הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

8.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53070

⸱

15 ביולי 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Imaging and Metabolism, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים בדיקת רגישות לתרופות בתפוקה גבוהה עבור תאי מיאלומה נפוצה ראשוניים. הוא מורכב משחזור של מיקרו-סביבת מח העצם (כולל מטריצה חוץ-תאית וסטרומה) בצלחות מרובות בארות, ושיטה לא פולשנית לכימות אורך של כדאיות התא.

תקציר

בעבודה זו אנו מתארים גישה חדשנית המשלבת לשעבר מבחני רגישות תרופת vivo וניתוח תמונה דיגיטלי להעריך chemosensitivity וההטרוגניות של מיאלומה נפוצה תאים (MM) המופק מחולה. גישה זו מורכבת בזריעת תאי MM עיקריים חילוץ טרי מaspirates מח עצם לתאי microfluidic מיושמים בצלחות רב גם, כל אחת בהיקף של בנייה מחדש של מייקרו-סביבת מח עצם, כולל מטריקס (Matrix קולגן או קרום במרתף) וסטרומה (פונות תאי גזע המופקים mesenchymal) או תאי האנדותל אדם נגזר (HUVECs). התאים מסוממים עם סוכנים וריכוזים שונים, והם צילמו ברצף במשך 96 שעות באמצעות מיקרוסקופ שדה הבהיר, במיקרוסקופ ממונע מצוידים במצלמה דיגיטלית. תוכנת ניתוח תמונה דיגיטלית מזהה תאי חיים ומתים מנוכחות או עדר של תנועת קרום, ומייצרת עקומות של שינוי בכדאיות כo פונקציהF ריכוז תרופה וזמן חשיפה. אנו משתמשים במודל חישובים כדי לקבוע את הפרמטרים של chemosensitivity של אוכלוסיית גידול לכל תרופה, כמו גם את המספר של תת-אוכלוסיות הנוכחיות כמדד להטרוגניות גידול. מודלים מותאמי מטופל אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לדמות משטרי טיפול ולהעריך תגובה קלינית.

מבוא

מטרתה של שיטה זו היא לאפיין את רגישות התרופה של מיאלומה נפוצה (MM) תאים ראשוניים לפנל של סוכנים לשעבר vivo, קרוב ככל האפשר לתנאים פיסיולוגיים, ועם דיוק די בכך שתוצאות אלה יכולים לשמש לזיהוי תת עמיד לכימותרפיה." אוכלוסיות בניטל הגידול וסופו של דבר, לparameterize מודלים חישוביים נועדו לאמוד תגובה קלינית.

מודלים חישוביים הם כלים רבי עוצמה לניתוח מערכות מורכבות, כגון אינטראקציות סרטן-מארח-טיפול. עם זאת, מודלים הם רק טובים כמו הנתונים המשמשים לparameterize. למרבה הצער, רוב המידע זמין בספרות לא ניתן להשתמש בצורתה הנוכחית לparameterize מודלים כאלה, כפי שהם לעתים קרובות מתקבלים בתנאי ניסוי סותרים. כך, ניסויים חדשים נדרשים לעתים קרובות במטרה להשיג את הסט של פרמטרים ניסיוניים צורך. רוב מבחני הכדאיות, לעומת זאת, הם הרסניים והשלנו מוגבל למספר קטן של נקודות זמן, לעתים קרובות רק אחד. זה מציב מכשול באופן משמעותי את השימוש במבחני chemosensitivity לparameterize מודלים חישוביים, מאז ניסויים כאלה אינם מספקים מידע על הדינמיקה הזמנית של המערכת. זה נכון במיוחד עם תאי סרטן ראשוניים, אשר לעתים קרובות מוגבלים לכמה מיליון לדגימה, ויש תוחלת חיים קצרות לאחר ביופסיה, ובכך להגביל את מספר תנאי ניסוי זמינים. בנוסף, רוב מבחני כדאיות דורשים ההפרדה של הסרטן מהתאים שאינם סרטני (סטרומה) ​​בזמן של כימות, אשר מוסיפה עבודה נוספת לפרוטוקול, נוסף מדאיגה את התאים, ומגביל את מספר הניסויים שניתן לבצע .

לפני 40 שנים, סלמון ומשתפי פעולה 1 מוצעת המפורסם שלהם בassay הקמת המושבה מבחנה להערכת chemosensitivity של תאים סרטניים. למרבה הצער assay זה מצא מעורב הצלחה בשל המספר הקטן של mye מרובהדגימות חולה לומה (MM) שהיו מסוגלים להרכיב מושבות בתנאי שליטה: הערכה היה שתת-קבוצה קטנה בלבד של 0.001% ל -0.1% מתאי MM היתה מסוגל שכפול, שכפי שכונו בתאי גזע מסוג מיאלומה נפוצה 2. זה מוגבל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של assay ומספר התרופות שיכולים להיבדק בפעם אחת, אפילו יותר דגמים אחרונים 3. בעיה זו היא הרבה יותר חשובה עכשיו כאשר סוכני MM (סטנדרטיים או ניסיוניים) הם רבים יותר מאשר לפני ארבעה עשורים.

מגבלה עיקרית של מבחני המוקדמים אלה היא התפוקה שלהם dichotomized: או חולה הוא "רגיש" או "עמיד" לתרופה מסוימת. אין מידע מסופק בדבר מידת הרגישות וההטרוגניות של אוכלוסיית הגידול. לפיכך, חולים עם תת-אוכלוסיות קטנות של תאים עמידים בצמיחה מהירה יסווגו כ" רגיש "לטיפול, אבל היה להרע זמן קצר, ולכן לא בןefit מטיפול. לאור החשיבות של משך התגובה בהישרדות כוללת (OS) של חולי סרטן 4,5, ברור איך מבחני אלה לא היו מסוגלים להעריך כראוי OS באופן עקבי.

כדי לעקוף מגבלות אלה, וכדי להיות מסוגלים לייצר מודלים חישוביים מטופל ספציפי שמעריכים תגובה קלינית אישית לפנל של תרופות, פיתחנו שיטה לרגישות סמים בדיקות לא הרסני של מיאלומה נפוצה שורות תאים (MM) ותאי MM עיקריים בשיקום vivo לשעבר של מייקרו-סביבת מח העצם, כוללים מטריצה ​​וסטרומה 6 תאיים. assay זה, עם זאת, היה ההגבלה להסתמך על שקופית מסוימת מסחרית microfluidic, שממדים ועלות הגביל את מספר הניסויים או תרופות שיכולים להתבצע באחת בפיסת הציוד שניתן.

המערכת שתוארה כאן משתרעת assay המקורי זה לגבוה-throughput פלטפורמת organotypic מנה-תגובה, להקרנה במבחנה של תרופות, המבוססים על אלגוריתם ניתוח תמונה דיגיטלי שאינו הרסני לכמת כדאיות תא. כל טוב ב384 או 1,536 גם צלחות הוא שחזור 3D של מייקרו-סביבת מח העצם, כוללים תאים ראשוניים MM, מטריקס, וגורמי סטרומה וצמיחה המופקת מחולה. מיקרוסקופיה חי וניתוח תמונה דיגיטלי המשמשים לאיתור אירועי מוות של תאים בריכוזי תרופה שונים, המשמשים ליצירת משטחי מנה-תגובה. מהנתונים במבחנה, מודל מתמטי מזהה את הגודל וchemosensitivity של תת-אוכלוסיות בתוך נטל הגידול של המטופל, וניתן להשתמש בו כדי לדמות כיצד הגידול יגיב לתרופה (ים) בתנאים פיסיולוגיים במשטר קליני 6 ( איור 1).

החידושים העיקריים של פלטפורמה זו הם: (א) מספר הקטן של תאי הסרטן הנדרשים (1,000-10,000 לconcent סמיםמנה); (ב) הערכת יעילות תרופה בתנאים פיסיולוגיים (מטריקס, סטרומה, גורמי גדילה המופק ממטופל); (ג) לא רעיל מסמני כדאיות 7 מאז רק הדמיה שדה בהירה משמש, ובכך אין צורך transfect תאים עם הקרינה 8 או 9 פליטת אור; (ד) הדמיה רציפה מספקת אפקט תרופה כפונקציה של ריכוז וחשיפת זמן (פרמקודינמיקה); ו- (ה) השילוב בין במבחנה ומודלים חישוביים אבולוציוני, להעריך את התוצאות קליניות 6 (סילבה et al., בהכנה).

הגורם המרכזי המאפשר את אלגוריתם ניתוח תמונה הדיגיטלי להבחין סרטן מתאי סטרומה הוא הזיקה שונה שלהם לתחתית באר: תאי MM אינם דבקים, ויישארו בהשעיה במטריצה, ואילו תאי סטרומה לדבוק בתחתית גם ואז למתוח.

הפרדה זו מתרחשת למרות שMM וסטרומהמחדש נזרע באותו הזמן, ומתרחש במהלך תהליך O / N של דגירה. הזריעה של הצלחת מסתובב למטה בצנטריפוגה הבאה נוספת מאיצה את התהליך הזה. כתוצאה מכך, תאי MM מופיעים בתמונה כדיסקים בהירים עגולים מוקפים בטבעת כהה, בעוד סטרומה שומרת על פרופיל נמוך וגוון כהה יותר (איור 2). לפיכך, assay במתכונתה הנוכחית הוא מתאים ביותר לתאי סרטן שאינו חסיד, למרות התאמות באלגוריתם יכולות להיעשות לסרטן וסטרומה נפרדים המבוססות על תכונות מורפולוגיות אחרות, כגון גודל וצורה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שני סוגים של מטריקס (קולגן ומטריצת קרום במרתף), כמו גם שני סוגים של שיתוף תרבויות, עם BMSC (תאי גזע mesenchymal מח עצם נגזר) וHUVECs, המייצג את נישות ביניים וperivascular של מח העצם , בהתאמה.

שימוש בצלחת 384 גם, 5 ריכוזים לסמים ושתי חזרות, הצלחנו TESלא עד ליום 31 בסמים שונים עם המדגם של מטופל יחיד. בצלחות 1,536 היטב מספר זה הוא 127. איור 3 מתאר את הפריסה המשמשת כיום לזריעת תאים ידנית, ואילו איור נוסף 1 מייצג את החלוקה האופטימלית באמצעות pipettor רובוטית. בעיצוב מאיור 3, כל צלחת 384 גם יכולה לשאת 3 דגימות חולה עם 7 תרופות שונות, או מדגם אחד חולה נבדקו עם 21 תרופות. כל תרופה מיוצגת על ידי 5 ריכוזים, וכל מצב הוא זורעים בכפילויות. 4 בארות שליטה (אין תרופה הוסיפה) הם זורעים לכל סט של 7 תרופות (למשל, בארות 36-39, 126-129 ו200-203). כדי להבטיח את העוצמה של התרופות המשמשות, שורת תאי מיאלומה האנושית (למשל, H929 או MM1.S) היא גם זרע, ומסומם בכפילויות בריכוז הגבוה ביותר של כל אחד מהתרופות המשמשות (בארות 76-89). הביקורת החיובית קו התא מבטיחה כי יש לי התרופות המשמשות עוצמה מספקת, שכן עקומות תגובת המינון שלהם הן AC הדומהניסויי רוס. שתי בארות הם זורעים עם שורת תאי מיאלומה כשליטה לתנאי הסביבה, במילים אחרות, כדי לזהות בעיות אפשריות בחממת הספסל העליון במהלך ההדמיה (בארות 75 ו -90). הספירה של הבארות כדלקמן דפוס זיגזג כדי לצמצם את המרחק מכוסה על ידי הבמה הממונעת של המיקרוסקופ, אשר מפחיתה את זמן רכישה ומפחיתה בלאי של הציוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש בתאים אנושיים הנגזרים מביופסיות כמפורט להלן אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדית של מופיט ונערך תחת הניסוי הקליני # MCC 14745 נערך במרכז H. Lee Moffitt הסרטן ומכון מחקר.

1. מיון של תאי MM ממח העצם aspirates

  1. לאסוף aspirates מח עצם (20 מיליליטר) מחולים במזרק הפרין נתרן.
  2. בודד תאי mononuclear ידי צנטריפוגה מח מדולל (1: 1 עם PBS סטרילי) על שיפוע צנטריפוגה הבינוני המימי סטרילי ב 400 XG למשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה.
  3. לאסוף את הממשק, המכיל את תאי mononuclear. לשטוף את התאים עם PBS הקר ולספור באמצעות hemocytometer או נגד תא אוטומטי, באמצעות trypan הכחול לקביעת כדאיות.
  4. הכן שקופית דקה שכבת הכנת תא 10 וכתם עם כתם רייט-Giemsa להעריך אחוז תאי פלזמה 11.
  5. לחשבהסכום של חרוזים CD138 לשמש בסיס מספר התאים ואחוז תאי פלזמה. אם מתחילים מדגם הוא פחות מ -20% תאי פלזמה, אז מחדש להשעות תאים באמצעות 90 μl של חיץ הפרדה ו -10 μl של חרוזים CD138 לכל 5 x 10 6 תאים. אם מתחילים מדגם הוא יותר מ -20% תאי פלזמה, resuspended באמצעות 80 μl של חיץ הפרדה ו -20 μl של חרוזים CD138 לכל 1 x 10 7 תאים.
  6. דגירה תאים עם חרוזים על 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  7. עובר תאים דרך מסננת 35 מיקרומטר הוסיפו הפרדה מראש רטובה-עמודות (LS) ממוקמות במפריד השדה המגנטי (ראה רשימה של חומרים).
  8. הסר עמודה ממגנט. איסוף תאים שנבחר CD138 ידי שטיפת העמודה 3 פעמים עם 1 מיליליטר של חיץ הפרדה.
  9. להעריך העשרת CD138 עם עוד הכנת תא דקה שכבה מוכתמת להחליק 10.
  10. פלזמה מסנן מתקבלת מביופסיה מח עצם מכל חולה עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. השתמש פלזמה טרימאותו החולה כתאי CD138 +.
  11. הכן תקשורת לניסוי על ידי השלמת RPMI-1640 עם סרום 10% חום מומת שור עוברי, 10% פלזמה מטופל ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין.
  12. לאסוף את הזרימה דרך מהבחירה (CD138-) ובצע את שיטת ההדבקה הקלסית 12 כדי לבחור עבור תאי mesenchymal מח עצם (BMSCs). מכיוון שתהליך זה דורש שבועות לפני BMSCs מוכן לשימוש, יש צורך יש לי BMSCs מוכן מחולים קודמים או תורמים בריאים.

2. תאי זריעה בצלחות (באמצעות pipettor רב-ערוצים ידני)

  1. השתמש בצלחת רב גם (384 או 1,536) עם קירות שחורים ותחתית שטוחה שקופה, מעדיף אחד מותאמת ליישומים אופטיים ותרבית תאים.
  2. שיתוף תרבות BMSCs עם תאי MM באו אני סוג קולגן או מטריצת קרום במרתף, לעומת זאת, דורשים HUVECs מטריצת קרום במרתף.
  3. שמור את הצפיפות הסופית של כל סוג תא במגוון הבא: 3 x 10 5 תאים / מיליליטר לשורות תאי MM, 2 x 10 5 תאים / מיליליטר לHUVECs או BMSCs, ו -2 x 10 6 תאים / מיליליטר לתאי MM-נגזר מטופל.
    הערה: צפיפות אלה הן התוצאה של ניסוי אופטימיזציה כדי לאפשר לאיכות הגבוהה ביותר האפשרית התמונה וזמן הדמיה הארוכה ביותר האפשרי, תוך שמירה על רלוונטיות ביולוגיות במבחנים. שורות תאי MM הם זורעים בצפיפות נמוכה מתאי MM העיקריים בשל שיעורם במהירות רבה יותר ושכפול בגודל גדול יותר.
  4. שיתוף תרבות של תאי MM עיקריים עם BMSCs:
    1. הכן 100 aliquots μl של טרום-טכניקה מעורבת הכולל 20 μl של 10x ממ, 20 μl של H 2 O deionized, 10 μl של 7.5% פתרון סודיום ביקרבונט, ו- 50 μl של 1x RPMI 1,640 חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. בזמן זריעת הצלחות עם תאי MM, לערבב aliquots של טרום-טכניקה מעורבת עם 150 μl של 3.1 מ"ג / מיליליטר סוג קולגן שור אני לנפח סופי של 250 μl.
    3. Re-תליוניםבסופו של 50 μl של תאים בRPMI 1,640 בשש פעמים הצפיפות הרצויה הסופית.
    4. מערבבים להשעיה תא עם תערובת קולגן ליצירת נפח סופי של 300 μl בעזרת פיפטה P200.
    5. בעזרת פיפטה ידנית או מהדר, להפקיד ירידה של 8 μl של תא סופי / תערובת מטריצה ​​במרכז של כל אחד גם בצלחות 384 גם, או 2 μl בכל טוב של 1,536 צלחות היטב (ראה שלב 2.6 לדוגמא של סידור המרחבי בארות).
    6. צלחת צנטריפוגה למשך 2 דקות ב XG 500 לרכז את כל התאים באותו מישור המוקד במהלך הדמיה.
    7. השאר צלחת בחממה (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס) במשך שעה 1, לפילמור ג'ל.
    8. להוסיף 80 μl של תקשורת צמיחה בתוספת (RPMI-1640, 10% HI FBS, פלזמה נגזר חולה 10%, P 1% / S) צלחות לכל טוב ב384 גם, או 8 μl בצלחות 1,536 היטב.
    9. השאר O צלחת / N בחממה (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס) במשך הידבקות של סטרומה לתחתית הצלחת.
  5. שיתוף מ"קlture של תאי MM עיקריים עם HUVECs:
    1. מטריצת קרום במרתף העברה מC -80 ° לדלי עם קרח להפשיר.
    2. ספירה מחדש להשעות תאים ראשוניים וHUVECs בתקשורת RPMI-1640 ב 4 פעמים את הצפיפות הסופית, כל אחד בצינור נפרד.
    3. מערבבים תאי חולה וכרכי HUVECs ב1: שיעור 1.
    4. ברגע שמטריצת קרום במרתף מופשרת, אבל עדיין לא polymerized, לערבב 1: 1 עם תערובת תא מהשלב קודם.
    5. טיפות זרע עם נפח מספק של תערובת התא-מטריקס במרכז כל הטוב (8 μl לצלחות 384 גם וμl 2 צלחות 1,536 היטב, ראו שלב 2.6 לדוגמא של סידור המרחבי של בארות).
    6. צלחת צנטריפוגה XG ב 500 במשך 10 דקות.
    7. צלחת מקום בחממה (5% CO 2, 37 מעלות צלסיוס) במשך שעה 1 לפילמור מטריצה.
    8. הוסף מדיה צמיחה (RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 10% פלזמה מטופל ו -1% P / S) זה טוב (80 μl לצלחות 384 גם, 8 μl ל1,5צלחות 36-היטב).
    9. השאר O הצלחת / N בחממה (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס) במשך הידבקות של HUVECs לתחתית הצלחת.
  6. זרעי צלחת 384 גם. איור 3 מתאר פריסה המרחבית טיפוסית של זריעה.
    1. החל מיום B2 גם, זרע עמודות רבות כמו תרופות להיבדק. בדוגמא של איור 3, להשתמש שבע תרופות.
    2. כדי לשמש זריעה כמה פעמים שריכוזים חזרו. בדוגמא באיור 3, להשתמש חמישה ריכוזים.
    3. זרעי ארבע בארות יותר לתנאי שליטה.
    4. חזור על שלבים 2.6.1 ו2.6.2 ללשכפל השני.
    5. חזור על השלבים 2.6.1 ל2.6.4 עבור כל מדגם מטופל להיבדק בצלחת.
    6. זרעי שורת תאי MM בשתי שורות של בארות, כל אחד עם בארות רבות כמו תרופות שנבדקו (בשני עותקים). כל אחד מבארות אלה יטופל עם הריכוז הגבוה ביותר של כל תרופה על מנת להבטיח שמניית שימוש אין סופית הולמתCY (ראה איור 3 לדוגמא).
    7. בארות זרע שתי עם שורת תאי MM לשמש כשליטה של תנאי ניסוי, כגון תפקוד תקין של החממה העליונה הספסל, תקשורת צמיחה, וכו '.

3. זריעת תאים בצלחות (באמצעות pipettor רובוטית)

הערה: זו סדרה של זרעי צעדי צלחת 384 גם באמצעות pipettor רובוטית. העיצוב של הצלחת מתואר באיור 1 נוסף, שבו תאי MM עיקריים נבדקים נגד פנל של 31 תרופות שונות בריכוזים שונים בחמישה שני משכפל, בתוספת ביקורת שלילית. שורת תאי זרע גם כביקורת חיובית להערכת יעילות תרופה ונבדקה כנגד כל 31 התרופות בריכוז הגבוה ביותר, בשתי חזרות. הקבצים שסופקו למותג ודגם מסוימים (ראה טבלת חומרים) אבל האלגוריתם יכול להיות מותאם לכל pipettors רובוטית.

  1. שיתוף התרבות של תאי MM העיקרייםים עם BMSCs:
    1. הכן שפופרת 15 מיליליטר בהיקף של 240 μl של 10x ממ, 240 μl של H 2 O deionized, 120 μl של 7.5% פתרון סודיום ביקרבונט, 600 μl של 1x RPMI 1,640 1.8 מיליליטר של 3.1 מ"ג / לייבל I. סוג קולגן שור מיליליטר צינור כ" טרום-תערובת לCD138 + ". מניחים על קרח עד לשימוש.
    2. הכן צינור 1.5 מיליליטר בהיקף של 50 μl של 10x ממ, 50 μl של H 2 O deionized, 25 μl של 7.5% פתרון סודיום ביקרבונט, 125 μl של 1x RPMI 1,640 375 וμl של 3.1 מ"ג / לייבל I. סוג קולגן שור מיליליטר צינור כ" טרום-תערובת עבור קו תא ". מניחים על קרח עד לשימוש.
    3. מחדש להשעות 300 μl של CD138 + תאים בRPMI 1,640 בשש פעמים הצפיפות הרצויה הסופית. מחדש להשעות 300 μl של תאי BMSC בRPMI 1640 בשש פעמים הצפיפות הרצויה הסופית. מערבבים שני הכרכים יחד בצינור 1.5 מיליליטר ותווית "CD138 +". מניחים בחממה עד לשימוש.
    4. מחדש להשעות 60 μl שלשורת תאים בRPMI 1640 בשש פעמים הצפיפות הרצויה הסופית. מחדש להשעות 60 μl של תאי BMSC בRPMI 1640 בשש פעמים הצפיפות הרצויה הסופית. מערבבים שני הכרכים יחד בצינור 1.5 מיליליטר ותווית "קו סלולארי". מניחים בחממה עד לשימוש.
    5. שימוש בתוכנה שסופקה עם pipettor רובוטית, לטעון את הקובץ הראשון תסריט, "cell_seedingPt47.PGM". מניחים קופסא 200 μl קצה פיפטה, צלחת microtiter, וצלחת גם סטרילי 384 בתחנות, B ו- E, בהתאמה, של הרובוט.
    6. מערבבים את התוכן של צינורות "טרום-תערובת לCD138 +" ו "CD138 +". העבר 1.5 מיליליטר של התוכן שלה ולמס '1 של צלחת microtiter. מניחים את הצינור עם נפח שנותר על קרח. הפעל את התכנית. רובוט זרע 176 הבארות הראשונות (11 השמאלית ביותר העמודות) של צלחת 384 גם ואז נעצר. העבר את הנותר של הצינור על קרח ולמס '2 של צלחת microtiter. לחדש את התכנית.רובוט זרע 144 הבארות הנותרות של צלחת 384 גם והפסקה.
    7. מערבבים את התוכן של צינורות "טרום-תערובת עבור קו תא" ו- "קו סלולארי" ולהעביר תכנים ולמס '3 של צלחת microtiter. קורות חיים תכנית. רובוט זרע 64 הבארות הנותרות של צלחת 384 גם.
    8. מניחים צלחת 384 גם בצנטריפוגות במשך 10 דקות ב 500 XG ו4 מעלות צלזיוס. העברת צלחת חממה (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס) במשך שעה 1 לפילמור קולגן.
    9. טען את קובץ התסריט השני, "media_layer.PGM". הנח תיבת קצה פיפטה 120 μl, מאגר מגיב עם 31 מיליליטר של RPMI-1640 בתוספת 10 FBS%, 10% פלזמה מטופל ו -1% P / S, ואת צלחת 384 גם עם תאים לתחנות, B ו- E, בהתאמה. הפעל את התכנית. הרובוט יעביר 81 μl של תקשורת לכל אחד. ברגע שסיים, להעביר צלחת 384 גם לחממה ולאפשר סטרומה לדבוק למצע O / N.

4. תרופות הכנה וסימום של צלחות (באמצעות pipettor רב-ערוצים ידני)

  1. הכן תבנית דומה לאיור 3 כדי להקל על התהליך של הוספת תרופה לבארות ולהפחית את הסיכוי של בלבול.
  2. הכן, בצלחת 96-היטב, דילול סדרתי של כל אחת מהתרופות כדי להיבדק בצלחת, למשל, במשך חמישה ריכוזים באמצעות דילול של פי 3:
    1. להוסיף 120 μl של תרופה ב10x הריכוז הרצוי בריכוז הגבוה ביותר גם. לדוגמא, השתמש 500 מיקרומטר melphalan אם את הריכוז הגבוה ביותר של התאים יהיו חשופים בצלחת יהיה 50 מיקרומטר.
    2. להוסיף 80 μl של תקשורת צמיחה (RPMI בתוספת 10% FBS, 10% פלזמה נגזר מטופל ופניצילין 1% / סטרפטומיצין (P / S)) לארבע בארות שלאחר מכן.
    3. העברה 40 μl מהבאר הראשונה לשני ומערבבים, בהיקף כולל של 120 μl ב1/3 של ריכוז התרופה של הבאר הראשונה, או 167 מיקרומטר.
    4. חזור על שלב 4.2.3 לבארות הנותרות (למשל, להעביר 40 μl משני לשלישי, לערבב, ולאחר מכן להעביר 40 μl משלישי לרביעים, וכו ').
  3. העבר 8 μl מכל תרופה המכילה גם למתאים היטב בצלחת התא. כל תרופה המכילה גם צריכה להיות מספיק נפח 10 בארות בצלחת התא. בדוגמא של איור 3, כל ריכוז תרופה מתווסף 6 בארות שונות, פרט לריכוז הגבוה ביותר, אשר מתווסף ל8 בארות.
  4. הוסף 8 μl של תקשורת צמיחה (RPMI בתוספת 10% FBS, 10% פלזמה נגזר מטופל ו -1% P / S) לבארות שליטה.
  5. תאי מקום במיקרוסקופ בהקדם מוכן ולהפעיל את הדגירה העליונה ספסל.

5. תרופות הכנה וסימום של צלחות (באמצעות pipettor רובוטית)

  1. הורד קבצי תסריט לpipettor רובוטית מhttp://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS Files.zip
  2. טען את התסריט "media_layer_DRUGPLATE.PGM" בממשק משתמש pipettor רובוטית. הנח תיבת קצה פיפטה 120 μl, מאגר עם 21 מיליליטר של RPMI-1,640 בתוספת 10% FBS, 10% פלזמה מטופל ו% P 1 / S וצלחת 384 גם ריקה בתחנות, B ו- E, בהתאמה. הפעל את התכנית, pipettor רובוטית יוסיף 30 μl של תקשורת לכל הבארות בצלחת 384 גם.
  3. בעקבות התבנית מאיור 2 נוסף להוסיף 200 μl של תרופה ב20x ריכוז מרבי היטב בכל צלחת microtiter. התקנה זו יכולה להכיל עד 31 תרופות. לשליטה טובה (CTRL), להוסיף RPMI-1640 בתוספת 10% FBS, 10% פלזמה מטופל ו -1% P / S.
  4. מניחים קופסא 120 μl קצה פיפטה, צלחת microtiter עם סמים ב20X ריכוז, וגם 384 עם תקשורת (משלב 5.1) בתחנות, B ו- C, בהתאמה. טען את התכנית "drug_plate.PGM". Pipettor רובוטית ייצור דילול סדרתישל 1: 3, לאחר החלוקה המרחבית במשלימת איור 1.
  5. הנח תיבת קצה פיפטה 120 μl, צלחת 384 גם בדילול תרופה (משלב 5.3) וצלחת 384 גם עם תאים (מצעד 3.1.9) לתחנות, B ו- C, בהתאמה. עומס ולהפעיל תכנית "drug_add.PGM". Pipettor רובוטית יעביר 8 μl של סמים מכל טוב בצלחת התרופה למקבילו בצלחת התא. ברגע שסיימתי, להעביר צלחת תא לחממה של מיקרוסקופ הדיגיטלי בהקדם האפשרי.

6. הדמיה של תאים בצלחת

הערה: ההליך שלהלן מתייחס למיקרוסקופ Evos האוטומטי פלורידה, אבל ניתן להתאים בקלות למיקרוסקופי במה ממונעות אחרים עם דגירה העליונה ספסל או מיקרוסקופים-משובץ חממה.

  1. נקה את הפנים של החממה העליונה הספסל עם אתנול-רטוב לנגב ולהסיר בזהירות את המכסה של הצלחת תוך שימת מכסה Incubator.
  2. בצע את שלבי התוכנה להוסיף המשואות. זה הוא המונח המשמש כדי להתייחס לנקודתי ציון לאזורים של עניין, להיות צילם ברציפות במהלך הניסוי (ראה מדריך למשתמש תוכנה לפרטים נוספים).
  3. השתמש מטרת הגדלת 5X או 10X. ודא שהדגש הוא דומה לאיור 2: תאי MM מופיעים דיסקים בהירים כמוקפים בטבעת כהה וBMSCs או HUVECs הם בקושי נראה. כמה תאי MM העיקריים הם מאוד קטנים ובכך כוונון עדין ייתכן שיידרש כדי למצוא את המיקוד האופטימלי.
  4. התאם את המרווח בין 10-30 דקות רכישה ועל משך זמן של לפחות 96 שעות. בעוד מרווחי זמן בין הרכישות מקובלים, במרווחים של 45 דקות או יותר עשויים להפחית באופן משמעותי את הדיוק של מדידת הכדאיות.
  5. להגדיר את התוכנה כך שהתמונות של כל אחד גם מאוחסנות בקבצים נפרדים בשם Beacon-1, ביקון-2, וכו 'אם pipettor רובוטית שימש, להגדיר את המשואות במטרה המתוארת באיור 3 נוסף.
  6. ודא שיש מספיק מים במכשיר האדים החממה וגז, כך שתאים יהיו בתנאים אופטימליים.
  7. עם השלמת הניסוי, להעתיק את התיקיות המכילות את התמונות למחשב שיריץ את הניתוח.

7. כימות של תרופות רגישות

הערה: ההוראות הבאות להנחות את השימוש בניתוח התמונה באמצעות אשכול מחשב, מאז הניתוח של צלחת רבת גם במחשב אישי היא מאוד זמן רב.

  1. הורד את התוכנה מהאתר האינטרנט של ImageJ NIH: http://imagej.nih.gov/ij/
  2. הורד תסריט ותוספים בhttp://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
  3. עקוב אחר הוראות בhttp://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf להפעיל תוכנת ניתוח תמונה דיגיטלית. התוצאה צריכה להיות גיליון אלקטרוני בשם Results.csv מכיל מדידות הכדאיות במרווחי זמן קבועים לEACגם שעות בצלחת לתקופת הניסוי (כלומר, 96 שעות).
  4. אם באמצעות pipettor רב ערוצים ידניים, בצע את השלבים הבאים.
    1. הורד את קובץ http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt ולשנות אותו כך שתתאים לפריסה של הצלחת המוגדרת בשלב 3.1 (לדוגמא, איור 3).
    2. הורד את תוכנת http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar ולהפעיל אותו באמצעות הקבצים שנוצרו בשלבי 5.3 ו -5.4 כפרמטר הקלט. התוצאה תהיה שם תיקיית דוח המכיל גיליונות אלקטרוניים מרובים, כל קיבוץ התוצאות עבור תרופה מסוימת.
    3. תוכן העתק ודבק בתבנית גיליון אלקטרוני http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
      הערה: התוצאה צריכה להיות גרפים כגון זה מתואר באיור 4, המייצג את chemosensitivity של המדגם לתרופות שונות כפונקציה של ריכוז תרופה וזמן חשיפה.
    4. אם באמצעות pipettor רובוטית, בצע את השלבים הבאים.
      1. הורד קבצי תבנית מקבצי תסריט הורדה לpipettor רובוטית מhttp://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic תבנית Files.zip ולחלץ קבצים בספרייה.
      2. לשנות את הקובץ DrugList.csv על פי הרשימה של תרופות וריכוז התרופה הגבוהה ביותר בצלחת עם תאים. בצע את הפריסה של משלימה איור 2.
      3. הפעל את התכנית BuildExperimentalDesign.java עוברת כפרמטר התיקייה המכילה את הקבצים שחולצו בשלב 7.5.1 וקבצי Results.csv מצעד 7.3. התוצאה צריכה להיות שתי תיקיות בשם MM1_S וPtSample. הראשון מכיל תיאור של הבארות (סמים וריכוזים) לשליטה קו התא החיובית. השני מכיל את אותו מידע, אבל לגבי החלק מצלחת זרע עם תאים חולים.
      4. העתק את הקובץ Results.csv לכל אחד מהמדריכים שנוצרו בשלב 7.5.3. הורדהתוכנת http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar ולהפעיל אותו באמצעות הקבצים שנוצרו ב7.5.3 צעדים לשני התיקיות. התוצאה תהיה שם תיקייה דווח בכל אחת מהתיקיות שנוצרו ב7.5.3. דווח התיקייה מכילה גיליונות אלקטרוניים מרובים, כל קיבוץ התוצאות עבור תרופה מסוימת.
      5. הפעל את תכנית BuildGraphPadFile.java ולהעביר כפרמטר התיקייה המכילה את הקבצים שחולצו בשלב 7.5.1 וקבצי Results.csv מצעד 7.3. התוצאה תהיה קובץ GraphPad מכיל עקומות תגובת מינון לכל אחת מהתרופות 31, ומנורמל על ידי השליטה. כל תרשים יכיל 5 ריכוזי תרופה לתאי MM הראשוניים וריכוז אחד לשליטה החיובית שורת תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הזרימה של הניסוי מתוארת בקצרה באיור 1 אם כל השלבים הושלמו בהצלחה, התמונות מתקבלות על ידי מיקרוסקופ צריכה להיות שווה ערך לאיור 2:. לחיות תאי MM צריכים לראות בבירור דיסקים בהירים וכBMSCs או HUVECs צריך להיות בקושי נראה ומופץ גם ברקע. כפי שניתן לראות באיור 2 א, תאי MM טווח בגודל מ מטופל אחד למשנהו, אבל באופן כללי הם קטנים יותר משורות תאים. מאז הם כמעט לא לשכפל vivo לשעבר במרווח של הניסוי (96 שעות) הם יכולים להיות שנזרעו בריכ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לסיכום, מדובר בשיטת תפוקה חזקה וגבוהה לכמת chemosensitivity של תאי MM ראשוניים ופרמקודינמיקה vivo לשעבר של תרופות בבנייה מחדש של מח העצם. השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם הזריעה הנכונה של הבארות והתמקדות נאותות (ראה איור 2 לתוצאות צפויות): להבטיח שתאי MM וסטרומה הם מפוזרים באופן אחיד, שתאי סטרומה הם חסיד לתחתית הבאר, שכל MM תאים נמצאים באותו מישור המוקד, ושיש לי תאי MM ההיבט של דיסק בהיר מוקף בטבעת כהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי המדינה בנקהד-קולי צוות מדע גרנט של פלורידה (2BT03), המכון הלאומי לבריאות / מכון לאומי לסרטן (1R21CA164322-01) וצוות מדע גרנט של מופיט מרכז הסרטן. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מתקן Translational Core המחקר בח מרכז Lee Moffitt הסרטן ומכון מחקר, מרכז NCI מיועד מקיף למלחמה בסרטן (P30-CA076292). גישה לתאים ראשוניים התאפשרה באמצעות סה"כ סרטן טיפול הפרוטוקול במרכז סרטן מופיט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
EVOS FL AUTOAMG+ AMC1000מיקרוסקופ דיגיטלי מצויד בבמה ממונעת וחממה עליונה לספסל.
צלחת 384 בארות CellBindCORNINGCLS3683 SIGMACorning CellBIND 384 צלחות באר
384 צלחת באר, פוליסטירן, משטח CellBIND, סטרילי, תחתית שטוחה שקופה, שחור, עם מכסה
1,536 צלחת באר CellBindCORNINGCLS3832 ALDRICHCorning 1,536 לוחות באר, בסיס נמוך, טיפול פני השטח CellBIND, סטרילי
Ficoll-Paque Plus GE HealthcareGE17-1440-02 SIGMAלבידוד in vitro של לימפוציטים מדם היקפי אנושי.
חרוזים מגנטיים CD138Miltenyi 130-051-301חרוזים מגנטיים מצומדים נוגדנים לבחירת תאי CD138+.
עמודות LSMiltenyi   130-042-401עמודה להפרדת תאים.
מפריד MidiMACSMiltenyi 130-042-302מגנט לעמודת הפרדה.
MatrigelSigma-AldrichE6909 SIGMAECM ג'ל מבית Engelbreth-Holm-Swarm עכברים סרקומה
GetrexLife TechnologiesA1413201מטריצת ממברנת מרתף ללא LDEV
HUVECLife TechnologiesC-003-25P-Bתאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC
RPMI-1640 מדיהGIBCO11875-093RPMI 1640 בינוני + L-גלוטמין + פנול אדום
FBSGIBCO10082-147, מאושר, מושבת בחום, ממקור ארה"ב
3.1 מ"ג/מ"ל קולגן בקר מסוג IAdvanced Biomatrix5005-Bתמיסת קולגן בקר, סוג I, 3 מ"ג/מ"ל, 100 מ"ל
Precision XSBIOTEKPRC3841 מערכת פיפטור רובוטית
AMAFD1000 ) סרום בקר עוברי מופעל בחום

מקורות

  1. Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
  2. Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
  3. Kirshner, J., et al. A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma. Blood. 112, 2935-2945 (2008).
  4. Durie, B. G., Jacobson, J., Barlogie, B., Crowley, J. Magnitude of response with myeloma frontline therapy does not predict outcome: importance of time to progression in southwest oncology group chemotherapy trials. J Clin Oncol. 22, 1857-1863 (2004).
  5. Harousseau, J. L., Attal, M., Avet-Loiseau, H. The role of complete response in multiple myeloma. Blood. 114, 3139-3146 (2009).
  6. Khin, Z. P., et al. A preclinical assay for chemosensitivity in multiple myeloma. Cancer Res. 74, 56-67 (2014).
  7. Misund, K., et al. A method for measurement of drug sensitivity of myeloma cells co-cultured with bone marrow stromal cells. J Biomol Screen. 18, 637-646 (2013).
  8. Ramasamy, K., et al. Fluorescence-based experimental model to evaluate the concomitant effect of drugs on the tumour microenvironment and cancer cells. Br J Haematol. 157, 564-579 (2012).
  9. McMillin, D. W., et al. Tumor cell-specific bioluminescence platform to identify stroma-induced changes to anticancer drug activity. Nat Med. 16, 483-489 (2010).
  10. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  11. Al-Quran, S. Z., Yang, L., Magill, J. M., Braylan, R. C., Douglas-Nikitin, V. K. Assessment of bone marrow plasma cell infiltrates in multiple myeloma: the added value of CD138 immunohistochemistry. Hum Pathol. 38, 1779-1787 (2007).
  12. Najar, M., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6. Cytotherapy. 11, 570-583 (2009).
  13. Scott, J. Phase i trialist. Lancet Oncol. 13, 236(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקת רגישות לתרופותתאי מיקרופלואידיקהשאיבת מח עצםתאי סטרומהפולימריזציה של קולגןניתוח דימות דיגיטליעקומות חיוניותסוכני כימותרפיהמיקרוסקופ ממוטב
מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.