אנו מתארים פרוטוקול לשינוי זיקה תאית של משטח פיגום בסביבה מימית. השיטה מנצלת את הפוטוקטליזה של טיטניום דו חמצני כדי לפרק סרט אורגני באזור המוקרן באור. אנו מראים שניתן להשתמש בו ליצירת מיקרו-דומיינים של חלבוני פיגומים, הן מחוץ למקום והן באתרם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Photopatterning חלבונים ותאים בסביבה מימית שימוש Tio
במאמר זה
סיכום
תקציר
מזהמים אורגניים אשר נספחים על פני השטח של תחמוצת טיטניום (Tio 2) יכולים להיות מפורקים על ידי photocatalysis באור אולטרה סגול (UV). כאן אנו מתארים פרוטוקול רומן העסקת photocatalysis Tio 2 לשנות זיקת תא של משטח המצע מקומי. לצורך ניסוי זה, Tio 2 סרט דק היה על coverslip זכוכית מצופה גמגום, ופני שטח Tio 2 שונה לאחר מכן עם monolayer organosilane נגזר מoctadecyltrichlorosilane (OTS), אשר מעכב את הידבקות תא. המדגם היה שקוע במדיום תרבית תאים, והתמקד אור UV היה מוקרן לאזור מתומן. כאשר תאי PC12 שורת תאים עצביים היו מצופים על המדגם, תאים דבקו רק באזור המוקרן UV. בנוסף, אנו מראים כי שינוי פני השטח זה יכול גם להתבצע באתר, כלומר, גם כאשר תאים גדלים על המצע. שינוי נכון של פני השטח הנדרש עמ 'מטריקסrotein קולגן להיות נוכח במדיום בעת קרינת UV. הטכניקה המוצגת כאן יכולה להיות מועסקות פוטנציאלית בסוגי תאים מרובים דפוסים לבניית מערכות coculture או לתמרן באופן שרירותי תאים תחת התרבות.
מבוא
תהליכים ליתוגרפיה סמיקונדקטור ונגזרותיו - כגון 1,2 photolithography, ליתוגרפיה קרן האלקטרונים 3-6, וmicrocontact הדפסת 7-10 - הפכו להיות עכשיו כלי הוקם בביולוגיה של תא לגדול תאי חיים בעמדה וגיאומטריה מוגדרות. שיטת הדפוסים מסתמכת על השימוש במצעי microfabricated, בהיקף של מיקרו-האי של ציפוי מתירנית תא ברקע שאינו מתירנית. מצע כזה משמש כתבנית לתבנית התאים. טכנולוגיות אלה סיפקו לנו את שיטות הרומן להנדס תאים ותפקודם ברמה חד ורב-תאית, כדי לחלץ את המאפיינים הפנימיים של תאים, ולהגדיל את התפוקה של הקרנת סמים מבוססי תאים 11.
הת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת Tio 2 -coated זכוכית Coverslip
- מספר coverslips באמצעות חרט יהלומים. זה לא רק עוזר כדי לעקוב אחר כל coverslips אלא גם כדי להבטיח שהצד הנכון של המדגם פונה כלפי מעלה. נקה את coverslips, הראשון תחת זרם DDH 2 O, לאחר מכן על ידי טבילתם בפתרון פיראניה (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). לאחר 10 דקות, לשטוף ביסודיות את coverslips, 8 פעמים בDDH 2 O. יבש coverslips תחת N זרימת 2.
- הגדר Tio 2 יעד במערכת ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 א מראה תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק חתך (SEM) של סרט Tio 2-הופקד גמגום. מהתצפית, עובי של הסרט נאמד בכ 150 ננומטר. בולט כאן היא השטיחות של Tio 2 סרט שהופקד. ניתוח נוסף על ידי מיקרוסקופ כוח האטומי (AFM) גילה כי חספוס שורש ממוצע רבוע (RMS) של פני השטח היה 0.2 ננומטר (איור 2).
כאשר פני השטח Tio 2 הוא שונה עם OTS ולאחר מכן טובלים במדיום גידול .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול הנוכחי שלנו, Tio 2 סרט נוצר על ידי המקרטעת RF-magnetron. אנו דוגלים בשיטה זו בתצהיר שכן הוא מאפשר לנו להכין reproducibly Tio 2 סרט photocatalytic עם חספוס תת-ננומטר. למרות שתהליכי גמגום בתצהיר הם מוכרים למדעני חומרים ומהנדסי אלקטרוניקה, זה לא יכול להיות די נגיש לביולוגים. במקרה זה, סרט Tio 2 מצופי ספין יהיה בחירת חלופת 23. בשיטה זו, Tio 2 חלקיקים מומסים בממס פרושים על פני מצע על ידי כוח הצנטריפוגלי. ציוד מיוחד הנדרש .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מודים למר קוטארו אוקובו על הסיוע האדיב בהדמיית SEM. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה היפנית לקידום המדע מענק סיוע למחקר בסיסי (B) (20310069), מענק סיוע לסטארט-אפ של פעילות מחקרית (25880021), ועל ידי מענקי מחקר מקרן המדע והטכנולוגיה של קוראטה ממוריאל היטאצ'י וקרן ניפון למדע והנדסה של חומרים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כיסוי זכוכית | Warner Instruments | CS-15R15 | קוטר 15 מ"מ, #1.5 עובי |
| יהלום סופר | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF מקרטע מערכת | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 יעד מקרטע | Kojundo Chemical Lab | טיטניום (IV) תחמוצת, טוהר מטרה | , 99.9% |
| כור פלזמה | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| צלחת תרבית רקמות (35 מ"מ) | גריינר | 627160 | |
| צלחת תרבית רקמות (60 מ"מ) | BD Falcon | 353002 | |
| קולגן מסוג IV | ניטה ג'לטין | Cellmatrix סוג IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| סרום בקר עוברי | Gibco | 12483-020 | השבתת חום ומעבר דרך 0.22 μ מסנן m לפני השימוש |
| סרום סוסים | Gibco | 26050-088 | עובר דרך 0.22 μ m מסנן לפני השימוש |
| פניצילין-סטרפטומיצין (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S גורם צמיחה עצבי (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| אלבומין בסרום בקר (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | תמיסת מלאי ב-0.5 M |
| TiO2 ננו-חלקיקים | Tayca | TKD-701 |
מקורות
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929(2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patter....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
