מאמר שיטה

Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

15.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53058

⸱

5 בספטמבר 2015

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Departments of Physiology and Neuroscience, New York University School of Medicine

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

אנו מדגימים את הייצור, הכיול והתכונות של שני סוגים של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות ליונים (דו-חבית וקונצנטרית) למדידת ריכוזי יונים ברקמת המוח. אלה משמשים לאחר מכן בהכנת פרוסת ההיפוקמפוס של העכבר כדי להראות שפעילות מעוררת משנה הן את ריכוזי האשלגן החוץ-תאי והן את ריכוזי הנתרן.

תקציר

פעילות חשמלית במוח מלווה בשטפי יונים משמעותיים על פני הממברנות, וכתוצאה מכך שינויים מורכבים בריכוז החוץ-תאי של כל היונים העיקריים. מכיוון ששינויים ביונים אלה נושאים השלכות תפקודיות משמעותיות, קביעתם הכמותית נדרשת לעתים קרובות כדי להבין את התפקוד והתפקוד הלקוי של רשתות עצביות בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. במחקר הנוכחי אנו מדגימים את הייצור והכיול של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות של יונים דו-קניות, שהוכחו ככלים מצוינים למדידות כאלה ברקמת המוח. יתר על כן, מתוארות גם מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות "קונצנטריות", אשר על סמך העיצוב השונה שלהן מציעות רזולוציה זמנית טובה בהרבה של שינויי יונים מהירים. לאחר מכן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש באלקטרודות אלה בהכנות פרוסות מוח חריפות של ההיפוקמפוס של העכבר. באמצעות מיקרו-אלקטרודות דו-קניות, סלקטיביות לאשלגן, מודגמים שינויים בריכוז האשלגן החוץ-תאי ([K+]o) בתגובה ליישום אקסוגני של אגוניסטים לקולטן גלוטמט או במהלך פעילות אפילפטית. יתר על כן, אנו מדגימים את מאפייני התגובה של אלקטרודות רגישות לנתרן, דו-חבית וקונצנטריות ומשווים את זיהוין של שינויים בריכוז הנתרן החוץ-תאי ([Na+]o) המתעוררים על ידי יישום אמבטיה או לחץ של תרופות. מדידות אלו מראות שבעוד שאמפליטודות התגובה דומות, המיקרו-אלקטרודות הנתרן הקונצנטריות מציגות יחס אות לרעש וזמן תגובה מעולים בהשוואה לעיצוב הכפול. בדרך כלל, ההליכים המודגמים יהיו ניתנים להעברה בקלות למדידה של מיני יונים אחרים, כולל pH או סידן, ויהיו ישימים גם לתכשירים אחרים.

מבוא

איתות חשמלי במוח מבוסס על שטף היונים על פני ממברנות הפלזמה. תנועות יונים עיקריות לתוך החלל החוץ-תאי וממנו מתווכות לא רק על ידי מעבר דרך תעלות יונים מגודרות מתח, אלא גם על ידי קולטנים יונוטרופיים פוסט-סינפטיים כמו גם מובילי יונים. פעילות עצבית מלווה אפוא בשינויים מורכבים בריכוז החוץ-תאי של כל היונים העיקריים 1. לדוגמה, הוכח כי זרם נתרן לתאי עצב במהלך פעילות מעוררת גורם לירידה בריכוז הנתרן החוץ-תאי ([Na+]o) 2. הדבר נכון גם לגבי ריכוז הסידן החוץ-תאי מכיוון שיוני סידן נכנסים במהירות למבנים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים 3. יחד עם זאת, אשלגן נע בכיוון ההפוך וזה מתווך עלייה בריכוז האשלגן החוץ-תאי ([K+]o) בטווח הנמוך של mM 4,5. פעילות סינפטית גורמת גם לשינויים ב-pH החוץ-תאי שמתמתנים בחלקם על ידי שטפי קרום גליה מקבילים המשנים את ה-pH התוך-תאי 6,7. לשינויים אלה הקשורים לפעילות בריכוזי יונים חוץ-תאיים יש השלכות תפקודיות משמעותיות. לדוגמה, אפילו עליות קטנות ב-[K+]o מפריעות לתאי עצב כמו גם לתאי גליה ובכך משנות את הריגוש העצבי, וקיימים מספר מנגנונים להסרת עודף אשלגן 8. כישלון של אלה עלול לגרום לפעילות אפילפטית של נוירונים או לתופעות כמו התפשטות דיכאון 1.

בגלל חשיבותם הקריטית, קביעה כמותית של ריכוזי יונים חוץ-תאיים היא לעתים קרובות הכרחית ונדרשת כדי להבין את התפקוד והתפקוד הלקוי של רשתות עצביות בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. במשך עשרות שנים, מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות של יונים דו-קניים הוכיחו את עצמן ככלים מצוינים למדידות כאלה ברקמת המוח 9. עבור יונים רבים, חיישנים ספציפיים מאוד עם תגובתיות צולבת נמוכה עבור יונים אחרים זמינים. בנוסף לאלקטרודות הקלאסיות הדו-קניות, הוצגו לאחרונה אלקטרודות קונצנטריות כביכול. האחרונים מספקים רזולוציית זמן מעולה, אך לוקחים קצת יותר זמן ומאמץ לבנות 10.

להלן נתאר את ההכנה והכיול של שני סוגים אלה של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות יונים. לאחר מכן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש באלקטרודות אלה בהכנות פרוסות מוח למדידת שינויים ב-[K+]o או [Na+]o המושרים על ידי פעילות מעוררת בעקבות פרדיגמות גירוי שונות כולל אמבטיה והפעלת לחץ של תרופות.

פרוטוקול

מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם ההנחיות מוסדיות של היינריך היה אוניברסיטת דיסלדורף, גרמניה, כמו גם את הקהילה האירופית הנחיית המועצה (86/609 / EEC). כל הניסויים לידיעה ואושרו על ידי משרד הרווחה בבעלי חיים במתקן הטיפול בבעלי חיים ושימוש בהיינריך היה אוניברסיטת דיסלדורף, גרמניה (מספר מעשה מוסדי: O52 / 05). בהתאם לחוק הגרמני צער בעלי החיים (Tierschutzgesetz, סעיפים 4 ו 7), אין אישור רשמי נוסף להסרת לאחר המוות של רקמת המוח היה צורך.

1. הכנת microelectrodes יון סלקטיבי קנה-זוגית

  1. הכן שתי נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה: אחד באורך של 7.5 סנטימטר וקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ שישמש לחבית היון-רגיש, ואחד באורך של 6.5 סנטימטר וקוטר חיצוני של 1.0 מ"מ למאוחר יותר חבית התייחסות.
  2. נקה את capil laries באצטון לשעה 12 ולאחר מכן לשטוף מספר פעמים עם שרירי בטן. אתנול ולתת להם להתייבש. כעת ניתן לאחסן אלקטרודות בייבוש.
  3. להשתמש בדבק דו רכיבים או פס קטן של נייר אלומיניום כדי לתקן ארוכה וקצרות נימים יחד בשני הקצוות. מחממים את כפולות הנימים בתנור על 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. זה מאיץ את תהליך הריפוי. אחסן את האלקטרודות עכשיו בייבוש.
  4. מרכז את כפולות הנימים לתוך חולץ אנכי עם צ'אק revolvable. מחממים את הסליל בעדינות עד שהזכוכית היא רכה מספיק כדי לאפשר סיבוב אופקי של צ'אק revolvable על ידי 180 מעלות. במהלך שלב זה, למנוע התארכות של הנימים עם סד תחת צ'אק.
  5. לאחר הקירור, להסיר את ההפסקה המכנית וליישם פרוטוקול חימום שני לשלוף את הנימים, וכתוצאה מכך שתי נימים חדות, כפולות קנה (איור 1). קוטר קצה כפולה נימים אחד צריך להיות קרוב ל1 מיקרומטר.
ve_content "> figure-protocol-1
איור 1. ארכיטקטורה של microelectrodes יון סלקטיבי. צילום () של microelectrode כפול קנה. להמחשה וראות טובה יותר, הנוזל בתוך חבית ההתייחסות היה כהה. צילום (B) של microelectrode קונצנטריים ואת האלקטרודה ההתייחסות המקבילה. קצה microelectrode קונצנטריים מוצג מוגדל בצד השמאל שלה. ב (א) ו- (ב), השטח הכבוש על ידי חיישן היון בטיפים של טפטפות הוא פוסט-צבע. בתחתית, הסדר הקצה של שני סוגי אלקטרודה מוצג באופן סכמטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. אם חולץ אנכי עם צ'אק revolvable אינו זמין, להכין יון-אין תמיכה בבחירה כפולה קנהmicroelectrode tive בחולץ אופקי באמצעות תטא זכוכית.
    1. לשם כך, למשוך תטא זכוכית (קוטר חיצוני של 1.5 מ"מ, אורך 7.5 סנטימטרים) ללגרום לשתי אלקטרודות עם שתי חביות כל אחד. מארק אחד מהם לשמש כחבית עיון בעתיד. Silanized אחרת דומה להליך המתואר להלן כדי לשמש כחבית יון סלקטיבי העתיד.
      הערה: בעוד הכנת אלקטרודות כפולות קנה תטא-זכוכית היא הרבה יותר קלה מאשר הכנת אלקטרודות כפולות קנה מעוות, הם נוטים יותר לפעולה צולבת בין שני החביות כקיר זכוכית המפרידה ביניהם הדק נוטה להיות נקבובי ב טיפ שיכולתם.
      הערה: מאחר קוקטייל החיישן (ראה להלן) הוא הידרופובי, המשטח הפנימי של חבית היון רגיש מאוחר יותר חייב להיות מוצג הידרופובי כמו גם על ידי תהליך הנקרא silanization. לשם כך, hexamethyldisilazane (HMDS) משמש (איור 2) כפי שמתוארת בשלב הבא.

איור 2
איור 2. Silanization של טפטפות. () Hexamethyldisilazane (HMDS) מגיב עם קבוצות Si-OH של משטח הזכוכית הפנימי והופך אותו הידרופובי. (ב) התמונה השמאלית מראה את כל יחידת silanization. בקבוק רחב-פה המכיל HMDS ממוקם על גבי צלחת חימום נקבעה על 40 מעלות צלזיוס. על גבי הבקבוק, בעל (PH) נושא את הנימים (Cap) הוא רכוב. תצלום הימין מראה הגדלה של בעל פיפטה (PH) נושא את הנימים (Cap). צד נוף סכמטי של בעלי מחוייט פיפטה (PH) לנימים כפולות קנה (משמאל) או קונצנטריים (מימין) (Cap) כרכוב על בקבוק רחב-פה (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

  1. רק לפני puאלקטרודות הממלא, למלא כ. 20 HMDS מיליליטר לבקבוק רחב-פה. שים לב: HMDS הוא לשימוש במנדף רק, אדים מסוכנים לבריאות! סגור את הבקבוק והניח אותו על צלחת חימום, מראש עד 40 מעלות צלזיוס. מחממים תנור, הניח מתחת למכסת המנוע וכן, עד 200 מעלות צלזיוס.
  2. מלא את חבית ההתייחסות עד קצהו במים מזוקקים כדי למנוע silanization במהלך ההליך הבא.
  3. שים נימים כפולות קנה עם הקצה עד על בעל (איור 2, 2C) מיוחד, מותאם אישית. הסוף הפתוח הבוטה חייב להגיע באופן חופשי דרך החלק התחתון של בעל (איור 2 ג, משמאל). לאחר מכן, הנח את בעל זה על בקבוק הפה הרחב המכיל HMDS מראש התחמם במשך 70 דקות.
    הערה: ודא שאדי HMDS יכולים לזרום דרך נימים באופן חופשי. במהלך תהליך silanization אחד, 20 מיליליטר של HMDS לא יתאדה לחלוטין, והבקבוק לכן יכול לשמש מספר רב של פעמים.
  4. AfterwarDS, להעביר את הנימים לעמדת מתכת ולתוך הכבשן שחומם מראש לשתי שעות. זה יתייבש שני החביות.
  5. לאחר silanization, לשמור על הנימים יבשות עד לשימוש. בעוד ההליך לשעבר דורש כ -3.5 שעות בסך הכל, יכולות עכשיו להיות מאוחסנות אלקטרודות בייבוש למשך מספר שבועות.
  6. ביום השימוש הניסיוני שלהם, להכין אלקטרודות יון סלקטיבי על ידי מילוי בקצה של חבית silanized עם 1-2 μl של חיישן יון סלקטיבי (איור 1 א). לmicroelectrodes אשלגן רגיש, להשתמש valinomycin הספק; ולmicroelectrodes נתרן-רגיש, להשתמש ETH 157 כמוביל.
  7. שים לב שחיישן יון סלקטיבי הוא די צמיג מה שהקשה על הקצה למלא כראוי.
  8. מלא את חבית ההתייחסות עם מי מלח HEPES שנאגר (ראה להלן).
    הערה: בעוד מלוח אחר, פשוט יותר ISO-האוסמוטי יכול לשמש גם, אנחנו מעדיפים להשתמש במלח בהרכב שהוא למעשה דומה למלוח זלוף (ACSF, ראה 3.6.), כי זה עלול לדלוף ולחדור לתוך הרקמה במהלך ניסויים. לכן, הוא גם חיוני כי מלוח זה אינו מכיל ריכוז גבוה של היונים שייקבע מACSF בשימוש.
  9. למילוי החיישן עם מי מלח המכיל ריכוז גבוה של היונים כדי להתגלות. כך, לגבות את החיישן עם 100 מ"מ NaCl מלוח (לmicroelectrodes נתרן-רגיש) או 100 מ"מ KCl (לmicroelectrodes אשלגן רגיש). הקפד לא להכניס בועות אוויר נוספות בהליך זה.
  10. אם silanization היה מוצלח והחיישן מלא כראוי, להתבונן משטח החיישן ליצור משטח קעור נראה בבירור נגד המילוי (איור 1 א). אחרת, החיישן אולי חזר בו מקיר הנימים והקצה לא יהיה מלא. אלקטרודות כזה לא תהיינה פונקציונליות.
  11. הכנס חוטי כסף כלור לשתי החביות (להיזהר שלא לגעת בסןסור) ולאטום כל חבית בשעוות שיניים (איור 1 א).

2. microelectrodes הכנת קונצנטריים יון סלקטיבי

  1. לחבית החיצונית, להשתמש נימי זכוכית דקה דופן עם נימה (קוטר חיצוני 2.0 מ"מ) ואורך של 7.5 סנטימטר. לחבית הפנימית, לקחת נימים-קירות דקים עם נימה, קוטר חיצוני של 1.2 מ"מ ובאורך של 10 סנטימטרים.
  2. נקה את הנימים באצטון במשך 12 שעות. ולאחר מכן לשטוף מספר פעמים עם שרירי בטן. אתנול ולתת להם להתייבש. כעת ניתן לאחסן אלקטרודות בייבוש.
  3. מלא כ. 20 HMDS מיליליטר לבקבוק רחב-פה. זהירות! HMDS הוא לשימוש במנדף רק, אדים מסוכנים לבריאות. סגור את הבקבוק והניח אותו על צלחת חימום, מראש עד 40 מעלות צלזיוס. מחממים תנור, הניח מתחת למכסת המנוע וכן, עד 200 מעלות צלזיוס.
  4. הכנס את נימי 2.0 מ"מ לחולץ אופקי ולמשוך אותו החוצה כדי לגרום נימים עם נרות קצרים וdiame קצהter של 4 ~ מיקרומטר (איור 1).
  5. שים נימי 2.0 מ"מ משכו החוצה עם הקצה עד על, בעל מיוחד מותאם אישית (איור 2, איור 2C) כך שהקצה הקהה ​​שלה נפתח לחלל של הבקבוק (איור 2 ג, מימין). לאחר מכן למקם את בעל זה על בקבוק הפה הרחב המכיל HMDS מראש התחמם במשך 70 דקות. ודא שאדי HMDS יכולים לזרום דרך כל הנימים.
  6. לאחר מכן, להעביר את הנימים לעמדת מתכת ולתוך הכבשן שחומם מראש לשתי שעות.
  7. לאחר silanization, לשמור על הנימים יבשות עד לשימוש. בעוד ההליך לשעבר דורש כ -3.5 שעות בסך הכל, עכשיו לאחסן את האלקטרודות בייבוש למשך מספר שבועות.
  8. רק לפני השימוש, למלא כמות קטנה של חיישן (0.2 μl) לנימי silanized (איור 1).
  9. כדי להכין את הנימים הפנימיות, הכנס נימים בקוטר קטנות לתוך חולץ ולשלוף לגרום לשתינימים עם נרות ארוכים וטיפים חדים (איור 1). מלא עם 100 מ"מ NaCl (microelectrodes נתרן-רגיש) או 100 מ"מ KCl מלוח (microelectrodes אשלגן רגיש).
  10. מניחים את החיישן מלא והנימים המלוחים מלא ישירות בקו אחד עם השני על פקק לבנות מותאם אישית עשוי מcoverslips. הכנס את הנימים הקטנות דרך קצרה לנימים גדולות יותר.
  11. תקן את הנימים על coverslip אחר באמצעות פלסטלינה, להעביר לבמה של מיקרוסקופ ולדמיין באמצעות הגדלה 100x. בעזרתו של מוט זכוכית כי הוא רכוב על micromanipulator ועל ידי סיבוב כונן הקנס של השלב של המיקרוסקופ, לקדם לאט הנימים החיצוניות על הנימים הפנימיות עד המרחק בין עצותיהם הוא בערך 5 מיקרומטר (איור 1).
  12. תקן את הקצה הפתוח של הנימים החיצוניות על הנימים הפנימיות באמצעות שעוות שיניים. לחלופין, חלים טיפה קטנה של cyanoacrylate (Crazy דבק) תוספותtead של שעווה.
    הערה: תוספת של טיפה קטנה של מים פלמר הדבק ולתקן את האלקטרודות במקום. הכנס חוט כסף כלור לתוך החבית הפנימית ולאטום אותו בשעוות שיניים (איור 1).
  13. כדי להכין את האלקטרודה ההתייחסות, לקחת נימים ארוכות 7.5 סנטימטר עם נימה וקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ ולשלוף עם חולץ אנכי. ודא שהטיפים הם יחסית ארוכים, אבל לא חדים מדי (קוטר ~ מיקרומטר 1 קצה).
  14. מחק את פיפטה העליונה, לפתוח את צ'אק הנמוך ולהרים את פיפטה הנמוכה בכ -5 מ"מ. סגור את צ'אק שוב ולהרים אותו עד קצה האלקטרודה הנמוך ממוקם כ -5 מ"מ מעל סליל החימום. מחממים את הסליל ולהשתמש במלקחיים כדי לכופף את הקצה ב -45 מעלות על לצד. פיפטה הנמוכה על 1-2 מ"מ. בנד שוב בכ -45 מעלות לכוון את הקצה אחורי במקביל לפיר המרכזי (איור 1). הליך זה הוא הכרחי כדי לאפשר המיקום הקרוב של הקצה של refereאלקטרודה NCE לאלקטרודה קונצנטריים.
  15. מלא את חבית ההתייחסות עם מי מלח HEPES שנאגר (ראה להלן), להכניס חוט כסף כלור ולאטום את החבית בשעוות שיניים (איור 1).

3. Salines

  1. הכן מלוח למילוי של אלקטרודות אשלגן רגיש (ראה 1.15.) המורכבת של 100 מ"מ KCl. מלח למילוי של אלקטרודות רגישות הנתרן מורכב של 100 מ"מ NaCl.
  2. הכן מלוח למילוי חביות התייחסות (. נאגר מלוחה HEPES, ראה 1.16) מורכב מ( מ"מ): 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgSO 4, 1.25 לאא 2 PO 4, ו -25 HEPES, טיטרציה עם NaOH לגרום pH של 7.4.
  3. הכן מלוח לכיול של אלקטרודות אשלגן רגיש מורכבות של 25 מ"מ HEPES וכן סך של 150 מ"מ NaCl וKCl, pH 7.4 מותאם לעם NMDG-OH (N-methyl-D-glucamine). כאן, כיול בוצע עם Salines המכיל 1, 2, 4 או 10 מ"מKCl; ACSF הכיל 2.5 מ"מ KCl (איור 5).
  4. הכן מלוח לכיול של אלקטרודות נתרן רגיש כדלקמן; (מ"מ) 25 HEPES, 3 KCl, כולל של 160 NaCl וNMDG-Cl, pH 7.4 מותאמות לעם NMDG-OH. לבצע כיול עם מי מלח המכיל (במ"מ) 70, 100, 130 או 160 NaCl; ACSF הכיל 152 NaCl (איור 6).
  5. לקביעת תגובה הצולבת של החיישן עם יונים אחרים, למשל., PH, להכין Salines נוסף כיול עם ריכוזי יון קבועים, אבל pH שונה.
    הערה: בעוד הליך זה לא הודגם במחקר הנוכחי, בבקשה לעיין בעבודה קודמת להתייחס לנושא זה (למשל 11,12).
  6. הכן פרוסות רקמת המוח חריפות מלוחים מורכב (מ"מ): 125 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl 2, 6 MgCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 26 NaHCO 3, ו -20 גלוקוז, מבעבע עם 95% O 2 ו -5 % CO 2, וכתוצאה מכך ה- pH של7.4.
  7. לבצע ניסויים בפרוסות מוח בנוזל המוח והשדרה מלאכותי (ACSF) מורכב מ( מ"מ): 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 26 NaHCO 3, ו -20 גלוקוז, מבעבע עם 95 % O 2 וCO2 5%, וכתוצאה מכך ה- pH של 7.4.
  8. לגירוי של תאי עצב ותאי גליה, להכין פתרונות המכילים מונוסודיום 0.2, 0.3, 0.4 או 0.5 מ"מ או L-aspartate 10 מ"מ מומס בACSF. ליישום לחץ, לפזר 10 גלוטמט מ"מ מלוח HEPES שנאגר.
  9. הכן פיפטה בקשה ליישום לחץ. הכנס נימי זכוכית דקה דופן עם נימה (קוטר חיצוני 2.0 מ"מ) ואורך של 7.5 סנטימטר לחולץ אופקי ולשלוף לגרום לקוטר קצה ~ 1 מיקרומטר.
  10. לזירוז פעילות epileptiform, להכין ACSF ללא מגנזיום המכיל 10 מיקרומטר methiodide bicuculline.
  11. כדי לעכב את הדור של פוטנציאל פעולה, להכין solut מניית 10 מ"מיון של tetrodotoxin (TTX) במים מזוקקים. במהלך ניסויים, TTX מתווסף ישירות לACSF להביא לריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר.
  12. כדי למנוע הפעלה של AMPA-קולטנים, להכין פתרון מניית 50 מ"מ של cyano-nitroquinoxaline-דיונה (CNQX) בsulfoxide דימתיל (DMSO). במהלך ניסויים, זה מתווסף ישירות לACSF להביא לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
  13. כדי לחסום הפעלה של NMDA-קולטנים, להכין פתרון מניית 50 מ"מ של האמין phosphonopentanoate (APV) ב -70 מ"מ NaHCO 3. במהלך ניסויים, זה מתווסף ישירות לACSF להביא לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.

4. כיול של microelectrodes יון סלקטיבי

  1. לכייל microelectrode יון סלקטיבי ישירות לפני ואחרי כל ניסוי.
  2. צרף אלקטרודות לmicromanipulators ולהכניס אותם לתוך תא ניסוי-perfused ACSF, תחת מיקרוסקופ סטריאו (איור 3 ז>, 4). מניחים את האלקטרודה התייחסות לטרום-קאמרי (איור 4 א, ​​ב). מתג על זלוף אמבטיה, להבטיח שהזרימה היא כ 2 מיליליטר / דקה.

figure-protocol-3
איור 3. חלל העבודה הניסויי. אסדת ההקלטה מורכבת משולחן-דיכא רטט ביצוע שלב x / y-translational עם האמבטיה הניסיונית, micromanipulators, וסטראו עם אופטיקה באיכות גבוהה. מיקרוסקופ סטריאו מצויד גם עם מצלמת CCD למטרות תיעוד. בנוסף, משמש מכשיר יישום לחץ ליישום תרופת מוקדי. אלקטרודות ההקלטה הם מצמידים דרך שלב הראש למגבר ההפרש. נתונים הדיגיטליים (ממיר D /) נרשמו עם מחשב. זלוף האמבטיה הבין על ידי משאבת מייקר peristaltic (לא מוצג).> אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הפעל את ממיר A / D, מגבר ההפרש, והמחשב, ולהפעיל את תוכנת הקלטה (איור 3, 4). בגלל התנגדות של חביות היון רגיש היא גבוהה מאוד (10-20 GΩ; ראה להלן), להשתמש במגבר אלקטרומטר מיוחד עם עכבת כניסה גבוהה (R = 10 בTΩ) ונוכחי הטיה קטנה (אני הטיה = 50 FA - 1 הרשות הפלסטינית).

figure-protocol-4
איור 4. אלקטרוני ועיצוב המרחבי של הניסוי להגדיר. (א) להציג סכמטי של הסדר ההקלטה. הטיפים של microelectrode קנה כפול (כחול) וmicroelectrode קונצנטריים (אדום) מסודרים באמבטיה ניסיונית מלאות מלוח. האלקטרודה התייחסות אמבטיה מצויינים סכמטי. אין הסופי TiAl זוהה על ידי חביות יון סלקטיבי (V 1) מורכב מהשדה החשמלי (נ"צ V) פוטנציאלית ופוטנציאל יון (יון V), ואילו חביות ההתייחסות (V 2) רק לזהות נ"צ V. כדי לבודד יון V, נ"צ V יורדת מV 1 באמצעות מגבר ההפרש (DA). טופוגרפיה (ב) לשלב הניסיוני עם microelectrode קונצנטריים במקום. מרכז הבמה הניסיונית מורכב מהאמבטיה הניסיונית המכילה את הכנת פרוסה. כדי להאריק את האמבטיה, את האלקטרודה האמבטיה ההתייחסות היא שקועה בטרום-הקאמרית שגם מארח את כניסת זלוף. השלב עצמו מעוגן על ידי מחבר הארקה נפרדת. Microelectrode קונצנטריים ואלקטרודה ההתייחסות שלה, נעשים על ידי בעלי פיפטה נפרדים מונעים על ידי micromanipulators. Microelectrode ואלקטרודה התייחסותם באופן אלקטרוני מצמידים את שלב הראש של המגבר."Target =" _ e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. חבר חוטי כסף כלור לכניסות המתאימות של שלב ראש מגבר ההפרש (איור 4). לקבוע התנגדויות אלקטרודה. ודא שההתנגדות של חבית ההתייחסות היא בין 30-100 MΩ וההתנגדות של חבית היון רגיש היא בין 10-20 GΩ.
  2. התאם אותות מתח לאפס ולהתחיל בהקלטה.
  3. שים לב כי הפוטנציאל זוהה על ידי חביות יון סלקטיבי (V 1) מורכבת מ( נ"צ V) פוטנציאל שדה החשמלי ואת פוטנציאל יון (יון V), ואילו חביות ההתייחסות (V 2) רק לזהות נ"צ V. כדי לבודד יון V, נ"צ V יורדת מV 1 באמצעות מגבר ההפרש (איור 4 א) (DA).
  4. לאחר קבלת בסיס יציב,מתג לSalines כיול המכיל ריכוזים מוגדרים של היון להימדד.
    הערה: איור 5 א מציג את הכיול של microelectrode כפול קנה אשלגן רגיש. באיור 6 א, הכיול של שניהם כמו גם microelectrode -sensitive Na + קונצנטריים מוצג כפול קנה. למרות שאנו לא מתארים את ההליך כאן, שימו לב כי הפרעות אפשריות עם יונים אחרים חייבות להיבדק לפני שימוש ionophore ספציפי (ראה גם 3.4.).

figure-protocol-5
איור 5. כיול של microelectrodes הכפולה קנה אשלגן סלקטיבי. (א) שינוי במתח של חבית התייחסות (נ"צ V) ושל K + -potential (V K +) בתגובה לשינויים בK האמבטיה + ריכוז ( [K +] ב) כפי שצוין. חצי (ב)עלילת -logarithmic של [K +] ב לעומת V K +. עלילה ליניארית של הנתונים מעלה מדרון של כ -56 mV. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (רוחב 20). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. לקבוע את תגובת המתח של חבית יון סלקטיבי בתגובה לשינוי ידוע בריכוז יון. נתונים עלילה בעלילה לוגריתמים אחת (איור 5, 6 ב) ולקבוע את השיפוע. חיישן אידיאלי כדלקמן יחסים מתוארים על ידי משוואת נרנסט (ראה לדוגמא 13):

figure-protocol-6
V: נמדד פוטנציאל האלקטרודה;
V 0: פוטנציאל אלקטרודה סטנדרטי, למשל עבור AgCl-חוט בטמפרטורה של 298.15 K ולחץ חלקי של 101.325 kPa (מוחלט)
R: קבוע גז (8.314 ג 'אול / תואר קלווין / שומה)
T: טמפרטורה מוחלטת (בקלווין)
z: תשלום על היון (+ 1 לאשלגן ונתרן)
F: קבוע פאראדיי (96.500 התליות)
ג ': ריכוז יון תאי
ג '': ריכוז יון תאיים

הם למטרות מעשיות, והלוגריתם הטבעי יומרו לים מדרון נרנסט אשר לאחר מכן תקף ליון וטמפרטורת נתונה:

figure-protocol-7
הערה: לאלקטרודות אשלגן ונתרן, תגובת מתח אידיאלית של החיישן ובכך מציגה שיפוע ליניארי של כ -58 mV ב RT. סטייה חלק מזה יכול להיות מקובל (איור 5, 6 ב). זה חיוני, עם זאת, כי מאפייני תגובה של האלקטרודה נתון לא השתנו באופן משמעותי (על ידי יותר מ -10%, ראה בהמשך) לפני ואחרי ניסוי.

figure-protocol-8
כיול איור 6. של microelectrodes נתרן סלקטיבי והשוואה של עם אלקטרודות קונצנטריים כפול קנה () למעלה עקבות:. שינוי במתח של חביות ההתייחסות (נ"צ V) של האלקטרודה כפולה קנה (זכר מנוקד שחור) ו אלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) בתגובה לשינויים באמבטיה ריכוז Na + ([Na +] ב) כפי שצוינה. שים לב שתגובות המתח של שני אלקטרודות הן כמעט זהות. עקבות תחתונה: שינויים במתח של Na -potential + (V Na +) של האלקטרודה כפולה קנה (זכר שחור) ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) בתגובה לשינויים ב[ Na +] ב. (ב) מגרשים חצי-לוגריתמים של [Na +] ב לעומת V Na + של שני אלקטרודות. מגרשים ליניארי של נתונים לחשוף שיפוע של כ -48 mV עבור שני אלקטרודות.תגובה (C) של V Na + של (זכר שחור) כפול קנה ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) לשינוי מהיר ב[ Na +] ב 152 מ"מ מל -70 מ"מ. שים לב שזמן התגובה של האלקטרודה קונצנטריים הוא באופן משמעותי מהר יותר. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (רוחב 20). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. קבע את זמן התגובה של אלקטרודות, אשר תלוי בקוטר הקצה, בצורה של הקצה, כמו גם בעובי של שלב החיישן בקצה האלקטרודה.
    הערה: microelectrodes נתרן-רגיש בניסוי זה להגדיר והעסקת שינוי מהיר בין Salines שונה זלוף (חילופי הושלמו בקצה של האלקטרודה בטווח של 500 אלפיות שני), כפול הקנה הגיעה פוטנציאלית יציב בתוך 9.7 שניות ± 4.5 כאשרמיתוג מ152 מ"מ עד 70 מ"מ [Na +] (n = 6). בתוך אותה ההגדרה, microelectrodes נתרן רגישה קונצנטריים הגיעה פוטנציאלית יציב בתוך רק 0.8 ± 0.3 שניות (n = 6) (איור 6 ג). זה מדגיש את הרזולוציה הזמן מעולה של קונצנטריים בהשוואה לmicroelectrodes הכפולה קנה.

5. Dissection של רקמות

  1. לדור של פרוסות חריפות, לטשטש עכברי ימים לאחר לידה 16-20 עם CO 2 ובמהירות ערופה (בעקבות ההמלצה של הנציבות האירופיות שפורסם ב: המתת חסד של חיות ניסוי, לוקסמבורג: משרד לפרסומים רשמיים של הקהילות האירופיות, 1997; ISBN 92-827-9694-9).
  2. הכן פרוסות בהיפוקמפוס רקמות (מיקרומטר עובי 250), בעקבות הליך סטנדרטי (ראה לדוגמא 14).

6. פרוצדורות

  1. העבר את הפרוסה לתא הניסוי ולתקן את זה עםרשת.
  2. מנמיכים את microelectrode יון סלקטיבי המכויל על פני השטח הפרוסה ולדקור radiatum השכבה של אזור CA1 עד לעומק של כ -50 מיקרומטר עם אלקטרודה.
    הערה: לגעת במשטח פרוסה עם microelectrode מובילה לתנודות אופייניות בחבית היון-רגיש. יתר על כן, נזק לתאים במהלך impalement של הרקמה גורם תנודות גם כן. חכה עד תחילת המחקר התייצבה.
  3. ליישום לחץ של אגוניסטים משדר, למלא פיפטה יישום עם המתחם (גלוטמט 0.5 מ"מ לדוגמא). צרף את פיפטה micromanipulator ובני זוג אותם למכשיר יישום לחץ.
  4. פיפטה הנמוכה היישום לתוך הרקמה ולמקם אותו בזהירות בקרבת קצה microelectrode יון סלקטיבי (~ 20-40 מיקרומטר). התחל יישום לחץ (למשל 10 שניות, 40 mbar) ושינויי מתח שיא בפיקוח על ידי microelectrode יון סלקטיבי.
  5. ליישום אמבטיה של תרופות, SWגירוד בין Salines זלוף שונה עבור משך מוגדר.
  6. לסיים את הניסוי, לסגת בזהירות microelectrode יון סלקטיבי מהרקמות ולהקליט להיסחף כל בפוטנציאלים מאפס הערך המקורי שאולי התרחש בתקופות הקלטה ממושכות.
  7. הסר הכנת פרוסה מהאמבטיה ולבצע כיול שני של microelectrode יון סלקטיבי.
    הערה: זה הכרחי, כי קצה האלקטרודה יכול לקבל סמיך במהלך תנועתו דרך הרקמה. לכן, זה חיוני כדי להבטיח כי האלקטרודה עדיין מגיבה כראוי לשינויים בריכוזי יון. יש לדחות ניסויים אם התגובה של אלקטרודה לשינוי של פי עשרה בריכוז יון ירד ביותר מ -10%. אלקטרודות היטב עובדות יכולות בעיקרון להיות שימוש חוזרות בכמה ניסויים. זה נכון במיוחד עבור אלקטרודות קונצנטריים, שאפילו יכול להימשך מספר ימים. זה חיוני, עם זאת, כי נהלי כיול מחדשpeated לפני ואחרי כל ניסוי בודד כדי להבטיח התפקוד התקין של האלקטרודות.

ניתוח 7. נתונים

  1. כדי להמיר את תגובת המתח של האלקטרודה יון סלקטיבי לשינויים בריכוז יון תאי, להמיר ראשון משוואה 2 כדי לקבוע את השינוי ביון ΔV הפוטנציאל (mV) כדלקמן (הפגין כאן לK + אלקטרודות -sensitive, הליך אנלוגי חל על Na + אלקטרודות -sensitive):

figure-protocol-9

K + V: שינויים בפוטנציאל של חבית valinomycin (mV)

S: מדרון נרנסט

K + B]: ריכוז בסיס של אשלגן (במקרה שלנו 2.5 מ"מ K +)

K +] o: שינויים ב[ K +] o במהלך ניסוי

  1. לחשב את ממוצע אריתמטי של המדרונות הנגזרים ממגרשי לוגריתמים אחת oו הכיול לפני ואחרי הניסוי (ראה איור 5, 6B, ראה נקודה 4.8) כדי לאחזר "S".
  2. כדי לחשב שינויים [K +] o (Δ [K +] o, במ"מ), לארגן מחדש את המשוואה 3 ל:

figure-protocol-10

תוצאות

כדי לפקח [K +] o ושינויים החלימו בי בתגובה לפעילות מעוררת, microelectrode כפול קנה אשלגן סלקטיבי היה מוכנסים לתוך radiatum השכבה של אזור CA1. כמה דקות אחרי impalement, חבית יון סלקטיבי של האלקטרודה הגיעה בסיס יציב (איור 7 א), המקביל ל[ K +] o של כ -2.8 מ"מ, ערך קרוב ל[ K +] של ACSF משמש ( 2.5 מ"מ). יישום אמבט של גלוטמט 0.5 מ"מ ל- 10 שניות גרם לעלייה הפיכה ב[ K +] o בכ -4 מ"מ, ואחריו החטאה מתחת בסיס בסך של ~ 0.7 מ"מ (איור 7 א). הורדת ריכוז הגלוטמט 0.4, 0.3, 0.2 מ"מ וגרם לירידה מקבילה במשרעת של שתי העלייה החולפת וההחטאה ב[ K +] o (איור 7 א).

OAD / 53,058 / 53058fig7.jpg "/>
איור 7. ארעיים אשלגן תאי בתגובה לפעילות מעוררת. () [K +] o ארעיים, הכולל עלייה ואחרי החטאה מתחת תחילת המחקר, הנגרמת על ידי יישום אמבטיה של ריכוזים שונים של גלוטמט במשך 10 שניות כפי שצוין. השפעה (ב) לזלוף עם חוסמי הקולטן גלוטמט (CNQX, 100 מיקרומטר; APV, 100 מיקרומטר) וtetrodotoxin (TTX; 0.5 מיקרומטר) על [K +] o ארעיים הנגרם על ידי יישום אמבטיה של גלוטמט 0.5 מ"מ ל- 10 שניות. [K +] ספונטנית (C) o ארעיים בנוכחות 0Mg 2 + / BIC. ניסויים הראו בAC בוצעו באמצעות אלקטרודות כפולות קנה. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (20 מ 'רוחב). אנא CLאיכס כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניסויים קודמים הראו כי [K +] o אותות מושרה גלוטמט כאלה לא שינו באופן משמעותי במהלך היישום של TTX, ולכן הם עצמאיים במידה רבה על פתיחת תעלות נתרן מתח מגודרת ופעולה עצבית דור פוטנציאל 15,16. כדי לחקור את המנגנונים שנצפו [K +] o השינויים בתגובה לגלוטמט, אנחנו מוחלים חוסמי הקולטן גלוטמט, כלומר CNQX (100 מיקרומטר; חוסם קולטני AMPA של) וAPV (100 מיקרומטר; חוסם של קולטני NMDA) בנוכחות TTX (0.5 מיקרומטר). על זלוף אמבטיה עם חוסמי אלה, הנגרם על-גלוטמט [K +] o שינויים היו כמעט בוטל, המאשר את תלותם בפתיחת ערוצי קולט גלוטמט ionotropic כפי שדווח בעבר (למשל 17; איור 7).

כדי להדגים t נוסףהוא רלוונטי של עירור glutamatergic לדור של תאית [K +] אותות, פרוסות היו perfused עם ההלכה Mg 2 + מלח -חינם המכיל 10 מיקרומטר methiodide bicuculline (0Mg 2 + / BIC). זה מקל על Mg -block מתח תלוי 2 + של קולטני NMDA ומרטיב עיכוב על ידי חסימה קולטני GABA, גורם פעילות epileptiform חוזרת ספונטנית ברשת (למשל 18,19). כצפוי 20 [K +], ספונטנית, חוזרת ונשנית o ארעיים, בסך של כ -1.5 מ"מ אותר ב0Mg 2 + / מלוח BIC (איור 7 ג). בין התגובות הללו, [K +] קטנה o ארעיים עם משרעת ממוצעת של כ 0.2 מ"מ התרחש (איור 7 ג).

בסט שני של ניסויים, שנהגנו [Na +] microelectrodes -sensitive לקבוע [Na +] o שינויים עוררו על ידי יישום שלאגוניסטים גלוטמט. הנה, אנחנו גם בהשוואה מאפייני התגובה של microelectrodes הכפולה קנה וקונצנטריים העסקת שתי פרדיגמות יישום שונות. [Na +] microelectrodes -sensitive הוצבו לradiatum השכבה בעומק של כ -50 מיקרומטר. לאחר תחילת המחקר יציבה הושגה, L-aspartate אגוניסט גלוטמט יושם לזלוף אמבטיה (10 מ"מ, 120 שניות, זלוף אמבטיה על 2.5 מיליליטר / דקה). כפי שנצפה קודם לכן 21, יישום של aspartate גרם לירידה איטית ב[ Na +] o בכ -15 מ"מ, שנמשך כ -5 דקות ולאחר מכן החל להתאושש חזרה לנקודת התחלה (8A איור). יש לציין, בזמן שאמפליטודות וקינטיקה השיא של האותות [Na +] o נקבעו על ידי שני אלקטרודות היו כמעט זהות בתנאים אלה, אלקטרודות קונצנטריים הציגו בסיס יציב יותר ורמה נמוכה יותר רעש (8 א 'איור).

כדי לבדוק את r esponse מאפיינים של אלקטרודות השונות תחת הפרדיגמה יישום מהירה יותר, אנחנו לחץ להחיל גלוטמט דרך טפטפת זכוכית עדינה ממוקם בradiatum השכבה במרחק של 20-40 מיקרומטר מקצה microelectrode יון סלקטיבי. כצפוי 21, יישום של גלוטמט (10 מ"מ) עבור 200 אלפיות גרם לירידה בo [Na +] (איור 8 ב). אמפליטודות השיא של [Na +] o הירידה היו באותו הטווח לשני הסוגים של אלקטרודות (כפול-קנה: 4.5-13.5 מ"מ, n = 14; קונצנטריים: 2.0-19.1 מ"מ, n = 15). עם זאת, בניגוד לתוצאות שהושגו עם זלוף האיטי אמבטיה (ראה לעיל), לא רק את יחס אות לרעש, אלא גם במהלך האותות [Na +] o זוהו על ידי שני סוגים של אלקטרודות הזמן שונה משמעותי. הזמן הממוצע לשיא היה 3.5 שניות לקנה כפולות והשניות רק 1.3 לmicroelectrodes קונצנטריים.

עמיתי ve_content "> לכן, תוצאות אלו מראות ולאשר את קינטיקה התגובה מהירה יותר של microelectrodes הכפולה קנה קונצנטריים לעומת Na + -selective, (ראה איור 6 ג ו8B), כפי שגם ציין לCa 2 + ו- pH סלקטיבי 10 . בניגוד למחקר לשעבר, שבו גירוי הסינפטי קצר פרץ בוצע לעורר ארעיים יון מהיר synaptically-induced, היה רק ​​נטייה, אבל אין הבדל משמעותי באמפליטודות שיא ממוצעת בין האלקטרודות קונצנטריים וקנה כפולים עם היישום שלנו הפרדיגמה. זה היה כנראה בשל העובדה שהמרחק של פיפטה היישום מקצה microelectrode יון סלקטיבי מגוון על ידי גורם משני (20-40 מיקרומטר), וכתוצאה מכך, שריכוז הגלוטמט המקסימאלי באזור היעד לא היה אותו הדבר בניסויים שונים, משבש כל הבדל קיימים בשיא.

(א) למעלה עקבות: שינוי בוולטהGE של חביות ההתייחסות (נ"צ V) של האלקטרודה כפולה קנה (זכר מנוקד שחור) ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) בתגובה לשינויים באמבטיה ריכוז Na + ([Na +] ב) כפי שצוין. שים לב שתגובות המתח של שני אלקטרודות הן כמעט זהות. עקבות תחתונה: שינויים במתח של Na -potential + (V Na +) של האלקטרודה כפולה קנה (זכר שחור) ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) בתגובה לשינויים ב[ Na +] ב. (ב) מגרשים חצי-לוגריתמים של [Na +] ב לעומת V Na + של שני אלקטרודות. מגרשים ליניארי של נתונים לחשוף שיפוע של כ -48 mV עבור שני אלקטרודות. תגובה (C) של V Na + של (זכר שחור) כפול קנה ואלקטרודה קונצנטריים (זכר אפור) לשינוי מהיר ב[ Na +] ב 152 מ"מ מל -70 מ"מ. שים לב שזמן התגובה של האלקטרודה קונצנטריים הוא משמעותי FASter. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (רוחב 20).

figure-results-1
איור 8: ארעיים נתרן תאי כפי שזוהה על ידי אלקטרודות כפולות קנה וקונצנטריים.
(א) שינויי חלוף נ"צ V ו[ Na +] o הנגרם על ידי זלוף אמבטיה עם 10 aspartate מ"מ עבור 120 שניות כפי שצוין על ידי בר. העקבות העליונות מראות הקלטה שבוצעה עם אלקטרודה כפולה קנה, העקבות הנמוכות נרשמו באמצעות אלקטרודה קונצנטריים. (ב) שינויי חלוף נ"צ V ו[ Na +] o הנגרמת על ידי יישום לחץ מקומי עם גלוטמט 10 מ"מ 0.2 שניות כפי שצוין על ידי ראש החץ. העקבות העליונות מראות הקלטה שבוצעה עם אלקטרודה כפולה קנה, העקבות הנמוכות נרשמו באמצעות אלקטרודה קונצנטריים.קווים אדומים מנוקדים מייצגים המתאימים ליניארית של התקופה שבין תחילת האות למקסימום שלה. שים לב שזמן התגובה של האלקטרודה קונצנטריים הוא באופן משמעותי מהר יותר בתנאי זה. להמחשה, עקבות הוחלקו עם מסנן Sawitzky-Golay (רוחב 20). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

נוזל מבוסס ספק, אלקטרודות יון סלקטיבי כבר מועסקות בהצלחה במשך עשרות שנים וליונים רבים, חיישנים מאוד ספציפיים זמינים 22-26. כאשר נעשה שימוש במרחב תאי (ECS) של הכנות מוח חוליות, יש לזכור, עם זאת, כי מדובר בטכניקה די פולשנית: בעוד הרוחב של ECS הוא רק סביב 20-50 ננומטר, בקוטר של יון סלקטיבי microelectrodes היא כ 1 מיקרומטר (אלקטרודות הכפולה קנה) או (אלקטרודות קונצנטריים) גדולה יותר. הטיפים של microelectrodes יון סלקטיבי יהיו כך לא רק לפגוע ברקמות במהלך impalement של הרקמה, אלא גם להגדיל את ECS, העדפת הערכה נמוכה מדי של העוברים יון. למרות חסרונות אלה, ארעיים יון תאי בתגובה לפעילות עצבית בקנה אחד להפליא בין מעבדות שונות 7,8, המעידות על אמינותה של שיטה זו.

ביצועים וההתאמה של אלקטרודות יון סלקטיביתלוי ברגישות שלהם וסלקטיביות, אשר מוגדרת על ידי קוקטייל החיישן ("ionophore קרום הנוזלי") משמש. קוקטיילים חיישן מכילים מולקולה מיוחדת ספק, למשל valinomycin לmicroelectrodes -selective K + אשר מציגה סלקטיביות גבוהה לאשלגן 27. עם זאת, תגובה צולבת עם יונים אחרים יכולה להתרחש וחייבת להיבדק. Valinomycin מציג תגובתיות צולבת משמעותית עבור אמוניום, אשר יש לשקול בעת פירוש תוצאות (למשל 11,12). יתר על כן, בגלל המתח-התגובה של יונופורים כדלקמן התנהגות Nernstian (משוואה השווה 1), היחס וסף גילוי אות לרעש תלוי בריכוז של היון להימדד. וכך, בעוד [K +] הקטנה o ארעיים לעורר גדולים שינויי מתח נגד הבסיס הנמוך [K +] o, קטנה [Na +] o עוברת בו הרבה יותר קשה לזהות נגד הייo תחילת המחקר GH [Na +] (איור השווה 5 ו -6).

הביצועים של אלקטרודות יון סלקטיבי נקבע גם על ידי ההחלטה הזמנית, הנשלטת במידה רבה על ידי קבוע זמן החשמל שלה. האחרון הוא בעיקר שנקבע על ידי ההתנגדות הצירית של החיישן, ועל ידי הקיבול המופץ לאורכו של פיפטה, בין הפתרונות הפנימיים שלה והנוזל החיצוני. בתצורה הכפולה קנה, ההתנגדות היא גבוהה, בשל הטור של חיישן יון backfilled הארוך. לדיאלקטרי נתון בידוד (בזכוכית בורוסיליקט מקרה זה), הקיבול נשלט על ידי עובי דיאלקטרי. באלקטרודות כפולות קנה, רוחב דיאלקטרי מסתכם בקיר הזכוכית של פיפטה. כזכוכית מדללת קרובה לקצה, רוחב דיאלקטרי נופל, ועליות הקיבול. גורמים אלה משלבים לייצר אלקטרודות עם זמני תגובה שנעה בין כמה מאה לכמה אלפיות השניהשניות, כגורמים אלה הם מגוונים.

יתרון עיקרי של העיצוב קונצנטריים הוא ששתי ההתנגדות הצירית והקיבול לאמבטיה הינן הצטמצמו מאוד. Shunts קונצנטריים פיפטה ביותר של ההתנגדות של מחליף היונים backfilled, ומשאיר רק שריד בכמה מיקרומטרים האחרונים לפני טיפ. בנוסף, פתרון המילוי בתוך פיפטה קונצנטריים הוא הרחיק פיזי מהאמבטיה, מופרד על ידי העובי של שני קירות זכוכית, מקטין מאוד את הקיבול. כפי שניתן לראות בתחילת 10, את ההשפעה המשולבת של התנגדות וקיבול מופחתים הוא שיפור בהחלטה זמנית של שני סדרי הגודל. במקרה של Ca 2 + ו- pH microelectrodes קונצנטריים, זמני תגובה של 90% היו נמוך כמו 10-20 msec 10. יתרון נלווה של העיצוב קונצנטריים הוא הרמה נמוכה יותר רעש (איור השווה 8). בשל ההתנגדות המופחתת במידה הניכרת, ארעיים מתח מכל Ambienרעש לא הם מזערי. יתר על כן, התאוששות מארעית כזה היא מהיר, בגלל קבוע הזמן המהיר. חפצים כאלה הם אפוא קטנים ומהירים, ויש להם השפעה פחות מפריעה בהקלטות פיסיולוגיות (איור השווה 8).

ישנם גם חסרונות של הטכניקה קונצנטריים. ראשית, הרכבתם היא מורכבת יותר, וזמן רב. חסרון שני הוא את הצורך בהצבה microelectrode התייחסות נפרד עם הקצה שלה, ובכך גם שימוש בmicromanipulator נפרד או מניפולטור הכפול מיוחד. לבסוף, ניתן להרחיב microelectrodes הכפולה קנה לעיצוב קנה משולש, המאפשר זיהוי של שני מיני יון שונים באותו הזמן 28, הדבר שאינו אפשרי עבור אלקטרודות קונצנטריים.

מכשולים הנפוצים ביותר

silanization לא יעיל.

הצעד החשוב ביותר, ומכשול עיקרי בייצור של כל נוזל-sensאו microelectrode יון סלקטיבי מבוסס הוא הליך silanization. כאשר האלקטרודות אינן מגיבות לשינויים בריכוז יון ספציפי, או להגיב בתגובה תת-Nernstian (כלומר, גם פחות מ 58 mV להבדל ריכוז של פי עשרה), יעילות ירודה של silanization היא בדרך כלל הגורם. מניסיוננו, זה יכול להתרחש אם לחות באטמוספרה היא גבוהה מדי, או נמוכה מדי, אופייני לתנאים בשיאו של הקיץ, או בחורף, בהתאמה. אם זה אפשרי להפעיל שליטה מסוימת על לחות בחדר, בעיות אלה ניתן להתגבר.

התנגדות האלקטרודה היא גבוהה מדי.

במידת צורך, את ההתנגדות של חבית היון רגיש יכולה להיות מופחתת על ידי bevelling. לשם כך, לחשוף את הקצה שלה למטוס חזק של שוחק תלוי במים במשך כמה שניות. זה יגרום קצה עֶלִיוֹן לשבור ולהפחית את ההתנגדות לערך הרצוי.

גשרי מלח.

מלחגשרים בין חביות היון והתייחסות לגרום אלקטרודות גרועים או להגיב-אף ובכך יכולים גם לבלבל את הביצועים שלהם בכיול מאוד. כפי שצוין לעיל (ראה נקודה 1.6.), זה בעיקר עניין כאשר הזכוכית כפולה קנה תטא נבחרה, אך הוא תופעה נדירה בעת השימוש בטכניקת קיזוז החבית, המעוות המתוארת כאן.

בקלות של ייצור במוח, העיצוב כפול קנה המקורי של Lux 29 יכול לשמש לעתים קרובות רווחי. שיטה זו מנצלת מראש מילוי חביות יון והתייחסות עם פתרונות מלח, חשיפה מהירה לפתרון silane על ידי יניקתה וגירוש מהקצה, הבאה על ידי שילוב של יון-מחליף, גם באמצעות הקצה (ראה 30,31) . יכולות להיות מפוברקות אלקטרודות אלה בכ -10 דקות, אבל גודל הקצה שלהם הוא בדרך כלל 4 מיקרומטר או יותר והם נוטים יותר להיכשל במהלך ניסוי. לעומת זאת, שיטות silanization שכרוכות בחשיפה לאדים וחום silaneING יכול לייצר אלקטרודות עם טיפים קטנים שיימשכו ימים, ולפעמים שבועות.

יחדיו, יש כמה פרוטוקולים וגישות על איך להכין microelectrodes יון סלקטיבי. הנה, יש לנו תארנו שני הליכים עיקריים לייצור של microelectrodes הכפולה קנה, כמו גם קונצנטריים המעוות שפועלות היטב ובאמינות במעבדות שלנו, עם שיעור הצלחה כולל של קרוב ל 100%. חשוב לציין, בטכניקות אלה יהיו להעברה למדידה של מיני יונים אחרים, כוללים pH או סידן, וגם תהיה ישים לתכשירים אחרים מהמוח, כוללים חללים המלאים בנוזל או נוזלים באופן כללי. אחרון, אך לא פחות חשוב, microelectrodes יון סלקטיבי לאפשר קביעת ריכוזי יון בתוך תאים. בגלל גודל טיפ הגדול יחסית שלהם (~ מיקרומטר 1), רצון זה, עם זאת, יתאפשר רק בתאים עם גוף תא גדול, למשל כמו שנמצא בהכנות חוליות 28,32.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים מבקשים להודות ג רודריגו לקבלת סיוע טכני מומחה. אנו מודים ס קוהלר (מרכז של הדמיה מתקדמות, היינריך היה דיסלדורף האוניברסיטה) לעזרה בהפקת וידאו. מחקר במעבדה של המחבר כבר במימון הגרמני לחקר האגוד (DFG: 2,327 Ro / 8-1 לCRR), היינריך היה אוניברסיטת דיסלדורף (לNH) ועל ידי המכון הלאומי לבריאות להעניק R01NS032123 (לMC).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שוחקים   מיקרופוליש Buehler GmbHמומס בנימי
זכוכית בורוסיליקטA.dest1405059 הילגנברגיישום פיפטה; 75 מ"מ x 2 מ"מ, עובי דופן 0.3 מ"מ
נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימהGC 150 F-15 Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatusלחיישן של מיקרואלקטרודות דו-קניות 
נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימהGC100-F-15Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatusלעיון של מיקרואלקטרודות דו-קניות 
נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימהGB-200TF-15 מוצרי מדעקונצנטריים, תעלה חיצונית. OD 2.0 מ"מ   
נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימהGB-120TF-10מוצרי מדעקונצנטריים, תעלה פנימית. מגבר
Digidata1322AAxon Instruments
עם במהבהתאמה אישית= 10 TΩ ו- Ibias = 50 fA-1pA (זמין מסחרית  חלופות: למשל Dagan IX2-700, עם headstage (נגד משוב 10 ג'יגה) או EPMS-07, NPI, Tamm, גרמניה)
תאבהתאמה אישיתזמין מסחרית מ-e.g.   וורנר אינסטרומנטס, ארה"ב;   Scientifica, בריטניה
תנורהראוסחייב להישאר קבוע ב-200 מעלות; C
שעווה דביקה קשה / שעווה דנטלית דיבריט 502 סילאדנט ד"ר בוהם & Schoeps GmbH
Hot plateבהתאמה אישיתחייב להישאר קבוע ב-40 מעלות;
C מחזיק מיקרואלקטרודות עשוי פרספקסבהתאמה אישיתדו-חבית כפולה: OD   נימים 1.5 מ"מ, קונצנטריים: OD  נימים 2 מ"מ
מיקרומניפולטורLeitz
מיקרומניפולטורMD4Rמיקרוסקופ סטריאו Leica
M205CLeica
מטרה0.8xLWDחולץ פיפטה Leica
דגם PP-830מיקרואלקטרודות קונצנטריותנרישיג
חולץ פיפטותדגם P-97Sutter Instruments חיישן מיקרואלקטרודות קונצנטריות 
מערכת פליטת תרופות פנאומטיתPicospritzter Type IIGeneral Valve TM Corporation
Travel Dovetail stageDT 25/MThorlabs
דבק דו-רכיבי  AralditeHuntsman חומרים מתקדמים GmbHאפשר גם להשתמש בפס קטן של רדיד אלומיניום כדי להדביק את הנימים זה לזה 
סילברווייר99.9% Wieland Edelmetalle
Slicer / VibratomeMicrom HM 650 VThermo Scientific
SoftwareAxoScope 8.1 Axon Instruments
חולץ אנכי סוג PE-2Narishige מכשירים מדעייםעם צ'אק מתגלגל עבור  מיקרואלקטרודות דו-חביות
x/y שלבמותאם אישית
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodideSigma aldrich14343אנטגוניסט תחרותי של קולטני GABAA (רגיש לאור); זהירות
CNQXSigma aldrichC-127AMPA/kainate רעיל; זהירות
דימתיל סולפוקסיד רעיל (DMSO)Sigma aldrichD5879
DL-AP5Alfa AesarJ64210אנטגוניסט לקולטן NMDA; זהירות
Hexamethyldisilazane רעיל (HMDS)סיגמא אולדריץ'440191זהירות: דליק, רעילות חריפה (דרך הפה, עור, אינהלציה) וקורוזיבי למתכות ולעור
חומצה L-אספרטיתSigma aldrichA9256מפעיל NMDA ו-NMDA ו-EAATs
חומצה L-גלוטמית מלח מונוסודיום הידרטסיגמא אולדריץ'G1626מפעיל NMDA-R, AMPA-R, QA-R ו-KA-R),  mGluRs ו-EAATs
אשלגן יונופור I - קוקטייל BFluka 60403מבוסס על ולינומיצין; זהירות נתרן יונופור רעיל
II - קוקטייל AFluka   71178מבוסס על מעכב ETH 157
TTX Ascent ScientificAsc-055של ערוצי Na+ תלויי מתח; זהירות
: מים רעילים,סיגמא אולטרהW3500 
אלקטרומטר 1.2 מ"מ קדמית Rin ניסיוני תוכנית'  תרגום : אנטגוניסט קולטן: , , טהור

מקורות

  1. Somjen, G. G. Ion regulation in the brain: implications for pathophysiology. Neuroscientist. 8, 254-267 (2002).
  2. Dietzel, I., Heinemann, U., Hofmeier, G., Lux, H. D. Stimulus-induced changes in extracellular Na+ and Cl- concentration in relation to changes in the size of the extracellular space. Exp Brain Res. 46, 73-84 (1982).
  3. Nicholson, C., ten Bruggencate, G., Stockle, H., Steinberg, R. Calcium and potassium changes in extracellular microenvironment of cat cerebellar cortex. J Neurophysiol. 41, 1026-1039 (1978).
  4. Rice, M. E., Nicholson, C. Glutamate- and aspartate-induced extracellular potassium and calcium shifts and their relation to those of kainate, quisqualate and N-methyl-D-aspartate in the isolated turtle cerebellum. Neuroscience. 38, 295-310 (1990).
  5. Prince, D. A., Lux, H. D., Neher, E. Measurement of extracellular potassium activity in cat cortex. Brain Res. 50, 489-495 (1973).
  6. Deitmer, J. W., Rose, C. R. pH regulation and proton signalling by glial cells. Prog Neurobiol. 48, 73-103 (1996).
  7. Chesler, M. Regulation and modulation of pH in the brain. Physiol Rev. 83, 1183-1221 (2003).
  8. Kofuji, P., Newman, E. Regulation of potassium by glial cells in the central nervous system. , Springer. (2009).
  9. Nicholson, C. Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment. J Neurosci Methods. 48, 199-213 (1993).
  10. Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. Fabrication and use of high-speed, concentric h+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording. J Neurophysiol. 96, 919-924 (2006).
  11. Stephan, J., et al. Kir4.1 channels mediate a depolarization of hippocampal astrocytes under hyperammonemic conditions in situ. Glia. 60, 965-978 (2012).
  12. Haack, N., Rose, C. R. Preparation, Calibration and Application of Potassium-Selective Microelectrodes. Microelectrodes. Lei, K. F. , Nova Science Publishers. 87-105 (2014).
  13. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61, 296-434 (1981).
  14. Kleinhans, C., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).
  15. Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na ,K -ATPase and glycogenolysis for K homeostasis in mammalian brain. J Neurosci Res. , (2014).
  16. Pumain, R., Heinemann, U. Stimulus- and amino acid-induced calcium and potassium changes in rat neocortex. J Neurophysiol. 53, 1-16 (1985).
  17. Vargova, L., Jendelova, P., Chvatal, A., Sykova, E. Glutamate, AMPA, NMDA Induced Changes in Extracellular Space Volume and Tortuosity in the Rat Spinal Cord. J Cereb Blood Flow Metab. 21, 1077-1089 (2001).
  18. Fellin, T., Gomez-Gonzalo, M., Gobbo, S., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate is not necessary for the generation of epileptiform neuronal activity in hippocampal slices. J Neurosci. 26, 9312-9322 (2006).
  19. Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission. Science. 322, 1551-1555 (2008).
  20. Lux, H. D., Heinemann, U., Dietzel, I. Ionic changes and alterations in the size of the extracellular space during epileptic activity. Adv Neurol. 44, 619-639 (1986).
  21. Zanotto, L., Heinemann, U. Aspartate and glutamate induced reductions in extracellular free calcium and sodium concentration in area CA1 of 'in vitro' hippocampal slices of rats. Neurosci Lett. 35, 79-84 (1983).
  22. Borrelli, M. J., Carlini, W. G., Dewey, W. C., Ransom, B. R. A simple method for making ion-selective microelectrodes suitable for intracellular recording in vertebrate cells. J Neurosci Methods. 15, 141-154 (1985).
  23. Ammann, D., Anker, P. Neutral carrier sodium ion-selective microelectrode for extracellular studies. Neurosci Lett. 57, 267-271 (1985).
  24. Deitmer, J. W., Schlue, W. R. Intracellular Na+ and Ca2+ in leech Retzius neurones during inhibition of the Na+-K+ pump. Pflugers Arch. 397, 195-201 (1983).
  25. Schwiening, C. J., Thomas, R. C. Relationship between intracellular calcium and its muffling measured by calcium iontophoresis in snail neurones. J Physiol. 491 (Pt 3), 621-633 (1996).
  26. Chesler, M., Kraig, R. P. Intracellular pH of astrocytes increases rapidly with cortical stimulation. Am J Physiol. 253, R666-R670 (1987).
  27. Ammann, D., Chao, P. S., Simon, W. Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance. Neurosci Lett. 74, 221-226 (1987).
  28. Deitmer, J. W. Bicarbonate-dependent changes of intracellular sodium and pH in identified leech glial cells. Pflugers Arch. 420, 584-589 (1992).
  29. Lux, H. D. Fast recording ion specific microelectrodes: their use in pharmacological studies in the CNS. Neuropharmacology. 13, 509-517 (1974).
  30. Nicholson, C., Phillips, J. M. Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum. J Physiol. 321, 225-257 (1981).
  31. Chesler, M., Chan, C. Y. Stimulus-induced extracellular pH transients in the in vitro turtle cerebellum. Neuroscience. 27, 941-948 (1988).
  32. Thomas, R. C. Intracellular sodium activity and the sodium pump in snail neurones. J Physiol. 220, 55-71 (1972).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון


Formal Correction: Erratum: Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 5/10/2016. Citeable Link.

An author's middle initial was omitted from the publication, Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue. The author's name has been updated to:

Christine R. Rose

from:

Christine Rose

תגיות

מאמרים קשורים