנית ואונת כבד לרוחב הנכונה. לנתח את הווריד מהחלל retroperitoneal. לחשוף את אב העורקים על ידי הבא לתא מטען צליאק.
   11. לנתח את רקמת שומן retroperitoneal. הזרק 1,000 הפרין IE מלוחים 1 מיליליטר לווריד הנבוב הנחות. לחזור הצינורית ולסגור את החתך עם צמר גפן. חכה 1-2 דקות להשפעה המערכתית של הפרין.
   12. להותיר את אב העורקים עם מלקחיים. לנתח את אב העורקים ולגרום לדימום מחודש החולדה. יתר על כן, לנתח את נחות הווריד הנבוב distally מהכליות.
9. פורטל הוורידים Cannulation (השתמש בצינורית מוכנה בסעיף 1.2)
   1. לעשות חתך דגים-פה בוריד שער דיסטלי. פתח את החתך עם מלקחיים וcannulate וריד השער. לשטוף את הכבד עם 20 מיליליטר פתרון רינגר עד decolorizes הכבד ולתקן את הצינורית עם חיבורי אותיות (משי 6-0).
10. העורקים Cannulation (השתמש בצינורית מוכנה בסעיף 1.3)
    1. לנתח את אב העורקים מעל תא מטען צליאק. לשחרר את קטע אב העורקים מהחלל retroperitoneal. חותך את קטע אב העורקים longitudinally ליצור תיקון אב העורקים. הכנס את הצינורית העצמית בנויות לבעל סטטי.
    2. השתמש 2 מלקחיים כדי להחליק את תיקון אב העורקים על הצינורית. ולקשור את העורק הכבד עם משי 6-0 על הצינורית ולתקן את התיקון בירכה.
11. Explantation כבד
    1. פתח את הסרעפת, לעשות חתך עגול ולנתח את הכבד מהמבנים הסמוכים.
12. אחסון
    1. סטהמחדש את הכבד במכל 500 מיליליטר סטרילי המלא 350 מיליליטר פתרון רינגר עד לשימוש.

2. פתרונות דטרגנט

1. 10% מניות פתרון Triton X-100
   1. מלאו בקבוק 1,000 מיליליטר עם dest אקווה 900 מיליליטר. ולהוסיף 100 מיליליטר Triton X-100 (99,9%). השתמש בוחש לפזר את טריטון X-100. מלא את הבקבוק עם dest אקווה. עד נפח כולל של 1,000 מיליליטר הוא הגיע.
2. 1% Triton X-100
   1. להוסיף את פתרון המניות 100 מיליליטר (10%) לבקבוק 1,000 מיליליטר. להוסיף 900 ​​dest אקווה מיליליטר. ולנער את הבקבוק פעמיים. סנן 1% דרך פילטר סטרילי פתרון Triton X-100.
3. 10% SDS פתרון במלאי
   1. מלאו בקבוק 1,000 מיליליטר עם dest אקווה 900 מיליליטר. ולהוסיף SDS 66.99 גרם (99.9%, צפיפות 0.67). השתמש בוחש לפזר את SDS. מלא את הבקבוק עם dest אקווה. עד נפח כולל של 1,000 מיליליטר הוא הגיע.
4. 1% SDS
   1. להוסיף את פתרון המניות 100 מיליליטר (10%) לבוט 1,000 מיליליטרייתכנו. להוסיף 900 ​​dest אקווה מיליליטר. ולנער את הבקבוק פעמיים. סנן 1% SDS הפתרון דרך פילטר סטרילי.

3. Decellularization

1. הגדרה של התקן זלוף

איור 1:. תכנית של התקן זלוף לסלקטיבי עורקים וורידי הפורטל זלוף של כבדי עכברוש ארבעה תחת תנאי לחץ נדנוד (. שונה מן et al Struecker ¹⁴⁾

1. קישור לטמיון לברזלי שלוש-דרך והארכת Heidelberger להסדיר את רמת מילוי וממלא את הכור עם 500 מיליליטר 0,9% NaCl.
   

איור 2:. תכנית של הגדרת זלוף קישור תא זלוף (1,400 סנטימטר ³⁾ (1) לקצה הדיסטלי (4) למלכודת הבועה (5) דרך גישת ורידי הפורטל (2) או באמצעות AC העורקיםסס (3). מלכודת הבועה (5) צריכה להיות מצוידת בחֲסִימָה (4) בקצה הדיסטלי ואוורור (6). חבר את מלכודת הבועה (5) להארכת Heidelberger (7). קישור הארכת Heidelberger למגזר המשאבה (8). יתר על כן, לחבר את קטע המשאבה (8) לעוד ארכה Heidelberger (9). הכנס את ההארכה האחרונה Heidelberger (9) לבקבוק של תמיסת ניקוי (10). חבר את הנשמה (11) לתא זלוף (או למפיץ הלחץ במקרה של זילופים מרובים). כדי לנקז את נוזלי הכור, לחבר את יצוא לבקבוק פסולת (12).

1. הכנס את קטע המשאבה למשאבה. התחל המשאבה כדי למלא את המחזור עם PBS, לסגור את הקצה הדיסטלי של מלכודת הבועה ולפתוח את פתח האוורור. כאשר החלק התחתון של הבועה מכוסה היטב עם PBS (2-3 סנטימטר), לסגור את פתח האוורור ולפתוח את הקצה הדיסטלי של מלכודת הבועה.
2. התקנה כבד
   1. קישור הסתום המשולש של צינורית וריד שער לגישת כור בנושא. גonnect צינורית העורקים לגישת העורקים. להיות זהיר כדי להבטיח שאף אוויר נכנס למערכות.
3. יישום של תנאי לחץ נדנוד
   1. השתמש הנשמה בתדירות של 15 פעימות לדקה ומשרעת של 26 mbar (דקות. 4 mbar, מקסימום. 30 mbar). חבר את מכשיר ההנשמה לתא לחץ ההפצה ולחבר את התא לכור. התחל יישום לחץ.
4. פרוטוקול decellularization
   1. בצע את השלבים זלוף עם קצב זרימה של 5 מיליליטר / דקה. התחל decellularization עם טפטוף של הכבד עם 1% Triton X-100 למשך 90 דקות. לאפשר הזרמת שפכים באמצעות יצוא של מכשיר זלוף ולהשאיר את הנוזל בתוך מתמיד תא זלוף ומעל כבד perfused. לאחר 90 דקות, לשנות את חומר הניקוי ל1% SDS.
      
      

איור 3: זלוף פרוטוקול לכל קבוצות הניסוי.

תוצאות

הומוגניות ובכך את האפקטיביות של פרוטוקולי decellularization שונים הוערכו על ידי התבוננות מקרוסקופית, ניתוח היסטולוגית, וניתוח של תוכן ה- DNA שנותר בתוך מטריצות כבד decellularized. יתר על כן, ליהוק קורוזיה בוצע לדמיין microanatomy שלם של כבדים לאחר decellularization.

Macroscopy

במהלך decellularization, הכבדים הפכו לוסנט, המציינים את הסרת התוכן סל...

דיון

למרות שהטכניקה שהוצגה לקציר כבד החולדה וdecellularization היא לשחזור בקלות, ישנם צעדים קריטיים מסוימים לשקול:

במהלך הכנה לקציר כבד, חשוב להימנע מדימום חמור משום שהיא תפעיל קרישת דם ועלולה לגרום להיווצרות קריש דם בתוך הכבד. לדעתנו, זה יתרון לחתוך אב העורקים בבטן ישירות לפני cannulation של וריד השער, כדי למנוע זרימת דם דרך העורק הכבד במהלך זלוף דרך וריד הפורטל. ברגע שהכבד cannulated וperfused ברור, היווצרות קריש דם...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורית עורקים בבנייה עצמית
צינורות פוליאתן לא סטריליים Portex	SIMS Portex	REF 800/110/100	0.28 מ"מ קוטר פנימי 0.61 מ"מ OD
פורטקס צינורות פוליאתן לא	סטריליים SIMS Portex	REF 800/110/200	0.58 מ"מ קוטר פנימי 0.96 מ"מ OD
Venodrop צנתר פרפר בטוח	Fresenius Kabi	3275851	21 G
צינורית וריד פורטל
ורידים היקפי	BD	393224	BD Venflon Pro 20G
תלת כיווני פקק	סמית'ס רפואי	888-101RE
ניתוח מקלות כותנה	Hecht-Assistent	4302
רפידות כותנה	Shaoxing Zhengde חבישה כירורגית	13H118-03
תחבושת גזה	Hubei Haige  מכשור רפואי	14388
Ringer Solution	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 מ"ל
10 מ"ל מזרק	בראון	4606108V	10 מ"ל / Luer Solo
5 מ"ל מזרק	בראון	4606061V	5 מ"ל / תפר Luer Solo
(משי 6/0)	Resorba	H1F	LOT 105001.81
וילון רפואי	Shaoxing Zhengde חבישה כירורגית	D0613011
כירורגי
מכשירים מחזיק מחט	Geuder	17570
מיקרו מלקחיים	Inox-Electronic	91150-20
מיקרו-מספריים	מרטין	11-740-11
מיקרו-מלקחיים	S& T
מהדק	Aesculap	BH111R
מספריים	F S T	14501-14
מלקחיים כירורגיים	Aesculap	BD 557
Decellularization
	Respirator Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR
ST Perfusion Device	Charite, מעבדת הנדסה רפואית	מכשיר דה-סלולריזציה	בהתאמה אישית
משאבה פריסטלטית ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	4 ערוצים
הרחבת היידלברגר 75 ס"מ	Fresenius Kabi	2873	75 ס"מ
MS/CA מקטע משאבה	IDEX	IS 3510	MS/CA/click'n'go/POM-C
צינור CA 2 פקק	חמושה	BPT NSF-51
			בהתאמה אישית
Luer Lock מחבר צינור	Neolab	מס' 02-1887
חומרי ניקוי כדורי
SDS	קארל רוט	CN30.4	2.5 ק"ג
טריטון X-100	קארל רות'	3051.1	10 ליטר
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
מכתים
איוזין 1%	מורפיסטו	10177
מאייר המטוקסילין	AppliChem	A4840
גומורי מכתים	מורפיסטו	11104
אלקיין צביעת Blue-PAS	מורפיסטו	11388
אדום ישיר 80	סיגמא אולדריץ'	365548