הנדסת רקמות קרובות כולל בהרחבת חוץ גופית על מנת ליצור autografts לשחזור רקמות. במחקר זה שיטה להרחבת רקמות, התחדשות, ושחזור in vivo פותחה על מנת למזער את העיבוד של תאים וחומרים ביולוגיים מחוץ לגוף.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
רקמות טחונות ב הדחוס קולגן: A Biotransplant המכיל נייד עבור תיקון Reconstructive המבוים יחיד
במאמר זה
סיכום
תקציר
טכניקות קונבנציונליות להרחבת תאים והשתלת תאים אוטולוגיים למטרות הנדסת רקמות יכולות להתרחש במתקני תרבית תאים אנושיים מאובזרים במיוחד. שיטות אלו כוללות בידוד תאים בתרחיף תא בודד ומספר אירועים מייגעים וגוזלי זמן לפני ההשתלה בחזרה למטופל. מחקרים קודמים מצביעים על כך שהגוף עצמו יכול לשמש כביו-ריאקטור להרחבת תאים והתחדשות רקמות על מנת למזער מניפולציות ex vivo של רקמות ותאים לפני ההשתלה לחולה. מטרת מחקר זה הייתה להדגים שיטה לקצירת רקמות, בידוד אפיתל רציף, טחינת האפיתל לחתיכות קטנות ושילובם בחומר ביולוגי תלת שכבתי. החומר הביולוגי התלת-שכבתי שימש אז ככלי מסירה, כדי לאפשר טיפול כירורגי, חילופי תזונה לאורך ההשתלה ופירוק מבוקר. החומר הביולוגי היה מורכב משתי שכבות חיצוניות של קולגן וליבה של פולימר יציב מכנית ומתכלה לאט. האפיתל הטחון שולב באחת משכבות הקולגן לפני ההשתלה. על ידי טחינת רקמת האפיתל לחתיכות קטנות, ניתן היה לפזר את החלקים ובכך לעורר את התפשטות התאים. לאחר הנטילה הראשונית של ההשתלות, התרחבות וארגון מחדש של התאים יתרחשו והמטריצה החוץ-תאית תתבגר כדי לאפשר צמיחה של נימים ועצבים והבשלה נוספת של המטריצה החוץ-תאית. הטכניקה ממזערת מניפולציות ex vivo ומאפשרת קצירת תאים, הכנת השתלה אוטומטית והשתלה למטופל כהתערבות פשוטה בשלב אחד. בעתיד, ניתן יהיה להתחיל הרחבת רקמות סביב תבנית תלת מימדית בתוך הגוף עצמו, בהתאם לצרכים הספציפיים של המטופל. בנוסף, ניתן לבצע את הטכניקה במסגרת כירורגית רגילה ללא צורך במתקני תרבית תאים מתוחכמים.
מבוא
רוב המחקרים בהנדסת רקמות על השתלה לעור בדרכי השתן ואברי המין כוללים יבולי תא אוטולוגי מרקמות בריאות הרחבת תא במתקנים-culturing תא מאובזר במיוחד 1,2.
לאחר הרחבת התא, התאים בדרך כלל מאוחסנים לשימוש מאוחר יותר כאשר החולה הוא מוכן לקבל את autograft. מקפיאי חנקן לאפשר אחסון לטווח ארוך בטמפרטורות נמוכות של -150 מעלות צלזיוס ומטה. תהליך ההקפאה חייב להיזהר ומבוקר על מנת לא לאבד את התאים. אחת הסכנות של מוות של תאים הוא התגבשות של מים תאיים במהלך תהליך ההפשרה, מה שעלול להוביל לקרע של קרום התא. תא הקפאה מתבצעת לרוב על ידי קירור איטי ומבוקר (-1 ° C לדקה), באמצעות ריכוז גבוה של תאים, בסרום שור העובר, וכן sulfoxide דימתיל. לאחר הפשרה, תאים צריכים להיות מעובד שוב על ידי הסרה בינוני מקפיא culturing על פלסטיק תרבית תאים אוביולוגי לפני ההשתלה בחזרה לחולה.
כל השלבים הנ"ל הן זמן רב, מייגע, ויקר 3. בנוסף, כל במבחנת העיבוד של תאים המיועדים להשתלה לחולה נמצא תחת הרגולציה מאוד ודורש ומוכרים מאומנים היטב אנשים ומעבדות 4. בסיכומו של דבר, כדי להשיג תהליך הייצור בטוח ואמין, הטכניקה יכול יוקם רק במספר קטן מאוד של מרכזי מתקדם מבחינה טכנית לשימוש רחב יותר בהפרעות כירורגית משותפות מוטל בספק.
על מנת להתגבר על המגבלות של culturing תא בסביבת מעבדה, הרעיון של השתלת רקמות טחון עבור הרחבת התא in vivo הוא הציג באמצעות הגוף עצמו בתור bioreactor. למטרות אלה, autografts יהיה להשתיל מועדף על תבנית 3D על פי הצורה מה שצריך לשיקום הסופי של האיבר של interest 5-7.
במקור, הרעיון של השתלת אפיתל טחון הוצגה על ידי מיק בשנת 1958 כשתיאר כיצד האפיתל צומחת מן הקצוות של פצע. הוא הוכיח כי חתיכה קטנה של עור תגדיל את שולי רווח שלה ובכך פוטנציאל שלה הרחבת התא ב -100% על ידי חיתוך הפיסה פעמים בכיוונים ניצב (איור 1) 8. התאוריה כבר נתמכה על ידי שימוש בשתלי עור בעובי חלקי מרושתים להשתלת עור 9 וב עור ריפוי פצעי מודלים 10.
איור 1:. התיאוריה מיק על פי התיאוריה של מיק, האפיתל צומחת מן הקצוות של פצע. על ידי הגדלת שטח החשופה על ידי הטכנולוגיה מתייפייף, רקמות טחונות epithelializes פצעי כתמים רבים.
המחקר הנוכחי מבוסס על היפוהתזה כי אותו עיקרון יכול להיות מיושם על הרקמה התת עורית על ידי הצבת האפיתל טחון סביב עובש. לתאי האפיתל יגייסו מ השתלות טחונות (מחדש), לכסות את אזורי הפצע (להעביר) ומתחלקים (להרחיב) על מנת לגבש neoepithelium רציפה המכסה את אזור הפצע ומפריד הגוף הזר (העובש) מהגוף הפנימי ( איור 2).
איור 2:. קריקטורה של עובש 3D עם אפיתל טחון עבור in vivo להרחבת רקמות intracorporal פי התיאוריה של מיק באמצעות רקמות טחון דגש על תבנית ולאחר מכן להשתיל את הרקמה התת עורית, ההשערה היא כי תאי אפיתל להגר מן שולי הרקמה טחון, להתארגן מחדש ולהרחיב כדי לגבש neoepithelium רציפה המכסה את אזור הפצע ומפריד הגוף הזר (עובש) מהגוף הפנימי.
למרות שמחקרי in vivo קודמים הראו תוצאות מבטיחות, שיפורים נוספים ניתן להשיג על ידי חיזוק autografts כך האפיתל מחדש יכול לעמוד טראומה מכאנית 7 טוב יותר. לעניין זה, תנאים מוקדמים חשובים עבור ביולוגי מוצלח זוהו, כגון: דיפוזיה קל של חומרים מזינים ופסולת, אפשרות לעצב באופן 3D ונינוחות של טיפול כירורגים. מסקנות נעשו כי הצרכים הללו יכול להיות נפגשו על ידי הוספת ביולוגי מרוכבים אל הרקמה טחון.
המחקר הנוכחי במטרה לפתח פיגום מורכב רקמות טחונות בפלסטיק-דחוס המכיל קולגן גרעין חיזוק של בד מתכלה. תודות לאמצעים אלה תאי קיימא עשויים להגר מ- חלקיקי הרקמות הטחונים מתרבים עם מאפיין תכונות מורפולוגיות של האפיתל המקורי (עור או urothelium). באמצעות דחיסת פלסטיק, הפיגום היה להפחיתד בגודל 1 ס"מ לכ 420 מיקרומטר כמו חלקיקים טחון היו נתונות קולגן השכבה העליונה. בד הליבה יכול להיות כל פולימר אבל צריך להיות שונים עם משטח הידרופילי כדי interlink עם שכבות קולגן הכוללים 11.
השיטה סיפק שלמות פיגום משופרת על ידי שילוב של רשת סרוגים המורכב פולי (ε-caprolactone) (PCL) בתוך שני ג'ל קולגן דחוס פלסטיק להשתמש בה כמו פיגום עבור culturing רירית שלפוחית השתן טחון או העור טחון חזירים. הבונה נשמרה בתנאי תרבית תאים עד 6 שבועות במבחנה, הוכחת היווצרות מוצלחת של urothelium מרובדת, רב שכבתי או אפיתל עור קשקש על חלק עליון של מבנה היברידי אוחד גם. הבונה הייתה קלה לטפל ניתן לצורך איחוי במקום למטרות הגדלת שלפוחית או כיסוי של פגמים בעור. כל החלקים של הפיגום רקמות ה- FDA ואת הטכניקהיוכל לשמש עבור הליכים חד-שלבי על ידי קצירת רקמות, מגונדרת, דחיסה פלסטיק, השתלה בחזרה לחולה כמו התערבות חד מבוים. ההליך יכול להתבצע להרחבת רקמות ושיקום בתנאים סטריליים בכל יחידת כירורגיה כללית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל פרוטוקולים החיים היו שאושרו מראש על ידי ועדת מחוז סטוקהולם על בעלי חיים וכל הליכים תאמו לתקנון שימוש בבעלי חיים, כמו גם חוקים פדרליים רלוונטיים.
1. נהלים בעלי חיים
- הכנת בעלי חיים לכירורגיה
- הכן את השולחן כירורגית עם כל החומרים והכלים הדרושים המבצע בתנאים סטריליים. לבצע את הניתוח באופן בלעדי בתנאים סטריליים כדי להפחית את הסיכון לזיהום ו לייעל את התנאים בניתוחי הישרדות.
- לצום החיה במשך 12 שעות לפני הניתוח ולמדוד את משקלו. נהל זריקה תוך שרירית של azaperone (2 מ"ג / ק"ג) עבור premedication. להרדים את החיה עם זריקה תוך שרירית של היפוכלוריד tiletamine (2.5 מ"ג / ק"ג), היפוכלוריד zolazepam (2.5 מ"ג / ק"ג), medetomidine (25 מיקרוגרם / ק"ג) אטרופין (25 מיקרוגרם / ק"ג).
- להזריק phenobarbiturate (15 מ"ג / ק"ג) לפני endotracheאל אינטובציה ולהמשיך הרדמה כללית עם 0.8% -2% isoflurane. הכנס וריד קטטר היקפי באוזן אחת להחדיר גלוקוז (25 מ"ג / מ"ל) לווריד במהלך ההליך כדי לשמור על רווחתם של בעלי החיים.
- מניח ניטור התקנים על אוזן או הזנב לבדוק טמפרטורה, לחץ דם, רוויה, ודופק פריפריה. בקרת הרדמה על ידי גירוי כאב של אוזניים או פרסות. החל משחה לעיניים למניעת יובש לאחר הרדמה.
- כריתה של שלפוחית השתן ביופסיה הדגימה
- קטטר לשלפוחית השתן באמצעות קטטר סיליקון 10-צרפתית על ידי החדרת ספקולום כדי להציג את השופכה והכנס קטטר דרך השופכה לתוך שלפוחית השתן לרוקן את השתן בתנאים חצי סטרילי. מלאו את השלפוחית עם תמיסת מלח סטרילית כדי בלחץ של 20-25 ס"מ H 2 O, על 100-300 מ"ל, ואז ריק עד 20 ס"מ H 2 O (כ. 8 מ"ל / ק"ג משקל גוף).
- עם החזיר דואר סובב בזהירות בעמדה בצד, לבצע עיקור לפני ניתוח בסיסי של עור עם יישום של gluconate chlorhexidine. החל צלחת דיאתרמיה לכתף לאחר הסרת pelage עם מספרי גילוח.
- סובב את החזיר בזהירות לתוך במצב שכיבה ולהסיר את pelage הבטן באמצעות מספרי גילוח ולעשות עיקור לפני ניתוח בסיסי של עור הבטן עם יישום של gluconate chlorhexidine.
- שבץ הגפיים עם בגדים רכים כדי למזער את הסיכון לנזק hyperextension למפרקים בגפיים. לעקר את עור הבטן של חיה עם יישומים רצופים של gluconate chlorhexidine ומניח כורך סטרילי סביב השדה כירורגית.
- לפני החתך בעור, להחיל משכך כאבים תוך ורידי המורכב עצירות (45 מיקרוגרם / ק"ג), carprofen (3 מ"ג / ק"ג) ו זריקה מקומית של לידוקאין קו האמצע מתחת לטבור. בדקו אם תגובה לכאב ידי אחיזת skעם מלקחיים. ביצוע חתך קו אמצע תחתון דרך fascia הצפק באמצעות דיאתרמיה על שליטת דימום. לוקליזציה של שלפוחית השתן, כי יש עמדת intraperitoneal במלואו החזיר יכול להיחשף באופן חופשי על ידי הניע אותו דרך הפצע כירורגית.
- החזיקו את השלפוחית עם המלקחיים ומודדים אותו עם סרט המדידה מעוקר וסמן דגימת ביופסיה בצורת אליפטי כ 2 סנטימטרי אורכים או 1 סנטימטר transversally, או קטנים יותר, באמצעות עט מעוקר (חזיר סובל הפחתת רבע גודל שלפוחית שתן טוב מאוד). ובלו האזור מסומן, באמצעות אזמל, ומקום דגימת ביופסית שלפוחית שתן DMEM בתנאים סטריליים.
- בצע autotransplantation עם biotransplant או לסגור את שלפוחית השתן על ידי תפירה זה עם 5-0 Vicryl בשתי שכבות. סגור את fascia הבטן בזהירות עם 2-0 או 3-0 ריצה Vicryl. סגור את subcutis עם 3-0 Vicryl והעור עם 3-0 Ethilon. מניח הלבשה על פצע בקפידהנוטה את החיה עד שהוא התאושש מספיק מן ההרדמה ואינו להביע כאב.
- הזז את החיה למתקן הטיפול בבעלי החיים כדי לזכות בתנאים נוחים עבור טיפול לאחר ניתוח. שים את החיה בכלוב אחד עם מנורת חימום ולטפל החיה עד להחלמה מלאה מן ההרדמה ולאחר מכן תן לחיות לְהֵאָבֵס בזוגות.
- לספק התאוששות ללא אירועים מיוחדים לגבי כאב ורווחה ולנהל עצירות (45 מיקרוגרם / ק"ג) לשריר על שיכוך כאבים לאחר הניתוח trimetoprim (4 מ"ג / ק"ג) ו sulfonamide (20 מ"ג / ק"ג) פעמיים ביום למשך שלושה ימים, פעם ביום, במשך חמישה ימים כדי להפחית את הסיכון לזיהומים לאחר ניתוח.
- כריתה של עור ביופסית הדגימה
- הכן את השולחן כירורגית עם כל החומרים הדרושים. להרדים את החיה כפי שתואר לעיל ב 1.1. הסר את pelage באמצעות שעווה, לרחוץ ולחטא את אזור החתך בבטאדין 70% אלכוהול ולאחר מכן למקם כורכת סטרילי לאיזורד את אזור החתך.
- השתמש dermatome למסוק דגימה לביופסיה העור עובי חלקי 0.3 מ"מ. מניח את דגימת עור DMEM לפני מיותר, כמתואר 2.2. מכסה את אזור הפצע עם משחת שומן רוטב.
2. רקמות טחונות הכנה
- שלפוחית שתן רירי
- שטוף את ביופסית שלפוחית השתן פעמים DMEM. מניח את דגימת הביופסיה בשלפוחית לצלחת לנתח מעוקרים עם הרירית כלפי מעלה ולתקן אחד צדדים לצלחת באמצעות סיכות לנתיחה.
- הפרד את הרקמה הרירית מן השריר detrusor באמצעות מספרי מלקחי קנס (איור 3) ולשמור את רירית לח ידי נוטף מלוח או DMEM מעליו.
- השתמש במכשיר מתייפייף ידי הצבתו על רירית ולאחר מכן להעביר את המכשיר מקצה אחד לקצה השני אנכית ואופקית, הפעלת לחץ ידני כדי להשיג חתיכות של רקמות טחון של 0.8 מ"מ x 0.8 מ"מ (0.8 מ"מ הוא המרחק בין rotating להבים חותכים).
- עור
- אם biopsis העור עבה: למקם את העור לצלחת לנתח סטרילי ולהשתמש מספרי כירורגיות להפריד האפידרמיס משומן תת עורי הדרמיס. האפידרמיס הוא דק ושקוף (כ. 0.3 מ"מ) כאשר הוא מוכן עבור מיותרות.
- השתמשו במכשיר המיותר ידי הצבתו על האפידרמיס. עם לחץ, להעביר את המכשיר מקצה אחד לקצה שני האנכי ואופקי להשיג חתיכות של רקמות טחונות של 0.8 מ"מ x 0.8 מ"מ.
3. הכנת פלסטיק דחוס PCL / קולגן Autografts
- מניחים את כל המרכיבים על קרח כדי לשמור על קור. הכלים הדרושים: צינור פלקון, 10x DMEM, 1x DMEM, 1 N NaOH וסוג קולגן זנב עכברוש 1.
- מערבבים 2 מ"ל של 10x DMEM (בזהירות כדי למנוע בועות) עם 12 מ"ל של קולגן מסוג 1. הוסף 1 N NaOH, טיפה אחר טיפה, כדי להעלות את ה- pH 7.4-8 (צבע בטווח הבינוני צריך לציין את ה- pH על ידי שינוי מן אינטנסיבי צהוב להצמידיא). בנוסף, השתמש ברב pH.
- בזהירות להוסיף 2 מ"ל של 1x DMEM ומערבבים הפתרון. פלייט כ 2 מ"ל של קולגן היטב כל עובש מלבני פלדה (20x30x10 מ"מ) ו לדגור על 37 ° C ב 5% CO 2 למשך 10 דקות.
הערה: ריכוז קולגן צריך להיות 2.06 מ"ג / מ"ל ב 0.6% חומצה אצטית ואת כמות הקולגן 1 מ"ל / 2 ס"מ. - לאחר קולגן קובע לתוך התבנית, מניחים את ביולוגי (PCL) על גבי ג'ל קולגן (20 מ"מ x 30 מ"מ) ושופכים את הקולגן הנותרים (כ -6 מ"ל) על גבי זה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 עבור 20 דקות.
- הנח את רקמת טחון (1: 6 הרחבה) על החלק העליון של ג'ל קולגן. לחצו על המים מתוך המבנה בכוח מכני באמצעות דחיסת פלסטיק כדלקמן (איורים 3 ו -4).
- מניחים שכבה עבה של פדי גזה על משטח סטרילי. מניחים רשת נירוסטה אחד (400 מיקרומטר עבה) על גבי gauzרפידות דואר ולאחר מכן גיליון רשת ניילון (110 מיקרומטר עבה). להעביר בזהירות את קולגן ג'ל / רקמות טחונות על רשת הניילון ובזהירות להסיר את תבנית פלדה המלבנית.
- מניח שכבה חדשה של רשת ניילון על גבי רקמת קולגן ג'ל / הטחון. מניח רשת פלדה שנייה על גבי רשת הניילון. מניח בעמדת צלחת הלחץ או טעינה במשקל מינימום של 120 גר '(כלומר, צלחת זכוכית) במשך 5 דקות.
- הסר את המשקל, ניילון, משתלב פלדה. Autografts מוכן כעת להיות איחוי לשלפוחית חזיר הפצעים בעור בעובי המלא או מתורבת במבחנה.
- עבור culturing במבחנה, לחתוך את המבנה הדק לחתיכות קטנות ההולמות 12 גם צלחות. הוסף 1 מ"ל של מדיום keratinocyte. מניחים את הצלחות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 והתרבות עד 6 שבועות ולשנות את המדיום 3 פעמים בשבוע.
4. קשירת Autografts
- תפר של autograft עם רירית שלפוחית השתן טחון לשלפוחית חזיר
- שמור את autograft לח ב DMEM בזמן ההמתנה. לתפור את autograft עם התפרים monofilament פועל בסדר. שימוש בלתי נספג 5-0 Ethilon למטרות מחקר.
- בדקו אם אטום למים על ידי מילוי השלפוחית עם מי מלח דרך קטטר שתן השכינה. במידת האפשר, לכסות את autograft בשכבת omentum יותר. סגור את דופן הבטן, הרקמה התת עורית, והעור כמתואר 1.2.6. החלת הלבשת פצע.
- תפר של Autograft עם עור טחון אפידרמיס כדי פצע בעובי מלא
- שמור את autograft לח ב DMEM בזמן ההמתנה.
- לתפור את autograft לתחתית של בעובי מלא העור הפצע על ידי תפרים קטע בפינות ובאמצע של autograft לשמור על autograft המצורפת הדוק משטח הבסיס.
- מכסה את הפצע עם תחבושת פלסטיק שמחזיק את הפצע לח.
התחת = "jove_title"> 5. סִיוּם
- החיה שלווים עם זריקה תוך שרירית של היפוכלוריד zolazepam (2.5 מ"ג / ק"ג) ו medetomidine (25 מיקרוגרם / ק"ג) לפני סיומה ולהחיל מכשירי ניטור לאוזן או הזנב כדי לבדוק את הדופק ואת לחץ הדם.
- להרדימו על ידי מתן מנה קטלנית של נתרן pentobarbital (60-140 מ"ג / ק"ג) לווריד. בדוק את הדופק ואת לחץ הדם עד המוות התרחשה.
6. במבחנה תרבות
הערה: כדי להעריך את ההתקדמות היסטולוגית של הרקמה הטחונה מבני PCL / קולגן במבחנה, קולגן / PCL / הטלאים טחונים מתורבתות 12 גם צלחות באמצעות מדיום keratinocyte.
- הכנת בינוני keratinocyte:
- לעקר בקבוק זכוכית 500 מ"ל.
- מערבבים 400 מ"ל של DMEM עם 100 מ"ל של F12 של חם (4: 1 תערובת). מוסף עם 10% בסרום שור עוברי, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין,0.4 מיקרוגרם / מ"ל הידרוקורטיזון, 21 מיקרוגרם / מ"ל אדנין, 10 -10 mol / L רעלן הכולרה, 2 x 10 -9 mol / L triiodothyronine, 5 מיקרוגרם / מ"ל transferrin, 10 ng / ml גורם הגדילה באפידרמיס, 50 U / ml פניצילין ו -50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין.
- לעקר ידי filtrating דרך פילטר 0.2 מיקרומטר ולאסוף תסנין בבקבוק 500 מ"ל סטרילי.
7. אימונוהיסטוכימיה
הערה: פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה מחולק בדרך כלל אל השלבים הבאים: (1) קיבעון פרפין והטבעה, (2) מיקרו-חתך עד 5 מיקרומטר פרוסות, מיקום בשקופיות, deparaffination, ו התייבשות, (3) הסרת המסכות אנטיגן, מכתים ואת הרכבה . לפני שמתחילים את הצעדים האחרונים בהליך אימונוהיסטוכימיה, להכין מאגרי כביסת פתרון חשיפת אנטיגן (ראה פירוט חומר נפרד). הכן את הפתרון מורכב ABC לפחות 30 דקות לפני השימוש.
- קיבוע
לאTE: בסוף התרבות במבחנה, לתקן את התיקונים כדלקמן:- הכן צינורות Eppendorf עם 1 מ"ל של 4% פורמלין שנאגרו (PFA) (זהירות:. פורמלדהיד הוא רעיל אנא קרא גיליונות נתוני בטיחות חומרים לפני עבודה עם חומר כימי זה יש להשתמש בכפפות ומשקפי בטיחות ולהכין את הפתרון בתוך במנדף.).
- העברת כל התיקונים קולגן צינור Eppendorf המכיל 4% PFA. תקן במשך הלילה בטמפרטורת החדר.
- מקום דגימות באתנול 70% עבור אחסון לטווח ארוך ב 4 מעלות צלזיוס. דוגמאות מוכנות כעת עבור התייבשות והטבעה בבלוקי פרפין לפני החתך.
- rehydration
- מניח את השקופיות בצנצנת מכתימה עם solv X-tra במשך 15 דקות. חזור באמצעות בצנצנת מכתים חדשה עם solv X-TRA. מניח את השקופיות בצנצנת מכתימה עם אתנול אבסולוטי למשך 10 דקות. חזור באמצעות בצנצנת מכתים חדשה עם אתנול אבסולוטי. מניח את השקופיות בצנצנת מכתימה עם אתנול 95% למשך 10 דקות ולאחר מכןלצנצנת מכתימה עם אתנול 70% למשך 10 דקות. לבסוף לשטוף את שקופיות פעמים במשך 5 דקות עם מים מזוקקים.
- חשיפת Antigen
- שים שקופיות בצנצנת Coplin עם TE-פתרון ולשים בצנצנת באמבט מים להרתיח במשך 20 דקות. קח את הצנצנת מתוך אמבט במים בזהירות. מצננים את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ולשטוף פעמיים במשך 5 דקות ב טריס חיץ. מניח את השקופיות בצנצנת מכתימה עם מי חמצן 3% למשך 10 דקות. שטפו את השקופיות פעמיים במשך 5 דקות ב טריס חיץ. צייר עיגול סביב הדגימות באמצעות דוחה מי סימון עט.
- חסום ספציפי מחייב של הנוגדנים באמצעות 100-300 μl של פתרון לחסימה. הסר את הפתרון חוסם ולהוסיף 100-300 μl של נוגדן ראשוני מומס בריכוז המומלץ ב טריס חיץ. דגירת הלילה. הסר את פתרון הנוגדן ולשטוף פרקים, טריס חיץ פעמים במשך 5 דקות.
- דגירה עם נוגדנים משני עבור שעה 1 ב חדר לטמפרטורותיור. שטפו פעמיים במשך 5 דקות ב טריס חיץ. דגירה 30 דקות באמצעות ערכת עלית ABC (בהתאם להוראות היצרן). לשטוף פעמיים ב טריס חיץ.
- לפתח תגובת נוגדן באמצעות ערכת VIP הווקטור, בעקבות הוראות יצרן (דגירת דקות 1-7 בדרך כלל מייצרת עוצמת סגולה ברורה). שים את השקופיות במים מזוקקים. Counterstain עם hematoxylin מאיר למשך 30 שניות.
- לשטוף במים זורמים למשך 5 דקות. מניח את השקופיות בצנצנת מכתימה עם אתנול 70% דקות 1. חזור באמצעות בצנצנת מכתים חדשה עם 70% אתנול. מניח את השקופיות בצנצנת מכתימה עם אתנול 95% דקות 1. חזור באמצעות בצנצנת מכתים חדשה עם 95% אתנול.
- מניחים את השקופיות בצנצנת מכתים עם solv X-tra למשך 5 דקות. הסר, אחד בכל פעם, כדי לשמור על לחות. מניחים ירידה של המדיום גובר על גבי כל שקופית ולשים כוס על גבי העטיפה (לעשות זאת בזהירות כדי למנוע בועות אוויר). בואו השקופיות לייבוש למשך הלילה ולהציג שקופיות תחת מיקרותְחוּם.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מחקר זה מציג שיטה שמראה איך לייצר ביולוגי להשתלה באמצעות דחיסת פלסטיק של הקולגן ולבניית רקמות טחון.
רירית שלפוחית שתן ועור ניתן לקצור ואז טחון מכאני לחלקיקים קטנים (איור 3). על ידי דחיסת פלסטיק, חלקיקים הטחונים משולבים בתוך פיגום מרוכבים מורכבים פולימר מתכלה להציב מאתר מרכזי, חזק מכאני בתוך שכבות חיצוניות של ג'ל קולגן (איור 4). חלקיקי רקמת טחון ניתן להפריד לאפשר 1: קצב התפש...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המחקר זה מציג גישה קלה לשימוש לייצר תיקונים לדופן שלפוחית עם רקמה עצמית להשתלה ליד השולחן כירורגית. המדבקות נוצרות על ידי השילוב של סריגת פולימר מתכלה באמצע וקולגן עם ובלי רקמות טחונות ב המשטחים החיצוניים בשילוב עם דחיסת פלסטיק. דחיסת פלסטיק היא שיטה שתוארה לעיל על ידי מחברים אחרים יכולה להיות מוגדר כ גירוש מהיר של נוזל ג'ל קולגן 12,13. טחון הרקמה של רירית שלפוחית שתן או עור זורעת לתוך הפיגום הזה לבין ההיווצרות של האפיתל שלפוחית שתן או עור יכול להיות מלווה במה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים מודים לאגודה השוודית למחקר רפואי, לקרן פרומוביליה, לקרן נסיכת הכתר לוביזה, לקרן הבונים החופשיים לרווחת הילד, לאגודה השוודית לרפואה, לקרן סולסטיקן, למכון קרולינסקה ולמועצת העיר שטוקהולם על התמיכה הכספית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קטטר סיליקון 10-צרפתית | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | ||
| DMEM 10x | Gibco | 31885-023 | דחיסה פלסטית סעיף 4 |
| 24 צלחות באר | Falcon | 08-772-1 | דחיסה פלסטית קטע 4 |
| 3',3',5-Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | IRMM469 | in vitro תרבית; סעיף 5 |
| 4% PFA | Labmed Solutions | 200-001-8 | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| 70% אתנול | היסטולאב | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 | |
| ערכת ABC Elite: ערכת זיהוי ביוטין-סטרפטווידין | וקטור | PK6102 | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| אתנול מוחלט | היסטולאב | 1399.01 | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| אדנין | סיגמא-אולדריץ' | A8626 | תרבות במבחנה; סעיף 5 |
| אטרופין 25 μ גרם/ק"ג | Temgesic, RB Pharmaceuticals, בריטניה | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | |
| Azaperone 2 מ"ג/ק"ג | Stresnil, Janssen-Cilag, פארמה, אוסטריה | הכנת בעל החיים לניתוח, סעיף 1 | |
| בטיחות ביולוגית רמה 2 ברדס | דחיסת פלסטיק; סעיף 4 | ||
| פתרון חסימה: נוצר סרום רגיל מאותו מין כמו הנוגדן המשני המשני. | וקטור | תמיסת החסימה תלויה במקור הנוגדן הראשון | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| בופרנורפין 45 μ גרם/ק"ג | אטרופין, מיילן בע"מ, קנונסבורג, פנסילבניה | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | |
| קרפרופן 3 מ"ג/ק"ג | רימדיל, אוריון פארמה, שוודיה | הכנת בעל החיים לניתוח, סעיף 1 | |
| כלורהקסידין גלוקונאט | היבישסקראב 40 mg/mL, Regent Medical, אנגליה | הכנת בעל החיים לניתוח, סעיף 1 | |
| תרבית רעלן כולרה | Sigma-Aldrich | C8052 | in vitro; סעיף 5 |
| צנצנת קופלין: צנצנת צביעה להרתחה | Histolab | 6150 | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| תבנית אל חלד (33 מ"מ x 22 מ"מ x 10 מ"מ) | ; סעיף 4 | ||
| DMEM | Gibco | 3188-5023 | דחיסת פלסטיק סעיף 4. המשיכו על הקרח כאשר משתמשים בו בדחיסה פלסטית |
| גורם גדילה אפידרמלי | Sigma-Aldrich | E9644 | in vitro תרבית; סעיף 5 |
| אתילון (מונופילמנט שאינו נספג לתפרי עור) | אתיקון | , סעיף 1 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Gibco | 10437-036 | דחיסה פלסטית סעיף 4 |
| מלקחיים (אדיסון עם שן) | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | ||
| גזה (Gazin Mullkompresse) | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | ||
| F12 | Gibco | 31765-027 | דחיסה פלסטית סעיף 4 |
| המטוקסילין | היסטולאב | 1820 | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| תא לחות | DALAB | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 | |
| הידרוקורטיזון | סיגמא-אולדריץ' | H0888 | תרבית במבחנה; סעיף 5 |
| תמיסת מי חמצן 30% | סיגמא-אולדריץ' | H1009 | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I3536 | In vitro culture; סעיף 5 |
| איזופלורן | איזופלורן, בקסטר, דירפילד, אילינוי | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | |
| לידוקאין 5 מ"ג/מ"ל | קסילוקאין, אסטרהזניקה, שוודיה | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | |
| לוקוז 25 מ"ג/מ"ל | בקסטר, דירפילד, אילינוי | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | |
| עט פאפ סמן | סיגמא-אולדריץ' | Z377821-1EA | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| Medetomidine 25 μ גרם/ק"ג | דומיטור, אוריון פארמה, שוודיה | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | |
| מכשיר טחינה | Applied Tissue Technologies LLC | הכנת רקמות טחונות, סעיף 2 | |
| מונוקריל (מונופילמנט נספג) | ניתוח אתיקון | , סעיף 1 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| NaOH 1 N | Merck Millipore | 106462 | סעיף דחיסה מפלסטיק 4 ותרבית תאים |
| רשת ניילון, 110 μ גודל נקבוביות עבה M 0.04 מ"ר | דחיסת פלסטיק; סעיף 4 | ||
| Oculentum simplex APL: משחה להגנה על העיניים | APL | Vnr | ניתוח 336164, סעיף 1 |
| PBS | Gibco | 14190-094 | סעיף דחיסה פלסטית 4 |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | דחיסה פלסטית סעיף 4 |
| Phenobarbiturate 15 מ"ג/ק"ג | פנטוברביטל, APL, שוודיה | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | |
| סרוג PCL | דחיסה פלסטית; סעיף 4 | ||
| קולגן זנב עכברוש | First LINK, Ltd, בריטניה | 60-30-810 | דחיסה פלסטית סעיף 4, שמור על קרח |
| להב אזמל - 15 | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | ||
| מזמרה | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | ||
| רשת אל חלד, 400 μ גודל | דחיסת פלסטיק; סעיף 4 | ||
| כפפות | הכנת בעל החיים לניתוח, סעיף 1 | ||
| חלוקים | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | ||
| וילונות | |||
| Sterilium | Bode Chemie HAMBURG | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | |
| חוט תפר אתילון | הכנת החיה ל ניתוח, סעיף 1 | ||
| תמיסת TE (תמיסת חשיפת אנטיגן) מורכב מ-10 מ"מ טריס ו-1 מ"מ EDTA, pH 9.0 | 10 מ"מ Tris/1 מ"מ EDTA, התאם את ה-pH ל- 9.0 | ||
| טילטמין היפוכלוריד 2.5 מ"ג/ק"ג | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | ||
| טרנספרין | סיגמא-אולדריץ' | T8158 | תרבית במבחנה; סעיף 5 |
| בסיס טריזמה, H2NC | סיגמא-אולדריץ' | T6066 | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| ערכת וקטור VIP: אנזים ערכת סובסטרט פרוקסידאז | וקטור | SK4600 | אימונוציטוכימיה; סעיף 6 |
| ויקריל (ספיגה) | אתיקון | , סעיף 1 | |
| Tris buffer pH 7.6 (מאגר כביסה) | תמיסת TE: הכינו 10x (0.5 M Tris, 1.5 M NaCl) על ידי ערבוב: 60.6 גרם Tris (Trizma Base, H2NC(CH2OH)3, M=121.14 גרם/מול), מוסיפים 800 מ"ל מים מזוקקים, מכוונים את ה-pH עד 7.6, מוסיפים 87.7 גרם NaCl וממלאים ל-1,000 מ"ל במים מזוקקים. יש לדלל ל-1x במים מזוקקים. | ||
| X-tra solv (ממס) | DALAB | 41-5213-810 | אימונוציטוכימיה; סעיף 6. שימוש מתחת למכסה אדים |
| Zolazepam hypochloride | Zoletil, Virbac, צרפת | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | |
| רצועות שעווה להסרת | Veet | הכנת החיה לניתוח, סעיף 1 | |
| סיום נתרן פנטוברביטל | לונדבק | , סעיף 3 |
מקורות
- Rheinwald, J. G., Green, H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 6, 331-343 (1975).
- Fossum, M., Nordenskjold, A., Kratz, G. Engineering of multilayered urinary tissue in vitro. Tissue Engineering. 10, 175-180 (2004).
- Salmikangas, P., et al. Manufacturing, characterization and control of cell-based medicinal products: challenging paradigms toward commercial use. Regen Med. 10, 65-78 (2015).
- Guidelines of 7 March 2013 on Good Distribution Practice of medicinal products for human use (OJ C 343/1, 23.11.2013). 7, Retrieved from: http://ec.europa.eu/health/human-use/good_distribution_practice/index_en.htm (2013).
- Fossum, M., et al. Minced skin for tissue engineering of epithelialized subcutaneous tunnels. Tissue Engineering. Part A. 15, 2085-2092 (2009).
- Fossum, M., et al. Minced urothelium to create epithelialized subcutaneous conduits. The Journal of Urology. 184, 757-761 (2010).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. L., Nordenskjold, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. BioMed Research International. 2013, 212734(2013).
- Meek, C. P. Successful microdermagrafting using the Meek-Wall microdermatome. Am J Surg. 96, 557-558 (1958).
- Tanner, J. C., Vandeput, J., Olley, J. F. The Mesh skin graft. Plastic and Reconstructive Surgery. 34, 287-292 (1964).
- Svensjo, T., et al. Autologous skin transplantation: comparison of minced skin to other techniques. The Journal of Surgical Research. 103, 19-29 (2002).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Rojas, R., Fossum, M., Hilborn, J. One-stage tissue engineering of bladder wall patches for an easy-to-use approach at the surgical table. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19, 688-696 (2013).
- Engelhardt, E. M., et al. A collagen-poly(lactic acid-co-varepsilon-caprolactone) hybrid scaffold for bladder tissue regeneration. Biomaterials. 32, 3969-3976 (2011).
- Brown, R. A., Wiseman, M., Chuo, C. B., Cheema, U., Nazhat, S. N. Ultrarapid engineering of biomimetic materials and tissues: fabrication of nano- and microstructures by plastic compression. Adv Funct Mater. 15, 1762-1770 (2005).
- Fumagalli Romario, U., Puccetti, F., Elmore, U., Massaron, S., Rosati, R. Self-gripping mesh versus staple fixation in laparoscopic inguinal hernia repair: a prospective comparison. Surg Endosc. 27, 1798-1802 (2013).
- Muangman, P., et al. Complex Wound Management Utilizing an Artificial Dermal Matrix. Annals of Plastic Surgery. 57, 199-202 (2006).
- Ajalloueian, F., Zeiai, S., Fossum, M., Hilborn, J. G. Constructs of electrospun PLGA, compressed collagen and minced urothelium for minimally manipulated autologous bladder tissue expansion. Biomaterials. 35, 5741-5748 (2014).
- Orabi, H., AbouShwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: a preclinical study. Eur Urol. 63, 531-538 (2013).
- Blais, M., Parenteau-Bareil, R., Cadau, S., Berthod, F. Concise review: tissue-engineered skin and nerve regeneration in burn treatment. Stem Cells Transl Med. 2, 545-551 (2013).
- Serpooshan, V., Muja, N., Marelli, B., Nazhat, S. N. Fibroblast contractility and growth in plastic compressed collagen gel scaffolds with microstructures correlated with hydraulic permeability. J Biomed Mater Res A. 96, 609-620 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
