המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

הבנת המנגנונים שבאמצעותם חלבוני קרום למלא הפונקציה הסלולרית שלהם לעתים קרובות יכולה להיות משימה מאתגרת, משום שדרך פעולתם שלהם לעתים קרובות הוגדרה על ידי אינטראקציות זיקה נמוכות, שקשה לזהות ולהעריך על ידי שיטות קונבנציונליות ביוכימיים. חלבוני קרום עשויים להיות כמו כן מועשרים בתחומים ספציפיים קרום ^5,6 או ליצור מבנים מסדר גבוהים יותר דינמיים, שיכול בעיקרון לשנות את פעילותם הביולוגית ^7.

כך מיקרוסקופ פלואורסצנטי מולקולה הבודד בסיוע לייזר לא פולשני הפך את המתודולוגיה של בחירה ללמוד חלבון התנהגות בסביבות סלולריות מורכבות. זה נכון במיוחד לתהליכים ביוכימיים המתרחשים בקרום הפלזמה, כמו אלה יכולים בעיקרון להיות במעקב בהשתקפות סה"כ הפנימית מופחת רעש מצב (TIRF). כאן תאורת מדגם מוגבלת לעד 200 ננומטר-דק פרוסה בקרבת זכוכית surface, שתוצאתה אובדן משמעותי ברקע סלולרי ו, בשל המאפיינים של אור עירור חלוף, גם בגידול משמעותי בעוצמת אות הקרינה ^8,9. שני ההיבטים חשובים כאשר מכוונים לרזולוצית positional ובזמן גבוהה בזיהוי מולקולה בודד.

SLBs מישורי אינם תואם רק עם מיקרוסקופיה TIRF. כאשר פונקציונליות עם ligands המתאים הם גם מספקים גישה ישירה ללימוד הדינמיקה המולקולרית של הכרת תאי תאים כפי שהם מתרחשים בתאי מערכת חיסון או תאים אחרים. הם יכולים גם להיות פשוט מנוצלים למצב תאי ניעתי ואחרת לא חסיד קרובים מספיק לשקופית הזכוכית כך שניתן הדמיה תאים כאלה בתאורת TIRF, אשר רצויה מאוד כאשר ניסויי הולכה מעורבים מעקב מולקולה בודד או superresolution מבוסס מולקולה בודדת. לשם כך חלבונים צריכים להיות הועמסו על SLB נייד מאוד. יתרון הגלום שלי בשימוש PIDs הם שאין מחייב נוקבים של חלבונים בכל. יתר על כן, יכול להיחשב כSLBs נוזלים דו ממדים עם יכולת טבועה לרפא את עצמם; אי סדרים בתמיכת הזכוכית מתוגמלים עד מידה מסוימת. פרוטוקול צעד אחר צעד מסופק ליצור bilayers הנייד טעון עם חלבונים של עניין. ההיווצרות של SLBs מישוריים מתוארת, אשר מכילה 1-palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (POPC) כמרכיב העיקרי (90-99%) והסינטטי ופונקציונלי שומנים 1,2-dioleoyl- SN -glycero-3 - {[N (5-אמינו-1-carboxypentyl) iminodiacetic חומצה] succinyl} מלח ניקל (DGS נת"ע-ניקל) בשפע נמוך (1-10%). POPC נושא חומצת שומן רוויה אחד וחומצות שומן חד-בלתי רווי אחד ויוצר bilayers שומנים גבוהים נזילות גם בRT. DGS נת"ע-Ni נקשר עם headgroup לזנבות פולי-היסטידין ומשמש כעוגן לחלבונים מתוייגים פולי-היסטידין של בחירה (איור 1).

"> חשוב לציין, חומרת מיקרוסקופיה חייבת לכלול מספר של ציוד היקפי שיתוארו להלן. עם המידע שספק וקצת ידע בסיסי באופטיקה ופיסיקה לייזר, כל ביולוג צריך להיות מסוגל לבנות התקנת הדמיה מולקולה בודדת. עירור דוגמא אידיאלי צריך להיות בוצע על מיקרוסקופ הפוכה בסכתי פנימית השתקפות מצב (TIRF) כמשטר זה מפחית אור מזויף ורקע מוגזם וכתוצאה מאחרת אוטומטי הקרינה סלולרית ^9. לשם כך, מטרת TIRF-מסוגל מיוחדת (ראה להלן) ותאורת לייזר יש צורך. ניסויים מסוימים מחייבים פעמים תאורה בטווח אלפית השנייה ופעלו ברצף מהיר. כדי לחסוך זמן תאורה או להימנע מהלבנה מיותרת הנגרמת על ידי תאורה חוזרת היא לעתים קרובות מועיל לפצל את האור הנפלט לשניים או יותר ערוצי רפאים. זה מאפשר לקריאת נתונים בו זמנית של שניים או יותר פרופילי פליטה, שיכול להפוך לגורם משמעותי כאשר conducניסויי טינג מעורבים העברת פורסטר תהודת אנרגיה (סריג). הנה הפליטה כתוצאה מאחת דופק עירור אור ניתן להקליט שתי מתורם סריג וסריג acceptor (כפליטה רגישה). המצלמה צריכה ללכוד מספיק פוטונים עם רקע נמוך מספיק כדי לחזות fluorophores אחת בזמן התאורה. תוכנת מחשב תצטרך להיות לעמוד במשימה כדי לסנכרן סגירת עירור ורכישת תמונה. סקירה מקיפה היא כדלקמן ובאיור 2:

מטרת TIRF-מסוגל: לתאורת TIRF מבוסס מטרת הצמצם המספרי (NA) של המטרה חייבת להיות שווה או גדול מ 1.4 באמצעות שקופיות זכוכית סטנדרטית (n = 1.515) ^9. הגדלה יכולה לנוע בין 60x ל150X. המטרה צריכה להיות מתוקנת chromatically כדי לאפשר לconfocality כאשר ההדמיה fluorophores שונה.

לייזרים: מספר Lase הזמיניםאפשרויות r גדלו באופן משמעותי בשנים האחרונות. לייזרי דיודה גל מתמשך אלקטרוני modulatable מודרניים הם יעיל וחסכוניים ויכולים להיות מופעל עם תדירות ומהירות חסרות תקדים. לייזרי יון גז יקרים יותר להצטיין באיכות קרן לייזר, אבל דורשים סגירה חיצונית (ראה להלן), ולעתים קרובות נרחבים (מים) קירור.

תריסי עירור: מאפנני Acousto-אופטיים (AOM) מאפשרים סגירה מהירה ברצף מהיר ^10. להדוק כיבוי השילוב של AOM עם תריסים מכאניים מומלץ. חימום בדרך זו נרחבת של AOM בשל חשיפה לאור רציף הוא נמנע והאור דולף מAOM במחוץ לעמדה מתבטל.

עדשות משמשות להרחבת קרן לייזר ולהתמקד על מישור המוקד האחורי של המטרה. בדרך זו, אור העירור עוזבת את המטרה כמו קרן מקבילה (איור 3), אשר נדרש לתאורת TIRF של המדגם. הזזת הנקודה במישור המוקד האחורי המוקד מהמרכז לפריפריה של המטרה יהיה לשנות את הזווית שבה הקרן עוזבת את המטרה, אך לא את המיקום של נקודת הלייזר בדגימה (איור 3), שהיא פונקציה של הגיאומטריה הקרן הכוללת. תאורת TIRF מתפתחת בזווית קריטית, אשר יכול להיות מותאמת באמצעות מערכת של מראות מתפקדות כפריסקופ לתרגם את נקודת לייזר מוקדי במישור המוקד של המטרה. עדשות צריכה להיות מתוקנות chromatically וניתן להשתמש בו בסט של שתיים או שלוש עדשות. מערכת של שלוש עדשה מורכבת משתי עדשות מתנהגות כמו טלסקופ להרחיב את קרן הלייזר (ומכאן נקודת ההארה בדגימה) ועדשה שלישית למקד את האלומה התרחבה למישור המוקד האחורי של המטרה (איור 4). פונקציות שני (טלסקופ והתמקדות) גם יכולות להיות מושגת על ידי שילוב של שתי עדשות בלבד (ראה איור 4).

"Jove_content"> מראות צריכה להיות לפחות 95% רעיוני כדי למנוע אובדן של אור הלייזר. עבור כל התאמת קרן סט של שתי מראות מיושם בדרך כלל כהסדר כזה הוא מספיק כדי להתאים כל זווית ומיקום של קרן לייזר בדיוק.

שכבות Dichroic משקפות ולהעביר אור באורכי גל שונה שצוין ומשמשות כדי להרכיב או לפצל את קורותיהם של שני לייזרים.

מסנני Polychroic הם יותר מורכבים ממסנני dichroic ויש צורך כדי לשקף את אור העירור הנכנס ולהעביר יציאת פליטת אור מהדגימה. הם ממוקמים לתוך קוביית המסנן בין המטרה ועדשת צינור מיקרוסקופ.

לנקות את המסננים: בהתאם לסוג של לייזר ד פקיד הלייזר לנקות מסננים עם רוחב פס שידור צר צריך להיות ממוקמות בקרן הלייזר מייד לאחר שהוא עוזב את הלייזר.

מסנני Notchנועד לספוג ביעילות אור הלייזר עם רוחב פס צר ולהעביר את כל האור האחר. הם ממוקמים בתוך נתיב הפליטה לסנן את כל אור עירור לייזר מזויף. עם זאת, מסנני חריץ לעבוד רק ב 0 מעלות זווית נכנסת. אם הלהקה-הרוחב של מסנן החריץ הוא חד מאוד, הזוויות השונות הנכנסות עשויות שלא תבואנה לידי ביטוי יותר. חסימה של אור לייזר לייזר collimated אינה מושפעת, אבל אור אחורי פזורים-אולי לא להתעכב ביעילות מלהגיע המצלמה.

גלגלים ממונעים מסנן מצוידים בגלגלי מסננים מתאימים ניתן למקם בקלות למסלול העירור ופליטה ומאפשרים מיתוג פשוט בין עוצמות השונות אור (כאשר מצוידים במסנני ND) או ערוצי ניאון (כאשר הוצבו מול מנורת קשת קסנון או כספית לratiometric ההדמיה סידן או בחלק הקדמי של המצלמה לבחירה לfluorophore הפולט).

50:50 קוביית מפצל קרן גלשמש לפצל קרן לייזר לשני נתיבים נפרדים קורה עירור וגם לשלב אותם בחזית של פריסקופ.

מפצל קרן (נתיב פליטה): לרכישת תמונה מהירה ללא כל צורך בשינויי מסנן פיזיים, קרן הפליטה מחולקת לערוץ-עבר כחול ואדום העביר. באופן עקרוני, ניתן לבנות מפצלי אלומה על ידי העסקת טריז dichroic או סט של מראות ומראה dichroic להפריד את קרן הפליטה באופן גל-תלוי. יש צורך בשני מסנני פליטה לנקות את הערוצים הנפלטים.

מסנן מרחבי: לפעמים סינון מרחבי של קרן העירור נדרש להסיר את קרני אור שאינו מקבילה נפלטת מקרן לייזר באיכות נמוכה. מסנן המרחבי מורכב של טלסקופ שתי עדשות עם חריר קטן ממוקם בדיוק בנקודה של שני עדשות מוקדי. אור המזויף דרך זו נובע מחלקים שאינם מקבילים של קרן הלייזר נחסם ביעילות. סותנאי CH יש לעמוד בעת הקמת מיקרוסקופיה מבוססת TIRF. עליות מרחבי סינון עם חורים קטנים יותר, שהם קשים יותר למצב לנקודת המוקד, ועם אורכי מוקד קטנים יותר של העדשה הראשונה. כדי להפחית את ההשפעות נגרמות על ידי סטיות עדשה זה יתרון להעסיק במקום עדשות פשוטות באיכות גבוהה ומטרות מיקרוסקופ-תיקן אינסוף עם הגדלה נמוכה (10x או 20x).

פריסקופ: התקנת פריסקופ יש צורך לתרגם את קרן הלייזר הממוקדת במישור המוקד האחורי של המטרה, תנאי מוקדם להדמית TIRF. ניתן לבנות אותו בקלות משתי מראות שני אינץ ', שלב translational להתאמת המראה הראשון ולאחר למיצוב המראה השני כדי לשקף התרחב והתמקד קרן עירור למיקרוסקופ (איור 5).

מצלמה: מואר חזרה התקנים (EMCCD) צמוד מטעני אלקטרונים הכפלה משמשים באופן שיגרתי לההקלטה של ​​אותות מולקולה בודדים. סיבה לכך הוא יעילות קוונטית הגבוהה שלהם (עד 95%), מהירות רכישה גבוהה (עד 30 מגה-הרץ) ורעש נמוך יחסית. הרגעות ל-80 ° C מפחיתה רעש תרמי ונתמכת על ידי מספר המצלמות זמינות כרגע EMCCD. מגבלה של טכנולוגית EMCCD היא שרעש המצלמה מגדיל באופן ליניארי עם שני רווח המצלמה ושכבשה את האות. זה לא המקרה עם מצלמות מדעיות CMOS (sCMOS), שהם באופן משמעותי פחות יקרים ולפעול בשל הארכיטקטורה המיוחדת של שבב sCMOS גם הרבה יותר מהר מאשר מצלמות EMCCD. עם זאת בעיה הקשורים לטכנולוגית CMOS היא שרכישת התמונה עדיין חסרת מידה מסוימת של קריאת נתונים הכמותיים ברמה מולקולה בודדת, משום שכל פיקסל כולל רגישות זיהוי שונה. בעיקרון זה יכול להיות מתוגמל באמצעות הנורמליזציה פיקסל, אך הליך זה הוא בשום אופן לא טריוויאלי ^11. זו הסיבה שאנחנו עדיין מהססים מחדשלשבח מצלמות sCMOS למיקרוסקופיה מולקולה בודדת, אבל לנוכח ההתפתחות המהירה של טכנולוגיה זו, מצלמות sCMOS עשויות להפוך בקרוב את המצלמה של בחירה. מצלמות איטיות מצלמות CCD סריקה להימנע שונות רעש ופיקסל הקשורים להגברה כולם ביחד ולתמוך בקצבים המהירים ביותר רכישה אם הם יכולים להיות מופעלים במצב 'קינטית "מה שנקרא. במצב זה כל שבב המצלמה פרט לאזור של העניין (ROI) הוא רעול פנים, המאפשר להעסיק את השבב עצמו כהתקן אחסון. לאחר החזר ההשקעה חשופה בפעם הראשונה, את ההאשמות וכתוצאה מכך הם עברו לאזור רעול פנים של קו פיקסל שבב על ידי קו פיקסל, שבו התמונה מוגנת מחשיפה לאור נוספת. ברגע שההסטה של ​​כל הקווים של ההחזר על ההשקעה באזור רעול פנים הושלמה (בטווח תת-אלפית השנייה), ההחזר על ההשקעה עצמו הוא מוכן לחשיפה הבאה. מחזור זה חוזר על עצמו עד שכל קווי פיקסל של שבב CCD נזקפים. אז השבב לקרוא לאט עם ניכר reduרעש הקריאה CED. לדוגמא על שבב פיקסל 1000 x 1300, 20 ROIs של 50x50 פיקסלים ניתן להקליט ברצף מהיר. בגלל התמונות יישארו על השבב לזמן רב לפני שקראו את זה, זה קריטי כדי להבטיח מיסוך באיכות גבוהה וכדי לקרר את המצלמה (למשל עם חנקן נוזלי) כאמצעי להפחתת רעש תרמי מוגזם. כמה מצלמות EMCCD תומכות גם במצב קינטית.

תוכנה: התזמון של לייזרים, תריסים, AOMS וחשיפת מצלמה, כמו גם אחסון תמונה נכון הוא חלק בלתי נפרד לכל ניסוי הדמיה מוצלח. בעיקרון ניתן לתכנת פעולות מוגדרות רבות עם חבילות תוכנה זמינות שמגיעות עם המצלמה. חבילות תוכנה מסחריות לתמוך במספר גדול של ציוד היקפי חומרה, אשר יכול להיות מיושם עם ידע טכני קטן.

מחולל פעימות, רכישת נתונים (DAQ) לוח (עם אנלוגי וערוצי פלט דיגיטליים) ואוסצילוסקופ: מחולל פעימות היאבחירה מצוינת להמיר פולסים הדק לפולסים של זמן ומתח מוגדרים. לייזרי דרך זו ניתן לשלוט במדויק על תפוקת כוח ולמתוזמן באלפית השני לטווח תת-אלפית שנייה. לוחות DAQ עם יציאות אנלוגיות להשיג את אותה ולשלב בקלות לתוך לוח האם של המחשב דרך חריצי PCI. משך דופק, משרעת ותדירות מאומתים עם אוסצילוסקופ.

מארז של נתיב קרן עירור כל: כדי למנוע תנודות בפרופיל העירור בשל convections אוויר נתיב קרן עירור כל צריך להיות סגור מסביבת המעבדה שלו. צעד זה חשוב במיוחד בעת ביצוע מיקרוסקופיה TIRF. רכיבים אופטיים גם מוגנים מפני אבק והעין האנושית מחשיפת אור הלייזר. מארזים יכולים להיות בקלות לבנות מלוח הכרטיס שחור, שניתן לרכוש בחנויות אספקת אמנויות.

כדי לקבוע את הנזילות של שחזור SLB הקרינה לאחר Photobleacהינג מדידות (FRAP) ¹² מבוצעים. לFRAP קיומם של שני נתיבי קרן עירור רצוי (ראה איור 3). נתיב הקרן הראשון נועד תמונת הקרינה של bilayer. ניתן לעשות זאת בתצורת TIRF ועם עוצמת אור נמוכה. נתיב הקרן השני צריך לאפשר לדופק אקונומיקה קצר אך אינטנסיבי וצריך להיות מוגדר באינו TIRF-מצב, כך שהוא עוזב את המטרה לאורך הציר האופטי. פתח עגול ניתן להציב לתוך נתיב קרן עירור (ראה איור 8) להקרין פרופיל אקונומיקה עגול ומושלם עם קצוות מוגדרים. על מנת תמונת צמצם זה על מטוס האובייקט, המיקום האופטימלי שלה יהיה במישור המוקד של עדשה 3 (ראה איור 3). עם זאת, בשל אורך המוקד הארוך של העדשה, תמונת צמצם באיכות מספקת יכולה גם להיות שנוצרה, כאשר הצמצם ממוקם בעמדות מעט השתנו.

לאחר שלא בוצעהוא ההדמיה ניסוי נתונים הגולמיים יש לנתח כראוי. כמה פרוטוקולי צעד-אחר-צעד מוצעים, אשר מכסים את ההתאמה של ההגדרות הראשיות (לדוגמא כוח הארה וזמן, זווית TIRF), רכישה וניתוח הנתונים.

1. דור וFunctionalization של מישורי SLBs

1. ערבוב של השומנים
   1. כדי להגיע 10% נת"ע-ניקל / 90% הרכב שומנים POPC DGS לפזר 45 מ"ג של POPC ו -6.9 מ"ג DGS נת"ע-ניקל בכלורופורם בבקבוק 250 מיליליטר תחתי עגול. לשמור על הנפח של כלורופורם נמוך (רק כמה מיליליטר) להתאדות זה בשלב הבא. ל1% / 99% הרכב שומנים POPC DGS נת"ע-Ni להשתמש 49.5 POPC מ"ג ו0.69 מ"ג DGS נת"ע-ניקל.
   2. הסר את כלורופורם באמצעות מאייד סיבובי לאט - עלייה מעל טמפרטורת הסביבה הוא לא הכרחי. לחלופין, לפוצץ אותו בתוך ברדס כימי בזרם של גז אינרטי כגון חנקן או ארגון. אמנם עושה את זה כל הזמן להפוך את הבקבוק כדי לאפשר תצהיר שווה של השומנים הייבוש במחצית התחתונה של הבקבוק התחתון העגול.
   3. ברגע המכריע של כלורופורם הוא התאדה, לצרף את בקבוק ואקום O / N כדי להסיר את כלורופורם כמותית.
      הערה: שלב זה הוא קריטי כדי למנוע זיהוםשל חלבונים ותאים עם כלורופורם רעיל בשלבים מאוחר יותר ועל מנת להבטיח נזילות bilayer שומנים.
2. דור של שלפוחית ​​קטנה unilamellar (SUV של) משומנים מיובשים
   הערה: שלפוחית ​​קטנה unilamellar (רכבי שטח) הן בין 20 ננומטר ו -100 ננומטר בקוטר וניתן לייצר בקלות על ידי sonication אמבטיה. חול שומנים בדם, שיטה חלופית, יכול להצמיח רכבי שטח ו, תלוי בגודל הנקבובית של המסנן הגיש בקשה להבלטה, גם שלפוחית ​​unilamellar גדולה ("'לאב'), שהם 100 ננומטר ל -1,000 ננומטר בגודל. עם זאת, רכבי שטח הם מתאימים ביותר עבור יצירת SLBs.
   1. רכבי שטח דרך sonication אמבטיה (שמוצג בווידאו):
      1. Degass PBS. להשעות את תערובת שומנים המיובש עם 250 מיליליטר בקבוק עגול תחתון ב 10 מיליליטר PBS degassed.
      2. מלא את הבקבוק עם גז אינרטי כגון חנקן או ארגון, לסגור אותו עם פקק ולאטום את הבקבוק עם קלטת החיטוי.
      3. מניחים את הבקבוק האטום לsonicator אמבטיה וsonicate ההשעיה השומניםלא 120-170 W עד שהפך ברור. זה לוקח בין 30 ל 60 דקות.
      4. מעקב אחר ההתקדמות של Spectro-photometrically היווצרות שלפוחית: להתחולל שהקליטה של ​​תחליב חי בהשוואה לPBS נשארה קבועה ב234 ננומטר (כאינדיקטור משוער לריכוז השומנים בדם) עדיין צריך לרדת באופן משמעותי ב 550 ננומטר (עקב פיזור אור מופחת באמצעות חלקיקים גדולים יותר).
      5. לגלולת שלפוחית ​​שאינה unilamellar כבדה, אשר מפריעה להיווצרות של SLB רציף, גלולה ההשעיה השלפוחית ​​על ידי צנטריפוגה, ב150,000 XG במשך שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס ולאחר מכן במשך 8 שעות ב288.000 XG, 4 מעלות צלזיוס.
      6. סנן את supernatant דרך פילטר מזרק עם קוטר נקבובית של 0.2 מיקרומטר.
      7. מדוד את OD ב 234 ננומטר ו -550 ננומטר כדי לפקח על הבהירות של הכנת השלפוחית ​​ואת כמות שומנים השמאל.
      8. אחסן את שלפוחית ​​על 4 מעלות צלזיוס בארגון או חנקן. לחלופין, להשתמש בהשעית שלפוחית ​​להכנת bilayerבמשך כמה חודשים.
   2. רכבי שטח באמצעות חול שומנים:
      1. בקיצור, לעבור את ההשעיה השומנים כמה פעמים דרך מסנן עם גודל נקבובית של 0.1 מיקרומטר. ללא קשר לשיטת הייצור, צנטריפוגה ההשעיה השלפוחית ​​פעמיים (1H, 150,000g, 25 ° C, ואז 8h, 4 מעלות צלזיוס, 288.000 ז) לגלולת שלפוחית ​​שאינה unilamellar שהם כבדים יותר.
         הערה: כאשר מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס בגז אינרטי, שלפוחית ​​יכולה לשמש להכנת bilayer במשך כמה חודשים.
3. היווצרות של SLB וטעינה עם חלבון
   1. פנק 24 x 50 מ"מ # 1.5 שקופיות זכוכית עם 3: תערובת 1 של חומצה גופרתית מרוכזת ו -30% מי חמצן למשך 30 דקות.
      הערה: בשל האופי האגרסיבי של התערובת לקחת טיפול מיוחד, כלומר ללבוש חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות כפי שמוצג בווידאו!
   2. יש לשטוף את שקופיות זכוכית תחת זרם של DDH ₂ O מתוך בקבוק להשפריץ. מניחים אותם על דוכן טפלון ולתת להם להתייבשבמשך 10 עד 30 דקות.
   3. הסר את שקופיות זכוכית התחתונה של 8 או 16 תאים היטב, למלא את התחתית עם דבק אפוקסי ולמקם את שקופיות זכוכית נקיות ויבשות בתחתית התא מכוסה הדבק בזהירות. בואו הדבק להתקשות במשך כ -10 דקות. הסר דבק עודף מהתחתית.
      הערה: חותם חזק בין שקופיות הזכוכית וקאמרית גם יכולה להיות מושגת בקלות עם השימוש במשחת שיניים שני מרכיבי דוגמנות סיליקון, אשר מתקשה תוך 10 עד 30 דקות. חותם זה הוא לא חברה כמו דבק אפוקסי אבל עומד מתח גופני סדיר. לאחר הניסוי זה ניתן להסיר בקלות מהחדר, אשר לאחר מכן לשימוש חוזר בניסויים עתידיים.
   4. μl פיפטה 120 (60μl) של השעיה שומנים של פי 10 בדילול-PBS לכל טוב של 8 (16) - גם קאמרי (שהוכן כפי שתואר לעיל) ולתת צורת bilayer במשך 20 דקות. לשטוף בזהירות את bilayer פעמיים עם 15 מיליליטר PBS. ברגע שbilayer יצר, זה חייב להיות תמיד שקוע במאגר ולא להיות חשוף לאוויר. ממלא כל גם כל דרך עם PBS, ואז לקחת את 330μl (קאמרי 8 היטב) או 165μl (קאמרי 16 היטב). יש 350μl (175μl) עזב בבאר. להוסיף 50μl (25μl) של קוקטייל המכיל חלבונים מתויגים מדולל PBS היטב כל אחד (400 או 200 μl סופי) ולדגור על RT במשך 60 דקות בחושך. צפיפות חלבון פני השטח יכולה להיות מותאמת על ידי שינוי ריכוז החלבון בשלב דגירה זה.
   5. לשטוף היטב כל פעמיים עם 15 מיליליטר PBS.
      הערה: בדרך כלל, יש להשתמש SLBs בניסויים לא יותר מ 6 שעות לאחר הטעינה שלהם עם חלבון. במהלך תקופה זו, התאוששות לאחר photobleaching fluorophore נשארה עד 95% וללא אובדן החלבון הקשורים bilayer יכול להיות מזוהה. צפיפות החלבון צריכה להיקבע לפני הניסוי (ראה להלן).
   6. שלב אופציונאלי: כדי לבדוק מחייב הלא ספציפית של החלבון DGS נת"ע-ניקל המכיל SLB, לשטוף את SLB פעם אחת עם PBS המכיל 300 מ"מ imidazole. המקצועןהחלבון צריך לבוא לגמרי.

2. הגדרת מיקרוסקופ

1. לבניית מערכת מיקרוסקופ מסוגל לאתר הקרינה של fluorochromes אחת מתייחס להמלצות האמורות במבוא.

3. מדידות כוח

הערה: fluorophores ניתן רוויה בקלות עם אור העירור עודף. זה מאיץ photobleaching ללא רווח נוסף בפליטה ולכן יש להימנע מכך. כדי לייעל את תאורת מדגם צפיפות הספק העירור יש למדוד ישירות בדגימה. מדידות מסוג זה יכול גם לשמש כנקודת התייחסות לניסויים עתידיים. יתר על כן, לדעת את היחס בין כוח הקלט ופלט הלייזר הוא מועיל כאשר הערכה שבו האור הולך לאיבוד במערכת ההדמיה.

1. הזז את קורה העירור לתנוחה הזקופה, כך שהוא עוזב את המטרה בזווית של 90 מעלות.
2. מניחים את הראש של מד הכח על o העליונהF הקרן ולמדוד את כוחה של הקרן (= P). לתעד את התוצאה.
3. שימוש בפריסקופ, להפוך את הקרן למצב TIRF ותמונת bilayer ניאון הומוגני ללא פגע. כדי להימנע ממקום הלבנה ורווית אות CCD צפיפות ניטראלית (ND) לסנן עם צפיפות אופטית (OD) של 2 עד 3 לתוך נתיב אור העירור.
   1. מדוד את הספירה המשולבת של השדה המואר כולו (= אני _{סך הכל).} כמו כן, למדוד את גודל השטח המואר (= _{סך הכל).} מדוד את הספירה המשולבת (= אני _מרכז) של נקודת המרכז המוארת מקסימאלי, כמו גם את הגודל של המקום (= _מרכז).
4. מדוד את אות הרקע לפיקסל (= B) או מחוץ לאזור המואר או בלי תאורת מדגם.
5. להחסיר אות הרקע מהתוצאות שנמדדו ב3.). עושה זאת על ידי הכפלת מספר הפיקסלים של האזור בשאלה (כל אזור מואר או נקודה במרכז) עם הרקעספירה לכל פיקסל. (= אני _סה"כ - .b _כולל ואני _מרכז - _מרכז .b).
6. מחלקים את משולב ורקע תיקן אות של נקודת המרכז על ידי האות המשולבת ומתוקן רקע של כל תחום התאורה.
   הערה: התוצאה מציינת את החלק היחסי של כוח מוחלט ממוקם בתוך מקום המרכז (= (אני _מרכז - _מרכז .b) / (אני _סה"כ - .b _כולל)). כפל של תוצאה זו עם P הכח נמדד ב2. תוצאות) בכוחו של אור המאיר את נקודת המרכז.
7. לקבוע את גודלו של מקום _מרכז בμm². לשם כך מחלקים את גודל פיקסל המצלמה במיקרומטר על ידי ההגדלה של המטרה, לקחת את הריבוע של התוצאה כμm² לפיקסל.
   1. לחלופין למדוד את גודל פיקסל בתמונה עם השימוש בשקופית מיקרומטר מונחת על מיקרוסקופ ולקחת את הריבוע של התוצאה כאזור לפיקסל. Multiply ערך זה על ידי מספר הפיקסלים הממוקמים בתוך מרכז הנקודה כדי להגיע לאזור המקום המואר.
8. מחלקים את הכח P מאיר את מקום המרכז על ידי הגודל של נקודת מרכז _{מרכז, μm²} לחשב את עוצמת התאורה למיקרומטר ^2. דוגמא ניתנת באיור 6.
9. ערכי צפיפות הספק נמדדו באינו TIRF תאורה הם בדרך כלל נמוכים יותר מאלה קיימים בTIRF תאורה ^13, אשר גם תלוי בזווית המדויקת שבו אור הלייזר משתקף לחלוטין. כדי להגיע לצפיפויות הכח הנוכחיות תחת תאורת TIRF, תמונה מכוילת חרוזי ניאון של קוטר 0.1μm הן שבאינו TIRF וTIRF. היחס של עוצמות הקרינה נמדד בחרוז TIRF ולא TIRF מצב מסתכם C מקדם המרה, המאפשר המרה של ערכי צפיפות ההספק נמדדו לאלה יעילים תחת תאורת TIRF (משוואת 1).
   צפיפות הספק _TIRF = C • צפיפות הספק _{שאינו TIRF} (משוואת 1)
   עם C = _{שאינו TIRF} עוצמת חרוז _{T IRF} / עוצמת חרוז

4. מדידות צפיפות

1. לקבוע את האות הממוצעת של fluorophores הפרט ממוקם על bilayer. מולקולות MHC-מצורף bilayer עמוס פפטידים ניאון הן אידיאליים למטרה זו מאז החלבון: stoichiometry התווית הוא בדיוק אחד. אם אקונומיקה הכרחית כל התוויות על bilayer בשדה הראייה ולתת את הקרינה לשחזר לדמיין fluorophores היחידה.
   1. שיא תמונות ברצף מהיר (למשל להחיל רכישת הזרמת פרוטוקול) ולעקוב אחר מולקולות בודדות ניידות על פני כמה מסגרות. לקבלת מידע נוסף עיין באיור 7.
2. לקבוע מולקולה בודדת וקרינה בתפזורת רק בתוך ROI זה. לשלב את האות של החזר על השקעה, שהוא גדול מספיק כדי ללכוד 99% או יותר מפונקצית נקודת ההתפשטות של הפולט אחת. כאשר העסקת מצלמה עם גודל פיקסל של 16-20 מיקרומטר (האמור במפרט המצלמה של היצרן), מטרה בהגדלה של פי 100 וצמצם מספרי שווה או גדול מ 1.45, לקחת אזור של 7 על ידי 7 פיקסלים עם שיא עוצמת ממוקם במרכז הכיכר.
3. כדי לקבוע את אות הרקע, לשלב את הסעיפים של ריבוע 7 על ידי 7 פיקסלים שכנים, אשר אינו מכיל אות הקרינה. הפחת את הרקע מאות המולקולה בודדת כדי לקבוע את הערך המתוקן לפלואוריד מולקולה בודדescence. בחר אותות בלבד, אשר עדיין נראה לעין במסגרת הבאה.

חזור על שלב 4.2 חמישים לכמה מאות פעמים. ממוצע האות מתוקנת רקע. אם תרצה, להתוות ערכי עצמת מולקולה בודדים כמו היסטוגרמה. אופציונאלי: לנצל את תוסף מתאים של חבילות תוכנת קוד פתוח (למשל ImageJ) או לעבד את הנתונים באמצעות תוכנה מסחרית (למשל Metamorph, התקנים מולקולריים). משתמשים מנוסים יכולים לכתוב תכנית הניתוח שלהם ב- Matlab או חבילות תוכנה דומות.

מניחים מסנן צפיפות ניטרלי של 2 ומעלה לתוך נתיב העירור ולקחת תמונות של bilayer ניאון המכיל חלבונים שכותרתו עם אותו fluorophore. רשום את עוצמת פיקסל הממוצעת באותו ההחזר על ההשקעה המשמשת למדידות עוצמת מולקולה בודדות. רשום את זמן החשיפה של מדידות הקרינה בתפזורת. מדוד את אותו המקום בלי תאורה לחיסור רקע.

כדי לקבוע את צפיפות החלבון בתוך דושכבה, להכפיל את עוצמת פיקסל ממוצע מתוקן רקע הקרינה תפזורת נקבעה בשלב 4 במספר פיקסלים למיקרון המרובע (לדוגמא 41.5), על ידי 100 (אם מסנן ND עם OD של 2 הועסק) או 1,000 (אם ND מסנן עם OD של 3 שימש) ואת זמן החשיפה בשימוש בשלב 2 ולחלק אותו על ידי אות המולקולה בודדת הממוצעת שנקבעה בשלב 3, זמן החשיפה השתמש בשלב 2 ומספר fluorophores לחלבון.

5. בדיקת היושרה של bilayer

1. הכן bilayer ניאון ולמקם אותו על הבמה מיקרוסקופ כפי שתואר לעיל.
2. התאם את המיקוד ולקחת תמונה של bilayer במצב TIRF. החל דופק אקונומיקה קצר אך אינטנסיבי שבאינו TIRF מצב ללקטוע את הקרינה בתוך ROI בצורת דיסק קטן.
3. קח תמונה של bilayer במצב TIRF בעצימות נמוך מייד לאחר הלבנה ולאחר מכן כל חמישה עד עשר שניות כדי לפקח על המהירות של התאוששות הקרינה.
4. מויש לאזור אחר על bilayer ובצע את השלב 2 ו3. קחו תמונה אחרת במצב TIRF בעצימות נמוכות 5 דקות אחרי דופק אקונומיקה. לקבוע את עוצמת _אני שולח _{אקונומיקה} באזור אקונומיקה ולהשוות אותו לעצמה לפני הלבנת אני ₀ בתחילת הניסוי (אין הלבנה צריכה התרחשה) כדי לחשב את החלק הנייח (IF) כדלקמן:
   שבר נייח IF (%) = (אני ₀ - _אני שולח _{אקונומיקה)} / (אני ₀ - רקע) x 100,
   עם רקע = עוצמה נמדדת בהחזר על ההשקעה ללא אור עירור מיושמת
   אם צריך להיות פחות מ -10% (באופן אידיאלי פחות מ -5%).

הארכיטקטורה של מערכת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מולקולה בודדת מתוארת בפירוט רב באיור 2. חלקים בודדים כגון רכיבים אופטיים ורכיבי חומרה אחרים מוסברים במבוא. נתיבי קרן עירור האופטיים, אשר להצמיח באופן מוגדר לTIRF ולא TIRF תאורה, מוצגים והסבירו באיורים 3 עד 5. שימו לב למיקום של מפצל 50:50 הקורה מול מראה פריסקופ הראשון ממוקם ב שלב מיקרומטר לתרגום (איור 5). מפצל קרן זו כופה את קרן TIRF משמשת להדמיה (מסומנת בירוק) והקרן שאינו TIRF (מסומנת באדום) המשמש להלבנה או הפעלה מוגדרת צמצם מקומי בתיווך אור מדגם (כמתואר באיור 3). השבילים בשילוב האור (איור 5, הצביעו בכתום) משתקפים דרך מראה פריסקופ השני ליציאה האחורית של MICR ההפוךoscope. כפי שהוסבר באיור 4 ומתואר באיור 2, היישום של שתיים או שלוש עדשות קמורות מתרחב פרופילי קרן לייזר ומתמקד קרן הלייזר על גבי מישור המוקד האחורי של המטרה להצמיח שתי אלומות collimated מאיר את המדגם בTIRF ו , בהתאמה, שבאינו TIRF.

דוגמא לערכים שנמדדו בעוצמה הנדרשת לחישוב צפיפות ההספק בדגימה מוצגת באיור 6. אות הרקע הממוצעת לתופחת מעוצמות שנמדדו באזור המואר ומרכזי (המשמש להדמיה), נקבעה באזור בתוך שדה הראייה, שאינו מוארת בקרן הלייזר (כאן 7089 ספירה). העוצמות מתוקנות הרקע הממוצעת של המואר (1,684 ספירה) ואזור המרכז (4830 ספירה) לאחר מכן מוכפלים בגדלי האזור המקביל ללהצמיח עוצמות משולבות (1.471x 10 8 סעיפים לאזור המואר ו3.424 x 10 7 סעיפים לאזור המרכז). היחס של העוצמות משולבות בתוך האזורים המרכזיים ומוארים מניב את החלק היחסי של הכח הכולל המאיר את האזור המרכזי (0.23 או 23%). כפי שניתן לראות בסרט, את הכח הכללי צריך להיות נחוש במטרה בשימוש במד כוח במצב תאורה שאינו TIRF. בדוגמא שלנו זה מותאם ל5 mW, ובכך נותן לעליית כוחה של 5 mW x 0.23 = 1.15 mW באזור המרכז. מאז סכום 41.5 פיקסלים בדוגמא שלנו ל1 מיקרומטר 2, יש האזור המרכזי גודל של 7089 פיקסלים /41.5 פיקסלים x מיקרומטר 2 = 170.8 מיקרומטר 2. חלוקת כוחו של האור המאיר את האזור המרכזי (1.15 mW) על ידי אזור זה (170.8 מיקרומטר 2) מניבה כוח ממוצעצפיפות של 0.7 קילוואט / 2 סנטימטר באזור המרכז.

איור 7 כולל תמונות ותוצאות עוצמת המקבילה fluorophores היחידה שנרכשה ברצף מהיר (לשנייה 100 מסגרות, כלומר עם מסגרת של 10 מילים-שני זמן). כדי לכמת את עוצמת האות של אזור מלבני של שבע הממוצעת על ידי שבעה (= 49) פיקסלים, המכסה את אות הקרינה, נקבעה. יתר על כן האות הממוצעת של הרקע נקבעה בתוך אזור מלבני של שבעה שבעה פיקסלים בסמיכות של אות המולקולה בודדת. האות הממוצעת מתוקן הרקע מוכפלת במספר הפיקסלים באזור (= 49) ללהצמיח אות אחת מולקולה (מסומנת באותיות מודגשות).

ניסוי FRAP נציג נועד להעריך את הניידות של חלבונים שכותרתו הקרינה קשורים-SLB מוצג באיור 8. הערה באיור 8 א repetiשימוש tive של קרן התרחבה בעצימות נמוכות הדמיה ולייחד שנייה יותר צר וצמצם מוגדר קרן בעוצמה גבוהה לאבלציה fluorochrome המהירה בנקודת הזמן השנייה אפס. עוצמות ממוצעת מופחת רקע בתוך העיגול הצהוב, שכבר מנורמל על ידי ערך העצמה הממוצע הראשוני לפני דופק אקונומיקה, הם זממו באיור 8B נגד הזמן כדי להקליט את המהירות ואת המידה שבה הקרינה התאוששה. כפי שניתן לראות, יותר מ -90% (מסומנים בקו הירוק) של עוצמת bilayer הראשונית התאושש בתוך 75 שניות הבאות אבלציה fluorochrome. כתוצאה מכך פחות מ -10% מהחלבונים המשובצים בSLB המוצג הם נייחים.

איור 1. מתווה סכמטי של מערכת SLB. SLBs () עשוי POPC (90-99%) והשומנים סינטטיים DGS נת"ע-Nאני (1-10%). הם יוצרים באופן ספונטני כאשר משטחי זכוכית נקיים נזקפים עם רכבי שטח בהיקף של השומנים המתאימים. (ב) לאחר שנוצר, יכול להיות מעוטר SLBs אלה בקלות עם חלבונים מסיסים מורחבים או עם C- אחד או תג N- מסוף המכיל עשר histidines (12H, ל הדימרים ICAM-1) או חלבון מולקולת שיתוף גירוי B7-1 ומולקולת הידבקות דוגמא מורחב עם שני תגים המכילים שש histidines כל (2x6H, למשל דימר αβMHC הכיתה השני). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

איור 2. סקירה כללית של נתיבי העירור ופליטת קרן. לייזרי יון גז (למשל Ar + או Kr +) יכול להיות מופעל לסגירת מהירה עם השימוש של מו האופטי acousto dulators. דיודות לייזר זמינות כיום באורכי גל רבים ומייצגות אלטרנטיבה מצוינת כפי שהם יכולים להיות מווסת באופן אלקטרוני במייקרו-הזעם. שים לב שקרן לייזר יכולה להיות מותאמת בקלות עם שתי מראות (dichroic) ופיצול ושילוב עם השימוש במפצלי אלומה פשוט להצמיח שני נתיבים או יותר קורה. בדוגמא זו קרן TIRF הדמיה (לפקח על אירועים) וקרן אקונומיקה (לאו fluorophores אקונומיקה או צילום להפעיל מולקולות בכלוב באופן מוגדר צמצם) משמשות. יכולים להיות מופעלים בשני נתיבי העירור בנפרד זו מזו באמצעות השימוש בתריסים נוספים. פריסקופ מאפשר לתרגום קרן הלייזר הממוקדת במישור המוקד האחורי של המטרה ליצור תאורת TIRF של המדגם. תמונת הניאון ניתן לפצל spectrally עם השימוש במפצל קרן פליטה לפני רכישה עם השימוש במצלמה אולטרה-רגיש (למשל EM-CCD או CMOS מצלמה מדעית).קבצים / ftp_upload / 53,158 53158fig2large.jpg "target =" .com / / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. התאמת תאורת TIRF ידי תרגום הקרן הממוקדת במישור המוקד האחורי של המטרה. כפי שניתן לראות נקודה של קרן לייזר המוקד מוסט בתוך מישור המוקד האחורי של המטרה מהמרכז לפריפריה באמצעות טרנסלוקציה של הקרן (באמצעות הסדר מראה פריסקופ). כתוצאה מכך אלומה מקבילה עוזבת את המטרה בתאורה מוטה עד לזווית קריטית שבו השתקפות פנימית מוחלטת קורה. שדה חלוף נוצר בממשק זכוכית התקשורת שבו השתקפות כוללת מתרחשת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זה דמות.

4. מערכות אופטיות פשוטות איור להתמקד קרן הלייזר למישור המוקד האחורי של המטרה. כך או שלוש או שתי עדשות יש צורך להרחיב את קרן הלייזר ולהפנות אותו למישור המוקד האחורי של מטרת TIRF. שתי מערכות עדשה מכילות שגיאות הקשורים עדשה פחות משלוש מערכות עדשה ועשויות להיות מתאים יותר ליצירת קרן TIRF ההדמיה. שלוש עדשות עשויות להיות עדיפות כשמכוונות להרחבת קרן מוגדרת ונקודת תאורה עם קצוות חדים, כפי שניתן היה דרושות ללימודי העסקת צילום הפעלה או -bleaching. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/53158fig5.jpg "/>

איור 5. מבואר תצלום של נתיב הקרן בחלק האחורי של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כפי שכבר תואר באיור 2 מקל אחד בקלות ליישם שתי אלומות עירור, אחד בTIRF (מסומן בירוק) האחר במצב-TIRF שאינו (שצוין ב אדום). אלה הפכו מעולף עם השימוש במפצל 50:50 אלומה (BS). עדשות קמורות (L1 ו- L2) ממוקמות בקורה בהתאמה להתמקד על מישור המוקד האחורי של המטרה (לא מוצג). פריסקופ המורכב משתי מראות (M1 ו- M2) מנחה שני הקורות דרך נמל הכניסה למיקרוסקופ. המראה הראשון (M1) ניתן להעביר לשימוש בשלב תרגום (TS) (על ידי סיבוב בורג מיקרומטר כפי שצוין) להעביר אחד של קורות למצב TIRF. ברגע שTIRF כבר נקבע, הקרן השנייה (המשמשת לצילום הלבנת או -activation, כאן הצביעה באדום) יכולה להיות מותאמת באופן עצמאי של קרן TIRF לעזוב את המטרה שבאינו TIRFמצב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6. מדידת הכח בשטח של נקודת התאורה המרכזי. כמצוין בחר אזורים המתאימים של עניין, המשקפים רקע, האזור כולו המואר (IA) ואזור המרכז (CA), שבו אירועים יהיו מאוחר יותר יירשמו. לחסר ערכי רקע מאלו שנרשמו לIA ו- CA ולשלב את העוצמות על ידי הכפלת עוצמות ממוצעת מתוקנות עם מספר הפיקסלים הנוכחיים בתוך כל אזור (= עוצמות משולבות). מחלקים את עוצמת המשולבת של CA על ידי זה של IA להגיע לשיעור של כוח הקרן מאיר את CA (בדוגמא זו: 23%). לקבוע את כוחו של האור המאיר את CA על ידי הכפלת כוח הקרן הכוללת (כאן: 5 מ 'W) עם השיעור מאיר את CA (כאן: 0.23). כדי לקבוע את גודלו של האזור המרכזי להכפיל את השטח (כאן: 7089 פיקסל) עם גורם פיקסל לאזור המרת גודל (כאן: 1 / 41.5 מיקרומטר 2 -1 פיקסל). כדי להגיע לצפיפות ההספק הממוצעת של אור העירור מאיר את CA, לחלק את הכח (כאן: 1.15 mW) על ידי הגודל של CA. (כאן: 170.8 מיקרומטר 2) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7. Quantitation של אותות מולקולה בודדים. () כמובן זמן של fluorophores אחת על SLB. אזור בגודל 7 x 7 פיקסל של עניין (ROI, צהוב) ממוקם סביב האות לכימות. רקע נקבע מ7 x 7 פיקסלים שכניםהחזר על השקעה (ירוק). (ב) לכמת בעוצמות פיקסל ממוצעת רשומות. כדי לקבוע את אות המולקולה בודדת, ערכי רקע (ROI הירוק) מופחתים ערכי אות (ROI הצהוב) ומוכפלים 49. (ג) בעוצמות מולקולה יחידה של fluorophore אחד הם זממו נגד זמן. שים לב, כי נקודת זמן msec 90 מושמטת כfluorophore נמצא בתהליך של הלבנה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור שחזור הקרינה 8. לאחר photobleaching ניתוח (FRAP) כדי לקבוע את היושרה של SLB. () FRAP בוצע על bilayer ביצוע IEK / MCC-אלקסה פלואוריד 647. תמונה 10 כל הניסוי מוצגת. (ב) quantitation FRAP של הניסוי שמוצג ב(). ערכים מצביעים על עוצמות ממוצעת (I) בהחזר על ההשקעה הצהובה מוצג ב() מחולקות בעצמה הראשונית (אני O) לפני ההלבנה. נקודות נתונים אדומות מוצגות ב(), הקו הירוק מציין 0.9 התאוששות של עוצמות מקוריות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרס כלכלי מתחרה.