מאמר שיטה

הכנה ואפיון של פרט ורב-סמים נטענים בפח פיזי Micelles פולימרית

DOI:

10.3791/53047

⸱

28 באוגוסט 2015

 ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Pacific University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Oregon State University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את ההכנה והאפיון של תרופות כלואות פיזית ומסיסות במים במערכות אספקת תרופות מיסלריות המורכבות מקופולימרים בלוק אמפיפילי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קופולימרים לחסום amphiphilic כמו חומצת -polylactic בלוק polyethyleneglycol- (PEG- B- PLA) יכולים עצמי להרכיב למיצלות מעל ריכוז micellar הקריטי שלהם ויוצרת ליבות הידרופובי מוקפות פגזים הידרופילי בסביבות מימיות. הליבה של מיצלות אלה יכול להיות מנוצל כדי לטעון תרופות הידרופובי, גרועה מסיסה במים כמו docetaxel (DTX) וeverolimus (EVR). אפיון שיטתי של יכולות מבנה micelle וטעינת תרופה חשוב לפני במבחנה ובמחקרי vivo יכול להתנהל. המטרה של הפרוטוקול המתואר במסמך זה היא לספק את הצעדים הדרושים כדי להשיג אפיון מוצרי micellar סטנדרטיים. יש לי DTX וEVR solubilities הפנימי של 1.9 ו -9.6 מיקרוגרם / מיליליטר בהתאמה ניתן להשיג הכנת מיצלות אלה באמצעות יציקת ממס המגדילה את המסיסות המימית של DTX וEVR ל1.86 ו1.85 מ"ג / מיליליטר, בהתאמה. יציבות בסמים במיצלות evaluated בטמפרטורת חדר במשך 48 שעות עולה כי 97% או יותר מהתרופות נשמרים בפתרון. גודל micelle הוערך באמצעות פיזור אור דינאמי והצביע על כך שהגודל של מיצלות אלה היה מתחת ל -50 ננומטר ותלויים במשקל המולקולרי של הפולימר. שחרור תרופה ממיצלות הוערך באמצעות דיאליזה בתנאי כיור ב- pH 7.4 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. תוצאות ראויים עקומה מצביעות על כך ששחרור תרופה מונע על ידי תהליך הזמנה ראשון מצביע על כך שהוא מונע דיפוזיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קופולימרים לחסום amphiphilic עם מבנה חוזר מורכבים מתחומים הידרופילי והידרופובי יכולים באופן ספונטני עצמיים להרכיב-כדי ליצור שלושה מכלולי macromolecular ממדיים הידוע במיצלות פולימרים. יש מבנים אלה ליבה הידרופובי פנימית מוקפות פגז הידרופילי. יש הליבה הידרופובי היכולת לשלב תרופות הידרופובי או על ידי לכידה פיזית באמצעות אינטראקציות הידרופוביות או על ידי נטיה כימית לשדרת הפולימר. 1 יתרונות רבים קיימים לשימוש בקופולימרים לחסום אלה כדי ליצור מיצלות עבור משלוח סמים. אלה כוללים שילוב של תרופות מסיסים היטב, שיפור הפרמקוקינטיקה של התרופות משולבות, והתאמה ביולוגיות ו / או פריקות ביולוגית של הפולימרים גורם להם חלופי בטוח solubilizers הקונבנציונלי. 2 יתרון נוסף של שימוש במיצלות פולימרים הוא גודל החלקיקים קולואידים, בין 15 150 3 ננומטר, מה שהופך אותם אטרקטיביים לרשות פלסטיניתמשלוח renteral. לכן, ב -20 השנים האחרונות מיצלות פולימרים צמחה כמערכות אספקת סמים ברות-קיימא עבור תרופות מסיסים במים בצורה גרועה במיוחד לטיפול בסרטן. 3,4

כרגע יש חמישה ניסוחים micellar פולימרים לטיפול בסרטן בניסויים קליניים. 4 ארבעה של מיצלות בניסויים הקליניים קופולימרים diblock מבוססות PEG בעוד האחרון הוא קופולימר triblock מכיל polyethyleneoxide. הגודל של מיצלות אלה נע בין 20 ננומטר ל -85 ננומטר. היתרון של שימוש בפולימרים מבוססים PEG הוא ההתאמה הביולוגית שלהם ובהתאם לבלוק השני יכול להיות גם מתכלה. לאחרונה מערכות אספקת הסמים חדשות המבוסס על חומצת -polylactic בלוק polyethyleneglycol- (PEG- ב -PLA) מיצלות פולימרים פותחו עבור המשלוח המקביל של תרופות נגד סרטן מרובים. מיצלות PEG- B- PLA שניהם ביולוגית ומתכלה. רב-סמים אלה מיצלות העמוסה הראו כעיכוב ynergistic של דגמי סוגי הסרטן שונים במבחנת in vivo 2,5,6 ובכושר לפרדיגמה הנוכחית של ניצול תרופות מרובות בכימותרפיה כדי למנוע התנגדות והוריד רעילות. לכן, יש עניין רב בהכנה ואפיון מערכות אספקת הסמים micellar אלה לשימוש בסרטן ומצבי מחלה אחרים.

בעבודה שלהלן שהתווינו תהליך צעד-אחר-צעד שיכולה להיות מוכן מיצלות כזה ומאופיין לפני הערכתם במצבי מחלה של עניין. לצורך העבודה זו שני סוכנים אנטי-סרטניים גרוע מסיסים, docetaxel (DTX) וeverolimus (EVR) נבחרו. DTX וEVR שניהם תרכובות מסיסים במים בצורה גרועה עם solubilities מים פנימי וב1.9 9.6 מיקרוגרם / מיליליטר בהתאמה. 7,8 שני פולימרים -PLA ב PEG- עם משקולות מולקולריות שונות ששימשו בפרוטוקול זה כאבני בניין לפולימרים שגובשו מיצלות,פולימרים אלו PEG 2000 - ב -PLA 1,800 (3,800 Da) וPEG 4000 - ב -PLA 2,200 (6,200 Da). מיצלות -PLA ב PEG- לכן יכולה לספק פלטפורמה ייחודית כnanocarrier לDTX וEVR בנפרד ובשילוב. ריאגנטים / חומרים והציוד הדרושים להכנה ולאפיין מיצלות אלה מוצגות בטבלה 1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת Micelles הטעון פרט ורב-תרופה על ידי שיטת יציקת ממס

  1. לשקול את מ"ג DTX 1 מ"ג או EVR 1 או שני תרופות בכל 1 מ"ג למיצלות התרופה הכפולה (DDM).
  2. לשקול את 15 מ"ג של PEG 2000 - ב -PLA 1800 או PEG 4000 - ב -PLA 2200 טוב לאו בודד או DDM.
  3. ממיסים את התרופה / תרופות והפולימר ב 0.5 מיליליטר של אצטוניטריל ומקום בבקבוק עגול תחתון 5 מיליליטר.
  4. טופס סרט פולימר תרופה המופצת דק על ידי מתאדה תרופת הפתרון (ים) -polymer אצטוניטריל תחת לחץ מופחת באמצעות מאייד סיבובי. הגדר את המאייד הסיבובי 100 סל"ד, טמפרטורת מים באמבטיה של 40 o C ולחץ ואקום של 260 mbar דקות 5 ואחריו ירידה ל -100 mbar 3 דקות יותר.
  5. רעננות סרט סמים-פולימר עם 0.5 מיליליטר של מים ללא יונים ב 50 o C ועדינות לנער את הבקבוק כדי ליצור את מיצלות.
  6. סנן את התוצאהing פתרון micellar דרך מסנן ניילון 0.2 מיקרומטר כדי להסיר כל תרופה בלתי מומס או מזהמים לתוך צינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגות.

2. הערכה של טעינת סמים ויציבות בMicelles שימוש ההפוך-השלב High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC)

  1. ביצוע ניתוח RP-HPLC עם טור C8 equilibriated ב 40 מעלות צלזיוס במצב isocratic עם שלב נייד של אצטוניטריל / מים (62/38) המכיל 0.1% חומצה זרחתית ומתנול 1% בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה ו הזרקת נפח של 10 μl.
  2. לדלל מיצלות מוכנה טרי (סעיף 1) 1: 100 בשלב נייד לפני הניתוח על ידי RP-HPLC לקבוע טעינת תרופה ראשונית. מיצלות החנות חי בודדת וDDM בטמפרטורת חדר (C 25 O) במשך 48 שעות ולהכין 1 טרי: 100 דגימות מדוללות בשלב נייד כדי להעריך מחדש על ידי RP-HPLC ולקבוע סמים יציבות (ים) במיצלות מעל 24 שעות.
  3. צג פסגות DTX וEVR ב227 ו -279 בהתאמה ננומטרעם זמני שמירה של 1.7 ו -5.7 בהתאמה דקות. לבצע את כל המדידות בשלושה עותקים. נתוני הווה כטעינה ממוצע ± SD סמים.

3. הערכה של גודל החלקיקים micelle ידי דינמי פיזור אור (DLS)

  1. לדלל מיצלות מוכנה טרי (כמתואר בסעיף 1) במים ללא יונים ביחס של 1:20 להניב ריכוז פולימר סופי של 1.5 מ"ג / מיליליטר.
  2. מדוד את עוצמת הלייזר הוא Ne-(633 ננומטר) ב173 מעלות כדי לקבוע פיזור. לבצע את כל המדידות של 25 מעלות צלזיוס הבאות מראש איזון למשך 2 דקות.
  3. לבצע את כל המדידות בשלושה עותקים. נתוני הווה כגודל ± SD הממוצע Z-ממוצע יחד עם מדד polydispersity (PDI) של ההפצה.

4. הערכת במבחנה שחרור תרופה מMicelles הפרט וDDM

  1. הכן מיצלות וDDM בודדים כפי שתואר בסעיף 1. טען 2.5 מיליליטר של מיצלות לקלטת 3 מיליליטר דיאליזה עםלחתוך את משקל מולקולרי (MWCO) של 7,000 g / mol.
    הערה: זה MWCO נבחר כדי לאפשר את התרופה ללא תשלום (ים) יחד עם מולקולות פולימר בלתי-משויכות לפזר בחופשיות מתוך הקלטת ובכך להבטיח תנאי כיור.
  2. מניחים את הקלטות ב2.5 L של 10 מ"מ 7.4 חיץ pH פוספט (שהוכן על ידי דילול פתרון מ"מ מניית 200) ולשנות את החיץ כל 3 שעות כדי להבטיח תנאי כיור. לשמור על הטמפרטורה של המאגר על 37 מעלות צלזיוס לאורך כל תקופת הניסוי.
  3. ב 0, 0.5, 1, 2, 3, 6, 9, 12, 24, ו -48 שעות, לסגת 150 μl של הפתרון בקלטות ולהחליף עם 150 μl של חיץ טרי.
  4. לנתח דגימות באמצעות RP-HPLC כפי שנקבע בסעיף 2 כדי לקבוע את ריכוז התרופה. עקומה-להתאים את נתוני שחרור תרופה (ים) המבוססים על מודל דיפוזיה פשוט עם עמותת מעריכי שלב אחד באמצעות תוכנת stastitical.
  5. לחשב את הזמן הדרוש כדי להגיע ל -50% משחרור תרופה (t 1/2) של דוארתרופת אח במיצלות או DDM הפרטניים המבוסס על העקומה ההולמת. לבצע את כל המדידות ברביעייה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DTX בודד או מיצלות EVR וDTX וEVR DDM בPEG- ב -PLA מיצלות מנוסחות בהצלחה בשני PEG 4000 - ב -PLA 2,200 או PEG 2000 - ב -PLA 1,800 (איור 1).

DTX, EVR, וDDM הראו יציבות דומה בPEG 4000 - ב -PLA 2,200 או PEG 2000 - ב -PLA 1,800 מעל 48 שעות (איור 2). טעינה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש במיצלות פולימריות להעברת תרופות ממשיך להתרחב בשל הרבגוניות שלהן ויכולתן לספק תרופות הידרופוביות למצבי מחלה שונים. לכן, הטכניקות הדרושות להכנה ואפיון של ניסוחים אלה לפני השימוש בתרבית תאים או בבעלי חיים הן צעד ראשון קריטי לקביעת הזיווג הטוב ביותר בין התרופה לפולימר. PEG-b-PLA הם קופולימרים בלוק אמפיפיליים מצוינים למטרות אספקת תרופות. עם זאת, אורך הבלוק של החלקים ההידרופיליים וההידרופוביים ממלא תפקיד חשוב באנקפסולציה וביציבות של תרופות והם ספציפיים לתרופות שנבחרו לשלב. לכן, ייתכן שיהיה צורך במחקרים ראשו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק מתוכנית פרס המחקר של הפקולטה החדשה לרוקחות של AACP, מענק החוקר החדש של קרן המחקר הרפואי של אורגון, קרן הסטארט-אפ של אוניברסיטת אורגון, וקרן הסטארט-אפ של אוניברסיטת פסיפיק, בית הספר לרוקחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ניתן לציין את PEG2000-b-PLA1800Advanced Polymer Materials, Inc6-01- PLA/2000PLA MW בהזמנת
PEG4000-b-PLA2200Advanced Polymer Materials, Inc6-01- PLA/4000PLA MW ניתן לציין בהזמנת
DocetaxelLC LaboratoriesD-1000100 מ"ג
EverolimusLC LaboratoriesE-4040100 מ"ג
אצטוניטרילEMD/VWREM-AX0145-1HPLC כיתה; 4 ליטר
בקבוק תחתון עגול Glassco/VWR89426-4965 מ"ל
RV 10 מאיידים סיבוביים בקרהIKA Works8025001מאייד רוטו
Shimadzhu HPLC עם גלאי DADShimadzhuRP-HPLC
קלטת דיאליזה שקופית ליזר MWCO 7000Thermo Scientific, Inc663703 מ"ל
מאגר פוספט pH 7.4, 200 מ"מVWR100190-870500 מ"ל
Malvern NanoZSMalvern Instruments, בריטניהDLS
מסנן ניילוןAcrodisc / VWR28143-24213 מ"מ; 0.2 ומיקרו; M
חומצה זרחתית, NFSpectrum Chemical/VWR700000-626100 מ"ל
GraphPad Prismwww.graphpad.comAnalysis Software
Zorbax SB-C8 מחסנית ברזולוציה מהירה אג'ילנט טכנולוגיות866953-9064.6 ופעמים; 75 מ"מ, 3.5 ו-#956; מ

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yokoyama, M. Polymeric micelles as a new drug carrier system and their required considerations for clinical trials. Expert Opin Drug Deliv. 7, 145-158 (2010).
  2. Shin, H. C., Alani, A. W., Rao, D. A., Rockich, N. C., Kwon, G. S. Multi-drug loaded polymeric micelles for simultaneous delivery of poorly soluble anticancer drugs. J Control Release. 140, 294-300 (2009).
  3. Adams, M. L., Lavasanifar, A., Kwon, G. S. Amphiphilic block copolymers for drug delivery. J Pharm Sci. 92, 1343-1355 (2003).
  4. Oerlemans, C., et al. Polymeric micelles in anticancer therapy: targeting, imaging and triggered release. Pharm Res. 27, 2569-2589 (2010).
  5. Shin, H. C., et al. A 3-in-1 polymeric micelle nanocontainer for poorly water-soluble drugs. Mol Pharm. 8, 1257-1265 (2011).
  6. Hasenstein, J. R., et al. Antitumor activity of Triolimus: a novel multidrug-loaded micelle containing Paclitaxel Rapamycin, and 17-AAG. Mol Cancer Ther. 11, 2233-2242 (2012).
  7. Mazzaferro, S., et al. Bivalent sequential binding of docetaxel to methyl-beta-cyclodextrin. Int J Pharm. 416, 171-180 (2011).
  8. Iwase, Y., Maitani, Y. Preparation and in vivo evaluation of liposomal everolimus for lung carcinoma and thyroid carcinoma. Biol Pharm Bull. 35, 975-979 (2012).
  9. Mishra, G. P., Doddapaneni, B. S., Nguyen, D., Alani, A. W. Antiangiogenic effect of docetaxel and everolimus as individual and dual-drug-loaded micellar nanocarriers. Pharm Res. 31, 660-669 (2014).
  10. Xu, W., Ling, P., Zhang, T. Polymeric micelles, a promising drug delivery system to enhance bioavailability of poorly water-soluble drugs. J Drug Deliv. 2013, 340315(2013).
  11. Lavasanifar, A., Samuel, J., Kwon, G. S. Poly(ethylene oxide)-block-poly(L-amino acid) micelles for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 54, 169-190 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HPLCPEG b PLA

מאמרים קשורים