מחקרים בהתפתחות חיך מונעים על ידי את השכיחות של חיך שסוע, מומים מולדים שמטיל נטל בריאותי עצום ויכולים להשאיר נמשך השחתה. אנו מדגימים כאן טכניקה למדפי חך התרבות שיכול לשמש כדי לחקור מסלולי איתות שונים מעורבים בפיתוח חיך והיתוך.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטה של לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות
במאמר זה
סיכום
תקציר
שפה שסועה היא בין הנפוצים ביותר של כל המומים המולדים. הצורות המשניות החיך ממדפי mesenchymal מכוסה באפיתל ששומרות על צורת תפר אפיתל קו האמצע (MES). התיאוריות מציעות כי תאי MES מעקב אפיתל מעבר mesenchymal (EMT), אפופטוזיס והגירה, מה שהופך את החיך התמזגו 1. התפוררות מוחלטת של MES היא השלב החיוני הסופי של מפגש חיך עם סובבי תאי mesenchymal. אנו מספקים שיטה לתרבות איבר החיך. פיתחו בפרוטוקול מבחנה מאפשר הלימוד של התהליכים הביולוגיים ומולקולריים במהלך היתוך. היישומים של טכניקה זו הם רבים, ובכלל זה תגובות הערכה לחומרים כימיים אקסוגני, השפעות של גורמים רגולטוריים וצמיחה וחלבונים ספציפיים. יש תרבות איבר חיך מספר היתרונות הכוללים מניפולציה בשלבים שונים של פיתוח, שאינו אפשרי באמצעות במחקרי vivo.
מבוא
בתרי Orofacial הם המומים המולדים craniofacial הדומיננטיים ביותר. כמו כן, לוקח בחשבון את כל פגמי craniofacial האפשריים, אלה הם האנומליה הלידה השנייה בשכיחותו בתינוקות 2. חיך שסוע להתרחש בכ -1 מכל 700 לידות בארצות הברית (ארה"ב) בכל שנה, את השכיחות של חיך שסוע היא שווה 475 ילדים שנולדו עם חיך שסוע לחודש או 15 ילדים עם שסעים ליום 3. כ -1% מילדים שנולדו ברחבי העולם כל שנה תערוכת צורה כלשהי של dysmorphology craniofacial.
בתרי החיך והשפה צריכים הליך מאוד יקר ומסובך עם השלכות לכל החיים לחולים שיש להם את האנומליה הזו. העלות המשוערת לכל מטופל עם שסוע פה היא כ -100,000 $ 4. הטיפול בחולה עם שפה שסועה דורשת צוות של רופאים, כולל רופאים, מומחי אוזן וגרון, גנטיקאים, מרדימים craniofacial,דיבור בשפת פתולוגים, תזונאים, orthodontists, prosthodontists, פסיכולוגים, נוירוכירורגים, ורופאי עיניים.
בpalatogenesis, החך המשני נשאלת צמחים לזווג, אשר בתחילה לגדול בצורה אנכית ולעבור גובה מדף חיך מעל dorsum של הלשון. בעקבות העלאה, מדפי החך לזווג לגדול לכיוון קו האמצע (בE14.5 -E15 בעכברים ובשבוע 9 בבני אדם). אפיתל המדיאלי הקצה (MEE) המכסה את קצה המדף שומר יוצר תפר אפיתל קו האמצע.
זה ואחריו אפיתל מעבר mesenchymal ו / או אפופטוזיס לאפשר מפגש mesenchymal. הידבקות של MEE המנוגדים היא אירוע חיוני שינוי שגורם לחיך שסוע. עם זאת, רק מעט מחקרים בחנו את ההידבקות הראשונית של מדפי חך 5. צורות החיך קשות על ידי התמיינות של תאי mesenchymal לתא עצם. ההתפתחות לא תקינה של החיך יכול לייצר מפתחלא חיך עם או בלי מעורבות של השפה.
טכניקות תרבות איבר החיך היו בשימוש נרחב למעבדות רבות במהלך 30 השנים האחרונות 6,7.
בפרוטוקול זה אנו מתארים בפרטי שיטה של נתיחת חיך ותרבות איבר סטטי. היתרון של תרבות איבר חסרת תנועה הוא שהיא מאפשרת מדפי חך הפתיל. טכניקה זו הייתה בשימוש בהצלחה במעבדה שלנו לניסויי היתוך ואיתות רבים 8,9. עם זאת ההיקף של הטכניקה הוא עצום וניתן להשתמש בו בכל פעם שנדרשה מערכת תרבות איבר סטטי, כולל ההערכה של תגובות לחומרים כימיים אקסוגני, את ההשפעות של גורמי גדילת רגולציה במסלולים שונים וחלבונים ספציפיים.
ele סריקת איור 1. העכבר Palatogenesis. שלבי התפתחות של חיך העכברים. (BF)micrographs ctron (SEM) של החיך המשני בזמנים התפתחותי נציג. חיצים אדומים: להראות את החלק הראשוני של הידבקות חיך והיתוך. צהובים חצים: נקודה למרחב שבין החיך הראשי והמשני שייעלם לאחר ההיתוך (נדפס מ -11 קאופמן באישור PLoS ONE).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים המתוארים חייבים להתבצע בהתאם להנחיות והתקנות לשימוש בבעלי חיים בעלי חוליות, כוללים אישור מראש על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש המקומית.
1. הכנת מכשירי הביתור ותרבות מדיה
- כביסה מוקדמת כל המכשירים לשימוש בנתיחה עם מי חמצן 3% ולאחר מכן החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. סנן תקשורת BGJb עם פתרון אנטיביוטי וantimycotic באמצעות מסנן נקבובית בגודל 0.22 מיקרומטר עם שאיבת ואקום במנדף.
2. הכנת תרבות הציוד
- חותך מסנני קרום פוליקרבונט שיתמכו באיברי החיך במשולשים קטנים, לרסס עם אלכוהול 70% ולאפשר להם להתייבש. הכן צלחת המרכז-ובכן האיברים תרבות (60x15 מ"מ) על ידי הצבת רשת נקייה ומעוקרת שווה צלעות בצורת משולשת תיל (20 מ"מ) על צלחת תרבות איבר. ואז למלא היטב עם 1 מיליליטר של Bתרבות תקשורת תקשורת GJb. הערה: התקשורת צריכה להיות מספיק כדי להגיע לרמה של הרשת ללא הצללה החיך. מניחים את מסנני קרום, הצד מבריק כלפי מטה, על גבי הרשת (3-4 ממברנות לרשת) .Depending בניסוי, ניתן להוסיף טיפול (חלבונים, נוגדנים או מעכבים) לתקשורת
3. העובר עכבר איסוף והכנה לתרבות
- כדי להשיג עוברי עכבר סוג בר, שימוש בעיתוי 13.5 מתח רקע גנטי בהריון CD-1 עכבר. נקה את האזור לנתיחה עם אתנול 70%.
הערה: זנים אחרים של עכברים יכולים לשמש. אנחנו מעדיפים CD-1 עכברים בגלל מספר ההמלטה הגדולה יותר. - להרדים עכברים בהריון בE13.5 DPC (ימים שלאחר משגל) עם 5% Isoflurane אחריו נקע בצוואר רחם כדי להבטיח מוות באמצעות פרוטוקולים שאושרו.
- ריסוס אתנול 70% על פני בטן הגחון כדי להימנע מצורך שיער מקל הבטן למכשירים. לאחר מכן פתח את חלל בטן ventrallyבאמצעות מספריים חדים-הפעלה בוטה ומלקחי מיקרו לנתח כדי לאתר את הרחם. שימוש במלקחיים, להרים את כל הרחם ולהפריד אותו מהגוף על ידי חיתוך בגוף הרחם ובטיפים של קרן הרחם עם מספריים הפעלה אור.
- מניחים את הרחם על מגבת נייר נקייה על קרח (לדברי מדריך הפרוטוקול לטיפול ושימוש בבעלי החיים במעבדה). מכסה את הרחם עם מגבת נייר נקייה אחרת על מנת למנוע זיהום. לעקר את המכשירים באמצעות 70% אתנול תרסיס לפני שימוש נוסף. הרחם והעוברים יכולים להיות מועברים למעבדה על קרח.
- בזרימה למינרית פתוחה, להפוך בזהירות פתח קטן בצק החלמון באמצעות מספריים חדים-הפעלה בוטה ומלקחי מיקרו לנתח. הפוך את הפתיחה רחבה יותר ולאחר מכן בעדינות לדחוף אותו לexteriorize את העובר מן שק החלמון.
- מעבירים את העוברים מייד לצלחת פטרי עם pH הקר פוספט שנאגרו מלוח 1X (PBS) 7.4. כדי להבטיח את השלב, לשעבר הנכוןאמין העובר תחת מיקרוסקופ לנתח למורפולוגיה גוף, גודל הראש והגפיים.
הערה: עוברים שאינם בשלב הנכון של פיתוח אינם משמש לניסוי.
איור 2. איבר באד מורפולוגיה. קדמת הבמה והגפיים אחוריות נבדקות לתואר של כניסה חגורה בין הספרות. בE13.5, כל condensations הספרות בולט, עם חגורה וחריצי דיסטלי בין ספרות המופיעים מאוד ברורים. הספרות האחורית היא מאחורי בחצי יום 12 שורה עליונה:. Forelimb, שורה תחתונה: גפיים אחוריות.
4. חך Dissection
- הנח עובר אחד בכל פעם בצלחת פטרי עם PBS תחת מיקרוסקופ לנתח. מספריים שימוש קטנים לנתח ופינצטה להפריד את הראש מהגוף של העוברים.
- מחזיק בזהירות את גולגולת העכבר מעל גובה עיניים עם מלקחיים (הימנעותתהליך הלסת) לעשות שני חתכים בשני הצדדים של קו השפתיים. ואז להסיר את הלסת התחתונה ולשון. לבודד את אזור לסת תהליך על ידי ביצוע חתך בגובה עיניים ולהסיר את המוח, עיניים, מחיצת האף ורקמות הסמוכות.
רקמת 3. חך איור נאספה מ13.5 עוברים, כאשר מדפי החך שהעלו, אך לא יצרה קשר. מדפי החך הונחו בתרבות איבר במסנן בממשק תקשורת האוויר במשך 72 שעות במודל הסטטי. (א) רמה של כוכבי נתיחה על עובר E13.5. (ב) הכחולה לתחום אזורים להחזיק את הרקמה עם מלקחיים במהלך נתיחה. צפה (C) של מדפי חך גזור מונחים על קרום מסנן טרפז. מבט צד (D) של צלחת התרבות אחרי המיקום של חיך גזור ותוספת של תקשורת ותרבות.
- הנח את צד הפה החיך ולהסיר את מחיצת האף ורקמות סביבו, שמירה על החיך העיקרי המצורף כדי לסייע לה להתמצא מקדמי לאחורית. השתמש במרית כף ולהעביר בזהירות רבה את מדפי החך (צד האף למטה) למסננים מוכנים ברשתות במנות התרבות. הערה: התאם את עוצמת קול של מדיה כדי לאפשר ממשק אוויר תקשורת נכון.
- מתחת למיקרוסקופ סטריאו, לנתח את החיך הראשוני ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את מדפי החך קרובים אחד לשני. מדפי החך לא הפתיל אם הם לא ממוקמים במגע. חותך את מסנן הקרום המשולש שבו החלק הקדמי של החך ממוקם. צורת הטרפז תסייע באיתור החלק הקדמי של החך.
- תרבות מדפי חך בנפרד או עם שתיים או שלושה באותו צלחת תרבות איבר באמצעות תקשורת ותרבות BGJb.
5. מדפי Culturing עכבר Palatal
- דגירה tissues על 37 מעלות צלזיוס בתערובת humidified גז (5% אוויר CO 2 ו -95%) במשך 72 שעות, ולשנות את המדיום כל שעה 24.
6. חך עיבוד לניתוח היסטולוגית
- לתקן את החיך לאחר 72 שעות בתרבות עם 4% פורמלדהיד / O פוספט שנאגרו מלוח / N ב 4 ° ג ואז, בעדינות עם טפטפת העברה לשטוף את הרקמה בצלחת התרבות עם PBS. לעטוף את החך בפיסת מגבוני מעבדה ומקום בהטבעת קלטות.
הערה: גלישת החיך במגבוני מעבדה למנוע האובדן שלהם במהלך תהליך ההתייבשות. - מייבש את הרקמה הבאה 70%, 80% ועד 100% אתנול שוטף עבור שעה 1, ואחריו את הליך הטבעת פרפין הרגיל. להטבעה, תניח את החלק הקדמי של החך מול המגש.
- חותך 6 מיקרומטר סעיפים סידוריים בכיוון העטרה מקדמי לאחוריים. חיך סעיף שלם יניב 350-450 sectiהרחבות. להכתים את החלקים עם hematoxylin ו eosin (H & E). בקנה מידה 10 כל סעיף 20 ה באמצעות ציון ממוצע היתוך שתואר לעיל (MFS) (טבלת 1). 8
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הטכניקה יכולה להיות מיושמת על סוגים שונים של המחקר הבא experiments.The שונים נועד לבחון את ההשפעה של ניקוטין טרטוגניות במבחנה על היתוך חיך. שני זנים של עכברים שמשו לניסוי זה, CD1 ורקמת C57.Palatal טופל ב0.06 ו -6 מ"מ ריכוזים של hemisulfate ניקוטין. היה נראה כי דפוסי היתוך חיך ועיתוי היו שונים בשני הזנים השונים. בעכברי CD1, מדפי חך מקבוצת הביקורת המשיכו היתוך באופן תלוי בזמן. עם זאת, בקבוצה שטופל היתוך הניקוטין התעכב במיוחד בריכוז ניקוטין 6 מ"מ (איו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול במאמר זה מספק שיטה של לנתח מדפי חך מעוברים ביום עוברי 13.5. מדפי חך מעוברי עכברים היו בתרבית בתקשורת ותרבות סרום ללא באווירה של 95% O CO 2 5% 2 על 37 מעלות צלזיוס. נתיחת חיך מוצלחת תלויה באופן קריטי על גורמים רבים בכל שלב במהלך ההליך מרגע העוברי של העכברים מורדמים להשלמת התרבות. אחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על היתוך חיך הוא הזמן שלוקח כדי להתחיל את תרבות האיבר; עוברים צריכים להיות ביום עוברי 13.5 כמדפי חך המשניים הם אופקיים, אבל לא התחילו הפ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
לכותבים אין שום אישור.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| BGJb | Invitrogen | ||
| פניצילין/Streptomycin | Lonza Inc. | 17-602E | 100X |
| צלחות פטרי | VWR | 25384-088 | 100 x15 מ"מ |
| צלחת תרבית איברים מרכזית | בז | #353037 | 60 x15 מ"מ |
| רשת משולשת חוט | בהתאמה אישית עם רשת תיל נירוסטה כדי להתאים היטב לכלי תרבית האיברים. | ||
| פילטר פוליקרבונט | GE& טכנולוגיות מים ותהליכים | K04BP04700 | שחור 0.4 מיקרון, 47 מ"מ |
| מיקרוסקופ סטריאו | ZEISS קפוצ'ון תרבות Stemi SR | ||
| NUAIRE Laminar Flow | |||
| מלקחיים מיקרו-ניתוחים | Dumont Medical | #5 | |
| מספריים מיקרו-ניתוחים | Kent Scientific Corporation | INS14003-G | מספריים Vannas, ישרים, אורך 8 ס"מ, קצות 0.1 מ"מ, להבים 5 מ"מ, |
| מספריים מיקרו-חיתוך | Kent Scientific Corporation | INS500086 | Vannas מספריים, ישרים, אורך 8.5 ס"מ, 0.025 מ"מ x 0.015 מ"מ קצות, להבים 7 מ"מ |
| מספריים מיקרו-חיתוך Kent | Scientific Corporation | INS14127-G | מספריים קפיציים מעוקלים מעוקלים, אורך 10.5 ס"מ, להבים 8 מ"מ, תוצרת גרמניה |
| קורט כירורגי (מרית כף) | Hu-friedy | CM 2/4 | |
| מכסה מעבדה מגן | Labconco | ||
| Thermo Scientific | |||
| Farma Series11 חממת מעיל | |||
| CO2 | |||
| PBS | גיבקו | 10010-023 | פי 1 |
| סיבים אופטיים מקור אור | סיבים דולן-ג'נר | PL-750 | |
| קלטת הטמעה | מגבוני קים Statlab | EC301 | |
| VWR | 470173-504 |
מקורות
- Nawshad, A. Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).
- Strong, E. B., Buckmiller, L. M. Management of the cleft palate. Facial plastic surgery clinics of North America. 9, 15-25 (2001).
- Witt, P. D., Marsh, J. L. Advances in assessing outcome of surgical repair of cleft lip and cleft palate. Plastic and reconstructive surgery. 100, 1907-1917 (1997).
- 4miloro, principles of oral and maxillofafcial surgery. 209, 231-249 (1984).
- Mima, J. Regulation of the epithelial adhesion molecule CEACAM1 is important for palate formation. PloS one. 8, e61653(2013).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro an analysis by DiI labelling and confocal microscopy. Development (Cambridge, England). 114, 379-388 (1992).
- Ferguson, M. W., Honig, L. S., Slavkin, H. C. Differentiation of cultured palatal shelves from alligator chick and mouse embryos. The Anatomical record. 209, 231-249 (1984).
- San Miguel, S. Ephrin reverse signaling controls palate fusion via a PI3 kinase dependent mechanism. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 357-364 (2011).
- Kang, P., Svoboda, K. K. PI 3 kinase activity is required for epithelial mesenchymal transformation during palate fusion. Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 316-322 (2002).
- RD, L. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry. , 3rd edn, McGraw Hill Book Co. New York. (1965).
- Kaufman, M. H. The Atlas of Mouse Development. , Elsevier. (1992).
- Taher, L. Global gene expression analysis of murine limb development. PloS one. 6, e28358(2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
