מאמר שיטה

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב

8.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53149

⸱

30 בספטמבר 2015

 , 
1Biology Department, Adelphi University, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, Brown University

במאמר זה

סיכום

מיטוכונדריה ממלאים תפקידים מרכזיים בוויסות חילוף החומרים וההומאוסטזיס. שינויים עדינים במטבוליזם המיטוכונדריאלי המשפיעים על הפיזיולוגיה של האורגניזם עשויים להיות קשים לאיתור במחקרי מטבולומיקה של אורגניזמים שלמים. כאן אנו מתארים שיטת בידוד המשפרת את הזיהוי של שינויים מטבוליים עדינים בדרוזופילה מלנוגסטר.

תקציר

מכיוון שהמיטוכונדריה ממלאים תפקידים בחילוף החומרים של חומצות אמינו, חילוף החומרים של פחמימות וחמצון חומצות שומן, פגמים בתפקוד המיטוכונדריה מסכנים לעתים קרובות את חייהם של הסובלים ממחלות מורכבות אלה. זיהוי שינויים מטבוליים במיטוכונדריה חיוני להבנת הפרעות מיטוכונדריאליות ותגובות מיטוכונדריאליות לגורמים פרמקולוגיים. למרות שהמטבוליזם המיטוכונדריאלי הוא הליבה של הבקרה המטבולית, זיהוי שינויים עדינים במטבוליזם המיטוכונדריאלי עלול להיות מעוכב על ידי ייצוג יתר של מטבוליטים ציטוזוליים אחרים המתקבלים באמצעות מיצוי אורגניזם שלם או רקמה שלמה.

כאן אנו מתארים שיטת בידוד שזיהתה שינויים מטבוליים מיטוכונדריאלים בולטים בדרוזופילה שהיו נבדלים בין תכשירים מועשרים בזבוב שלם לתכשירים מועשרים במיטוכונדריה. כדי להמחיש את הרגישות של שיטה זו, השתמשנו בקבוצה של דרוזופילה המכילה DNA מיטוכונדריאלי מגוון גנטי (mtDNA) וחשפנו אותם לתרופה רפמיצין. באמצעות שיטה זו הראינו כי רפמיצין משנה את חילוף החומרים המיטוכונדריאלי באופן תלוי במיטוכונדריה-גנוטיפ. עם זאת, שינויים אלה מובחנים הרבה יותר במחקרי מטבולומיקה כאשר מטבוליטים הופקו משברים מועשרים במיטוכונדריה. לעומת זאת, תמציות רקמות שלמות זיהו רק שינויים מטבוליים בתיווך התרופה רפמיצין ללא תלות ב-mtDNA.

מבוא

המטרה של הליך זה היא לפתח שברים המיטוכונדריה מועשרות שיניבו מספיק מטבוליטים המיטוכונדריה ללימודי metabolomics באמצעות melanogaster תסיסנית. מניסיוננו, metabolomics ניתוח תוך שימוש בשיטות מיצוי סלולארי כל אינם מסוגלים לזהות שינויי המטבוליט המיטוכונדריה עדינים בדרוזופילה. עם זאת, fractioning המיטוכונדריה לפני ניתוח metabolomics מגביר את הרגישות לזהות משמרות המטבוליט המיטוכונדריה.

המיטוכונדריה הם אברונים תאיים אחראים על מתן 90% מהאנרגיה שתאים צריכים לתפקוד נורמלי 1. בשנים האחרונות זה כבר הכיר בכך שהמיטוכונדריה לשחק הרבה יותר דינמי תפקיד בתפקוד תאי והאורגניזם מאשר רק ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP), וכעת הם מוכרים כרכזות להסדרת 2,3 הומאוסטזיס חילוף חומרים. המיטוכונדריה הוא התוצאה של תהליך שבו endosymbiotic דיסשושלות חיידקי tinct התמזגו ~ לפני 1.5 מיליארדים שנים 4. כמיטוכונדריה התפתחה לאברונים אמיתיים, גנים מאנדוסימביוזה שולבו בגנום הגרעיני המתפתח. בבעלי חיים היום, כ -1,500 חלבוני המיטוכונדריה הם בקידוד גרעיניים תוך 37 גנים להישאר בmtDNA, 13 מהם לקודד חלבוני המיטוכונדריה שהם תת-יחידות של מתחמי האנזים של זרחון חמצוני 5. יש צורך בתיאום בין המיטוכונדריה ותאים גרעיניים כדי לשמור על תפקוד המיטוכונדריה נכון.

שימוש בשיטות שתוארו כאן היינו מסוגל לזהות שינויים מטבוליים המיטוכונדריה בתסיסנית הנובעים ממניפולציה של התיאום בין הגנום המיטוכונדריאלי והגרעיני. אנחנו השתמשנו בזן של דרוזופילה בי mtDNA ממיני אחותה ד simulans הונח על ד בודד melanogaster רקע גרעיני 6. mitonuclear 'שיבש' זהגנוטיפ הושווה לגנוטיפ mitonuclear 'הילידים', או-התפתח שיתוף של ד melanogaster נושא את אותו הגנום גרעיני עם ד המקורי שלו melanogaster mtDNA. ד melanogaster וד ' simulans mtDNAs שונה על ידי ~ 100 חומצות אמינו ו> 500 החלפות נרדפים המשפיעות 7,8 תקשורת mitonuclear. אנחנו שנוצרנו תמציות לטוס כל ותמציות מועשרות המיטוכונדריה ללמוד משמרות המטבוליט בתגובה ללחץ תרופתי. כאן אנו מראים כי בעת שימוש שבברי המיטוכונדריה המועשרת לזהות שינויים בולטים במטבוליטים המיטוכונדריה בין גנוטיפ נשא ד הילידים, התפתח-שיתוף mtDNAs melanogaster וגנוטיפ שיבש נשא ד simulans mtDNA. לעומת זאת, שינויי המטבוליט בין שני גנוטיפים אלה הם עדינים תוך שימוש בשיטות רגילות לנצל תמצית לטוס כולה. לכן, שיטה זו סיפקה דרך להבין כיצד mtDNAs לתווך שינויי המיטוכונדריה בתגובה לתרופות שונות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. ריאגנטים ופתרונות

  1. הכנת מזון זבוב ותקשורת
    1. מרכיבים לטוס חום סוכר 11%, 2% שמרי autolyzed, קמח תירס 5.2%, אגר 0.79% w / v במים בפלטה חשמלית נקבעה על 90 מעלות צלזיוס. מערבבים באופן קבוע עד לקבלת תערובת הומוגנית מעט צפופה מתקבלת. הכן נפח סופי של 550 מיליליטר של אוכל לטוס לסך של 5 עם 100 בקבוקוני מ"ל לטוס מזון בכל.
    2. מוציאים ממקור החימום, מערבבים מדי פעם עד שהאוכל מתקרר עד 80 מעלות צלזיוס ומוסיף 0.2% tegosept-מתיל 4 hydroxybenzoate-מומס באתנול 95%.
    3. לפצל את האוכל בשני כרכים שווים. להוסיף 1.1 מיליליטר של 50 מ"מ Rapamycin מומס באתנול לכרך אחד ו1.1 מיליליטר של אתנול להיקף האחר. מערבבים את rapamycin ופתרוני אתנול למזון. הקפד שהטמפרטורה יורדת ל -50 מעלות צלזיוס לפני הוספת תרופות.
  2. בידוד מאגר
    1. הכן 500 מיליליטר של בידוד הצפת [225 מ"מ מניטול, 75 מ"מ סוכרוז, 10 מ"מ 3 (N </ Em> -morpholino) חומצת propanesulfonic (מגבים) וחומצת 1 מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 2.5 מ"ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA)] במים.
    2. התאם את ה- pH 7.2 באמצעות נתרן הידרוקסידי. PH הראשוני יהיה חומצי.
    3. להשתמש בבקבוקי אחסון סינון סטרילי עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר לעקר פתרון ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס.
  3. הצפת לשטוף
    1. הכן 500 מיליליטר של חיץ לשטוף [225 מ"מ מניטול, 75 מ"מ סוכרוז, 10 מ"מ KCl, 10 מ"מ טריס HCl ו -5 מ"מ KH PO 2 4] במים.
    2. התאם את ה- pH 7.2 באמצעות נתרן הידרוקסידי. PH הראשוני יהיה חומצי.
    3. להשתמש בבקבוקי אחסון סינון סטרילי עם גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר לעקר פתרון ולאחסן אותו על 4 מעלות צלזיוס.

2. גידול של זני דרוזופילה

  1. כדי לשלוט בצפיפות זחל במהלך פיתוח, מקום 25 זוגות של הורים לבקבוק תרבות ולאפשר להם להטיל ביצים במשך 48 שעות.
  2. הסרת הורים לאחר 48 שעות להסדיר צפיפות ביצה.
  3. חזור על שלבים 2.1 ו -2.2 שימוש בצאצאי F1 מתעוררים, כך שני דורות של שליטה בצפיפות זו מושגת.
  4. לאסוף מבוגרים, להרדים את הזבובים באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) ונפרדים לפי מין.
    1. השתמש ברגולטור שלב אחד לCO הטהור נמסר 2 מטנק גבוה בלחץ בזרימה רציפה של 5 psi. כדי למנוע חשמל סטטי, להשתמש צינורות פלסטיק לזרז CO 2 לסינון בקבוק 500 מיליליטר עם מים.
    2. השתמש בפקק גומי עם חור אחד לאטום את הבקבוק. השתמש בצינורות פלסטיק כדי לחבר את הצמצם לרוחב של הבקבוק לכרית CO 2.
    3. מניחים את הזבובים בפנקס ללא יותר מ 10-15 דקות. לאפשר להתאושש מהרדמה למשך 24 שעות לפני הצבתם בתנאי ניסוי.
  5. כדי ליצור מספיק מטבוליטים לשברים מועשר במיטוכונדריה, להשתמש 300 זבובים לדגימה. הנה, להשתמש נקבות, אבל עדיןr עשוי להיות שונה בניסויים אחרים. העבר את 150 זבובים לכלוב דמוגרפיה 1 ליטר תוצרת בית. לאפשר גישה ל5 מיליליטר של אוכל לטוס בבקבוקון.
  6. העבר את 150 הזבובים שנותר לעוד כלוב 1 ליטר. אל overpopulate כלובים עם יותר מ -150 זבובים.
  7. השתמש בשש דגימות לשכפל לתנאי ניסוי. מאז תמציות בעלי חיים שלמות להניב יותר מטבוליטים, כדי ליצור מדגם 1 של כל בעלי החיים מבודד, להעביר 50 נקבה עפה לכלוב אחד. באשר למבודד במיטוכונדריה, להשתמש שש דגימות לשכפל לתנאי ניסוי.
  8. כלובי מקום במהירות של 25 מעלות צלזיוס עם מחזור של 12 שעות אור וחושך 12 שעות.
  9. לספק מזון טרי כל 2 או 3 ימים בבקבוקון עם 5 מיליליטר של מזון כדי לשמור על איכות מזון.
  10. לשמור על זבובים על מזון במשך 10 ימים. צעד זה נחוץ לטיפול rapamycin 7. טיפולים או מצבים אחרים יהיו שונים.

3. בידוד של שברי מיטוכונדריאלי

  1. מזבלה עפה מכלוב אחד (150 זבובים) לhomogenizer dounce זכוכית טפלון מלא 1 מיליליטר של חיץ בידוד מצונן.
  2. Homogenize ידי הזזת העלי למעלה ולמטה במשך 15 משיכות. שמור מרגמה על קרח כדי לשמור על שלמות מיטוכונדריה.
  3. ההעברה homogenate לצינור 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
  4. קח את supernatant ו צנטריפוגות ב6,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להעשיר למיטוכונדריה.
  5. כsupernatant מכיל חלק cytosolic, לבטל את supernatant או להשתמש בו לניסויים חלופיים. Resuspend גלולה ב300 μl של חיץ לשטוף.
  6. חזור על שלבים 3.1-3.5 לכלוב השני. מערבבים את כדורי resuspended של שני הכלובים בצינור microcentrifuge קריוגני.
  7. צנטריפוגה ב 6000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. בטל supernatant ופלאש להקפיא את גלולה בחנקן נוזלי.
  9. אחסן את השברים המועשר המיטוכונדריה ב -80 ° C או בטמפרטורה נמוכה יותר.
    1. לחלופין, לבעלי חיים שלפני כלparation, למקם את המבוגרים בצינור microcentrifuge קריוגני. פלאש-להקפיא את הבקבוקון במבוגרים חנקן נוזלים חנות ב -80 ° C או בטמפרטורה נמוכה יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שימוש בפרוטוקול שהוסבר לעיל, ביצענו ניתוח metabolomic על שברים מועשרות המיטוכונדריה ותמציות בעלי חיים שלמות כדי לבדוק את ההשפעה של התרופה על Rapamycin mtDNAs מסתעף 7. אנו נמסרו 200 מיקרומטר של rapamycin ידי המסת התרופה במזון הזבוב. זבובים נחשפו לRapamycin במשך 10 ימים. מטבוליטים מתמציות לטוס כל ומתמציות המיטוכונדריה התקבלו על ידי שימוש בספקטרומטר מסת גז כרומטוגרפיה (GC / MS) וספקטרומטריית כרומטוגרפיה הנוזלית-טנדם מסה (LC / MS / MS) ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם: 1) גידול מספיק זבובים בחלל בשפע. זה מאוד חשוב שלא לגרום להתפוצצות אוכלוסין כלובי דמוגרפיה עם יותר מ -150 זבובים כל אחד; 2) שינוי המזון של הכלובים לעתים קרובות כדי למנוע תחרות מזון ומתח תזונתי; ו 3) שמירה על כל הדגימות ב 4 ° C כדי להבטיח את השלמות בבידוד של חלק המיטוכונדריה. מומלץ גם לצנן את חיץ הבידוד, לשטוף חיץ, וhomogenizer dounce זכוכית הטפלון לפני השימוש. כדי להפחית את זיהום cytosolic של פלגי המיטוכונדריה המועשר, גלולה המיטוכונדריה מצעד 3...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פיתוח הפקולטה של אוניברסיטת אדלפי ומענק R15GM113156 מ-NIGMS שהוענקו ל-EVC, R01GM067862 מענק מ-NIGMS ומענק R01AG027849 מ-NIA שהוענקו ל-DMR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2% טגוספט מתיל 4-הידרוקסיבנזואטVWRAAA14289
אתנולסיגמא-אולדריץ'792799
מניטולסיגמא-אולדריץ'M4125
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S9378
3-(N-מורפולינו) חומצה פרופנסולפונית (MOPS)סיגמא-אולדריץ'M1254 
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)סיגמא-אולדריץ'38057 
אלבומין בסרום בקר (BSA)Sigma-Aldrich5470
KClSigma-AldrichP9333
Tris HClSigma-AldrichRES3098T-B7
KH2PO4Sigma-Aldrich1551139
CO2 רפידות להרדמת זבוביםTritech ResearchMINJ-DROS-FP
1 ליטר כלובחנות מסעדה אינטרנט999RD32
1 L מכסה כלובחנות מסעדה אינטרנט999LRD
הומוגנייזר זכוכית-טפלון dounce פישר סיינטיפיקNC9661231
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'S8045
רפמיצין מעבדות LC R-5000
אנטי פוריןMitoSciencesMSA03
אנטי אלפא טובוליןמחקרים התפתחותיים בנק היברידומה12G10
Pierce BCA ערכת בדיקת חלבון תרמו סיינטיפיק 23225
CO2 כריתTritech Research, IncMINJ-DROS-FP
SB08184M
פקק גומיS08512M
בקבוק מסנן

מקורות

  1. Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484(2007).
  2. Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
  3. Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
  4. Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
  5. Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
  6. Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
  7. Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
  8. Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).
  9. Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254(2014).
  10. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  11. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
  12. Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
  13. Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020(2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNA

מאמרים קשורים