אנו מתארים בדיקת רגישות לתרופות בתפוקה גבוהה עבור תאי מיאלומה נפוצה ראשוניים. הוא מורכב משחזור של מיקרו-סביבת מח העצם (כולל מטריצה חוץ-תאית וסטרומה) בצלחות מרובות בארות, ושיטה לא פולשנית לכימות אורך של כדאיות התא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
בעבודה זו אנו מתארים גישה חדשנית המשלבת לשעבר מבחני רגישות תרופת vivo וניתוח תמונה דיגיטלי להעריך chemosensitivity וההטרוגניות של מיאלומה נפוצה תאים (MM) המופק מחולה. גישה זו מורכבת בזריעת תאי MM עיקריים חילוץ טרי מaspirates מח עצם לתאי microfluidic מיושמים בצלחות רב גם, כל אחת בהיקף של בנייה מחדש של מייקרו-סביבת מח עצם, כולל מטריקס (Matrix קולגן או קרום במרתף) וסטרומה (פונות תאי גזע המופקים mesenchymal) או תאי האנדותל אדם נגזר (HUVECs). התאים מסוממים עם סוכנים וריכוזים שונים, והם צילמו ברצף במשך 96 שעות באמצעות מיקרוסקופ שדה הבהיר, במיקרוסקופ ממונע מצוידים במצלמה דיגיטלית. תוכנת ניתוח תמונה דיגיטלית מזהה תאי חיים ומתים מנוכחות או עדר של תנועת קרום, ומייצרת עקומות של שינוי בכדאיות כo פונקציהF ריכוז תרופה וזמן חשיפה. אנו משתמשים במודל חישובים כדי לקבוע את הפרמטרים של chemosensitivity של אוכלוסיית גידול לכל תרופה, כמו גם את המספר של תת-אוכלוסיות הנוכחיות כמדד להטרוגניות גידול. מודלים מותאמי מטופל אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לדמות משטרי טיפול ולהעריך תגובה קלינית.
מבוא
מטרתה של שיטה זו היא לאפיין את רגישות התרופה של מיאלומה נפוצה (MM) תאים ראשוניים לפנל של סוכנים לשעבר vivo, קרוב ככל האפשר לתנאים פיסיולוגיים, ועם דיוק די בכך שתוצאות אלה יכולים לשמש לזיהוי תת עמיד לכימותרפיה." אוכלוסיות בניטל הגידול וסופו של דבר, לparameterize מודלים חישוביים נועדו לאמוד תגובה קלינית.
מודלים חישוביים הם כלים רבי עוצמה לניתוח מערכות מורכבות, כגון אינטראקציות סרטן-מארח-טיפול. עם זאת, מודלים הם רק טובים כמו הנתונים המשמשים לparameterize. למרבה הצער, רוב המידע זמין בספרות לא ניתן להשתמש בצורתה הנוכחית לparameterize מודלים כאלה, כפי שהם ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
השימוש בתאים אנושיים הנגזרים מביופסיות כמפורט להלן אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדית של מופיט ונערך תחת הניסוי הקליני # MCC 14745 נערך במרכז H. Lee Moffitt הסרטן ומכון מחקר.
1. מיון של תאי MM ממח העצם aspirates
- לאסוף aspirates מח עצם (20 מיליליטר) מחולים במזרק הפרין נתרן.
- בודד תאי mononuclear ידי צנטריפוגה מח מדולל (1: 1 עם PBS סטרילי) על שיפוע צנטריפוגה הבינוני המימי סטרילי ב 400 XG למשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הזרימה של הניסוי מתוארת בקצרה באיור 1 אם כל השלבים הושלמו בהצלחה, התמונות מתקבלות על ידי מיקרוסקופ צריכה להיות שווה ערך לאיור 2:. לחיות תאי MM צריכים לראות בבירור דיסקים בהירים וכBMSCs או HUVECs צריך להיות בקושי נראה ומופץ גם ברקע. כפי שניתן לראות באיור 2 א, תאי MM טווח בגודל מ מטופל אחד למשנהו, אבל באופן כללי הם קטנים יותר משורות תאים. מאז הם כמעט לא לשכפל vivo לשעבר במרווח של הניסוי (96 שעות) הם יכולים להיות שנזרעו בריכ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לסיכום, מדובר בשיטת תפוקה חזקה וגבוהה לכמת chemosensitivity של תאי MM ראשוניים ופרמקודינמיקה vivo לשעבר של תרופות בבנייה מחדש של מח העצם. השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם הזריעה הנכונה של הבארות והתמקדות נאותות (ראה איור 2 לתוצאות צפויות): להבטיח שתאי MM וסטרומה הם מפוזרים באופן אחיד, שתאי סטרומה הם חסיד לתחתית הבאר, שכל MM תאים נמצאים באותו מישור המוקד, ושיש לי תאי MM ההיבט של דיסק בהיר מוקף בטבעת כהה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
תודות
מחקר זה מומן על ידי המדינה בנקהד-קולי צוות מדע גרנט של פלורידה (2BT03), המכון הלאומי לבריאות / מכון לאומי לסרטן (1R21CA164322-01) וצוות מדע גרנט של מופיט מרכז הסרטן. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מתקן Translational Core המחקר בח מרכז Lee Moffitt הסרטן ומכון מחקר, מרכז NCI מיועד מקיף למלחמה בסרטן (P30-CA076292). גישה לתאים ראשוניים התאפשרה באמצעות סה"כ סרטן טיפול הפרוטוקול במרכז סרטן מופיט.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| EVOS FL AUTO | AMG | + AMC1000 | מיקרוסקופ דיגיטלי מצויד בבמה ממונעת וחממה עליונה לספסל. |
| צלחת 384 בארות CellBind | CORNING | CLS3683 SIGMA | Corning CellBIND 384 צלחות באר 384 צלחת באר, פוליסטירן, משטח CellBIND, סטרילי, תחתית שטוחה שקופה, שחור, עם מכסה |
| 1,536 צלחת באר CellBind | CORNING | CLS3832 ALDRICH | Corning 1,536 לוחות באר, בסיס נמוך, טיפול פני השטח CellBIND, סטרילי |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | GE17-1440-02 SIGMA | לבידוד in vitro של לימפוציטים מדם היקפי אנושי. |
| חרוזים מגנטיים CD138 | Miltenyi | 130-051-301 | חרוזים מגנטיים מצומדים נוגדנים לבחירת תאי CD138+. |
| עמודות LS | Miltenyi | 130-042-401 | עמודה להפרדת תאים. |
| מפריד MidiMACS | Miltenyi | 130-042-302 | מגנט לעמודת הפרדה. |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E6909 SIGMA | ECM ג'ל מבית Engelbreth-Holm-Swarm עכברים סרקומה |
| Getrex | Life Technologies | A1413201 | מטריצת ממברנת מרתף ללא LDEV |
| HUVEC | Life Technologies | C-003-25P-B | תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVEC |
| RPMI-1640 מדיה | GIBCO | 11875-093 | RPMI 1640 בינוני + L-גלוטמין + פנול אדום |
| FBS | GIBCO | 10082-147 | , מאושר, מושבת בחום, ממקור ארה"ב |
| 3.1 מ"ג/מ"ל קולגן בקר מסוג I | Advanced Biomatrix | 5005-B | תמיסת קולגן בקר, סוג I, 3 מ"ג/מ"ל, 100 מ"ל |
| Precision XS | BIOTEK | PRC3841 מערכת פיפטור רובוטית |
מקורות
- Salmon, S. E., et al. Quantitation of differential sensitivity of human-tumor stem cells to anticancer drugs. N Engl J Med. 298, 1321-1327 (1978).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empir....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
