מאמר שיטה

הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה"כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר

9.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53163

⸱

15 בספטמבר 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1BioEnergy Science Center, National Renewable Energy Laboratory

במאמר זה

סיכום

מבנה דופן התא של הצמח ותכונות הכימיה מוערכים כדי לזהות חומרי גלם אידיאליים לדלקים ביולוגיים וביו-חומרים. לשיטות סטנדרטיות יש מגבלות כאשר הן מיושמות על ערכות נתונים גדולות. שיטות טיפול מקדים בתפוקה גבוהה, סכריזציה של אנזימים וספקטרומטריית מסה של קרן פירוליזה-מולקולרית משוות מספר רב של דגימות ביומסה עם ירידה בזמן הניסוי ובעלות.

תקציר

ההמרה של ביומסה ליגנוצלולוזית לדלקים, כימיקלים וסחורות אחרות נחקרה כנתיב אפשרי אחד להפחתת השימוש במקורות אנרגיה שאינם מתחדשים. על מנת לזהות לאילו צמחים, מתוך מאגר מגוון, יש את התכונות הכימיות הרצויות ליישומים במורד הזרם, יש להשוות תכונות, כגון תכולת תאית וליגנין, או שחרור סוכר מונומרי לאחר סכריזציה אנזימטית. פרוטוקולי הניסוי וניתוח הנתונים של שיטות הניתוח הסטנדרטיות יכולים לגזול זמן, ובכך להגביל את מספר הדגימות שניתן למדוד. שיטות תפוקה גבוהה (HTP) מקלות על החסרונות של השיטות הסטנדרטיות, ומאפשרות סינון מהיר של דגימות זמינות כדי לבודד את בעלי התכונות הרצויות. מחקר זה ממחיש את צינורות שחרור הסוכר HTP וספקטרומטריית המסה של קרן פירוליזה-מולקולרית המופעלים במעבדה הלאומית לאנרגיה מתחדשת. צינורות אלה אפשרו הערכה יעילה של אלפי מפעלים תוך הפחתת זמן ניסוי ועלויות באמצעות צמצום כוח אדם וחומרים מתכלים.

מבוא

כאספקה ​​הגלובלית של דלקים שאינם מתחדשים וירידות המוצרים הקשורים בם, מדענים כבר קראו תיגר ליצור דלקים וכימיקלים דומים ממקורות 1 מופק מצמח. היבט מרכזי של עבודה זו הוא קביעה שמינים של צמחים עשויים להיות מתאימים לייצור של דלק ביולוגי וביו-חומרים 2,3. בדרך כלל, בחומרי גלם אלה מוערכים ליגנין, תאית, ותוכן hemicellulose; כמו גם הרגישות שלהם לפירוק (סרבנות) באמצעות טיפול מקדים תרמי, מכאני, ו / או כימי עם או בלי saccharification אנזים שלאחר מכן. ניתוח מפורט יותר נמצא בשימוש כדי לקבוע את ההרכב הספציפי של השברים ליגנין והמיצלולוז, כמו גם פעילויות אנזים אופטימליות הדרושות. שינויים מהונדסים של צמחים שאינם מהותית יש תכונות אידיאלי להמרה ביוכימי או תרמה-לסחורות הרצויות סיפקו חוקרים עם מקור התרחב מאוד של סירחומר הזינה ential 4. שיטות האנליטיות סטנדרטי לכימות התכונות הכימיות של צמח, ואילו שימושי למדי עבור קבוצות מדגם קטנות, אינן מתאימות לסינון המהיר של מאות או אלפי דגימות 5-7. שיטות HTP המתוארות במסמך זה כבר התפתח במהירות וביעילות כדי להעריך מספרים גדולים של גרסאות יומסה לשינויים בתא קיר סרבנות השפלה תרמה-ו / או אנזימטי.

זה קריטי כדי להבין שמבחני מיון HTP מתוארים במסמך זה לא תוכנן על מנת למקסם את ההמרה או תשואה. המטרה היא לקבוע הבדלים יחסי בסרבנות הפנימית של דגימות ביומסה בנושא. כתוצאה מכך, רבים מהצעדים הניתוח שונים מהמבחנים "הטיפוסיים" הגיור ביומסה, שבו המטרה היא להשיג יחס המרה מרבי או מידה. לדוגמא, נמוכות חומרות טיפול מקדים ופעמים הידרוליזה אנזים קצרות משמשות למקסם שונהences בין דגימות. ברוב המקרים, עומסי אנזים גבוהים יחסית משמשים להפחתת הבדלים עקב וריאציה ניסיונית בפעילות אנזים, אשר יכולה להטות את התוצאות באופן משמעותי.

טכניקות מהירות לקביעת ההרכב של צמח תא-קירות וסוכרי monomeric המשוחררים הבאות saccharification האנזימטית כוללות רובוטיקה, צלחות מותאמות אישית, thermochemically תואמות 96-היטב, ושינויים בשיטות מעבדה סטנדרטית 8-11 ופרוטוקולי אינסטרומנטלי, כגון ספקטרוסקופיה רטט (אינפרא אדום (IR), קרוב אינפרא אדום (ניר), או ראמאן) ותהודה מגנטית גרעינית (NMR) 12-17. מתודולוגיות אלה הן מפתח לבידוד חומרי גלם גבוה של תאית או תוכן ליגנין נמוך, או לאלה צפויים להניב גלוקוז, קסילוז, אתנול הגבוה ביותר, וכו 'שיטות אלה אפשרו ניתוחי downscaled שמעסיקים כמויות קטנות יותר של ביומסה ומתכלים, שהובילו לירידה בניסוי חשבון 18 . תכונה נוספת של גישה המתודולוגית זה היא שתנאי ניסוי שונים יכולים להיות במהירות, ובמקרים מסוימים בו-זמנית, העריכה. לדוגמא, במגוון של אסטרטגיות שונות לפני הטיפול או קוקטיילים אנזים ניתן לבדוק, המאפשר פרמטרים הניסיוניים האופטימלי ביותר להיות מזוהים במהירות ובמועסקת. חומרי גלם פופולריים, כגון התירס Stover 9, 8,10 צפצפה, פסולת קני סוכר 8, וקליפות 8 נבדקו בהצלחה תוך שימוש בשיטות אלה HTP.

ליגנין סה"כ והרכב monomeric ליגנין גם לכמת נפוץ תכונות יומסה. ירידות בתוכן ליגנין הוכחו להגדיל את העיכול אנזימטי של סוכרים 19,20. התפקיד שיחס monomeric ליגנין (לעתים קרובות כפי שדווח syringyl / guaiacyl (S / G) תוכן) משחק בפירוק של דופן תא הצמח הוא עדיין בחקירה. דיווחים חלקם הצביעו על כך שההפחתה בS / Gיחס הוביל לתשואות גלוקוז מוגברות הבאים הידרוליזה 21, ואילו מחקרים אחרים לחשוף את המגמה ההפוכה 19,22. שיטות תפוקה גבוהות להערכה ליגנין ומונומרים שלה כוללות ספקטרוסקופיה רטט (IR, NIR, וראמאן 23-26) בשילוב עם ניתוח רב משתני, וספקטרומטריית פירוליזה קרן מולקולרית מסה (pyMBMS) 27,28.

בעת פיתוח שיטות HTP להקרנה ביומסה, כמה שיקולים נפרד צריכים להיות כל הזמן בראש. אחד היבטים מרכזיים הוא את המורכבות של השיטה. מהי רמת המיומנות הנדרשת לטכניקה? ניתוחי chemometric, למשל, דורשים מיומנויות ספציפיות לבנייה, להערכה ולשמירה על מודלים חזוי. השיטות סטנדרטי להציג צעדי ניתוח הכנה או נתונים לא רצויים או להעסיק ריאגנטים רעילים. פיתוח המודלים הוא תהליך מתמשך שבו נתונים חדשים שולבו המודל לאורך זמן כדי להגדיל את חוסנו של המודל. מצידך עודeration הוא החיסכון בעלויות והירידה פעמים ניתוח ניסיוניות של שיטות תפוקה גבוהה המוצעות. אם השיטה היא די מהירה, אבל יקרה מאוד, זה לא יכול להיות טכניקה אפשרית למעבדות רבות לאמץ. השיטות מתוארות בכתב היד הזה הן גרסאות של טכניקות סטנדרטיות, שונה כדי להגביר את יכולות התפוקה. פרוטוקולים אלה כמותית למדוד את תכונות יומסה של עניין ללא צורך בפיתוח מודלים חזוי. זוהי תכונת מפתח של שיטות אלו, שכן שיטות חיזוי, ואילו בתערוכת מתאמים חזקים עם סטנדרטי ניתוחים המשמשים לפיתוח המודלים, אינם מדויקים כמו בעצם מדידת הכמות של ריבית לדגימות. ואילו שיטות המשמשות בעצם scaled למטה גרסאות של שיטות אנליטיות ספסל בקנה מידה סטנדרטית, דיוק ודיוק נסחרים במהירות ותפוקה. בעיקר, תוצאה זו היא בשל טעויות גבוהות יותר בפיפטה נפח הקטנה ובמשקל; כמו גם הגדיל את יםההטרוגניות בשפע כגודל מדגם היא ירד. בעוד יכולים להיות מוקרנים סטי מדגם גדולים והשוואה, בזהירות רבה צריכה להיות מופעלת בעת ביצוע השוואות בין מסעות פרסום נפרדים ולתוצאות ספסל בקנה מידה.

צעדי הזמן רב ביותר כרוכים המניפולציה הפיסית של ביומסה. דגימות שחיקה עשויות להימשך מספר דקות לדגימה, כולל ניקוי הטחנה בין דגימות. באופן ידני בטעינה, פריקה, ומין ניקוי ומילוי וריקון שקיות תה ושקיות דגימה היא גם מאוד עבודה אינטנסיבית. בעוד כל צעד יכול לקחת דקות או יותר, אלפים עושים דגימות עשויים לקחת שעות רבות ואפילו ימים. הרובוטים יכולים לטעון צלחת כור טיפוסית עם ביומסה בכ 3 עד 4 שעות או 6 עד 8 ​​יום צלחות -1 רובוט -1. מצב זה תלוי בפרמטרים המדויקים המשמשים גם כסוג והכמות של ביומסה להיבדק. מילוי צלחות כור במים, לדלל חומצה, או אנזים נעשה במהירות באמצעות רובוט טיפול נוזלי. Pטיפול חוזר של מחסנית צלחת (1 עד 20 צלחות כור) לוקח בין 1 ל 3 שעות כאשר הרכבה, להתקרר, והפירוק כלול. הידרוליזה אנזים לוקחת 3 ימים וניתוח הסוכר דורש כ 1 שעה של זמן הכנה בתוספת 10 דקות לכל צלחת כור כדי להשלים את assay ולקרוא את התוצאות. לוח זמנים שבועיים של ימים לפני הטיפול וניתוח נקבעו להכיל את לוח הזמנים של עבודה סבירה, מזעור מאמצים מוזר שעות ביממה וסוף השבוע למרכיב האנושי של assay ומאפשר עיבוד ~ 800 ל -1,000 דגימות בשבוע באופן שוטף. התפוקה המקסימלית תלויה במספר גורמים, בעיקר כמה חומרה (רובוטים, צלחות כורים, וכו ') וכמה "תוכנה" (כלומר, כוח אדם) זמינים לעשות את העבודה הידנית. הגבול העליון המעשי הוא 2,500 עד 3,000 דגימות / שבוע; עם זאת, פלט שדורש פעולה 7 ימים בשבוע ומתמחים סטודנט מרובה וטכנאים. לשם השוואה, 3,000 דגימות על ידי HPLC ידרשו כ 125 ימים של סםניתוח ple תוספת עבודה נוספת של משקל ידני דגימות לכורים ודגימות סינון לפני הניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

קביעת 1. תפוקה גבוהה של גלוקוז ותשואות קסילוז בעקבות אנזימתי Saccharification 9,29

  1. לדוגמא הכנה (שחיקה, דה-עמילן, הפקה, לפני טיפול)
    1. לטחון לפחות 300 מ"ג של כל דגימה ביומסה באמצעות טחנת Wiley, מסך שהחלקיקים עוברים דרך 20 רשת כגון (850 מיקרומטר). העברה לשקיות רוכסן אנטי סטטי (בדרך כלל בר-קוד) ומידע מדגם שיא למסד הנתונים ברקוד.
    2. להוסיף כ 250 מ"ג או יותר של ביומסה הקרקע משקית אנטי סטטית לממוספר (עם עיפרון, לא משתמש בדיו או סמן) תה שקית, בזהירות להפשיל שקיות התה, להיות בטוח לקפל את הקצוות על ביומסה כדי למנוע הפסד בדה-עמילן וחילוץ.
    3. לעטוף את שקית התה נסגר באמצעות חוטי נחושת מצופה פח. רשום את מספר שקית תה לכל דגימת המינימרקטים.
    4. הכן פתרון אנזים העמילן-דה מאנזימים מסחריים (בדרך כלל, 0.25% (V / V) glucoamylase (~ 1,600 AGU / L) ו1.5% (V / V) אלפא-עמילאז (~ 2,900 KNU-S / L) 0.1 נתרן אצטט M (pH 5.0)). הכן 16 מיליליטר לגרם של ביומסה בתפזורת או 500 מיליליטר לשקית תה 120 דגימות. הערה: עומסים מסוגלים להסיר עמילן מביומסה הקרקע צריכים להיקבע באופן אמפירי על ידי בדיקת עמילן לאחר עיכול עם מגוון רחב של עומסי אנזים ויחסים.
    5. במכל פלסטיק, להוסיף 16 מיליליטר של תמיסת אנזים העמילן-דה לז 1 של ביומסה קרקע בתפזורת. לפרוטוקול דה-עמילן אצווה, להוסיף 120 שקיקי תה 500 מיליליטר של תמיסת חיץ-האנזים.
    6. דגירה שבייקר ב 55 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות (± 4), 120 סל"ד להסיר עמילן אפשרי.
    7. לאחר הדגירה העמילן-דה, לשטוף ולהשרות ביומסה בכמה ליטרים של מים ללא יונים למשך 30 דקות. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות כדי להסיר מלחי חיץ שיכול לגרום להקפצה (היווצרותן של בועות גז בפתרון שיכולים לגרום לעלייה פתאומית ואלימה ברמה של הפתרון, וגרם אתנול נוזל חם למפלמתוך תגובת כלי) במהלך החילוץ.
    8. בעקבות השטיפה הממצה של ביומסה-מעומלנים דה, הנח את שקיות התה לתוך טור Soxhlet להפקה. אין אצבעון נדרש לצעד זה.
    9. הגדרת ריפלוקס Soxhlet, באמצעות 95% אתנול ולחלץ את הדגימות למשך 24 שעות.
    10. הסר את שקיות התה מהכור Soxhlet ופרוש בשכבה אחת על מגש שטוח.
    11. אפשר הדגימות לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת החדר במנדף.
    12. לפרוש שקיות התה ולהחזיר את ביומסה היבש לשקיות אנטי סטטי המינימרקטים מקוריים.
      הערה: השקיות אנטי סטטי הן יעילים בהפחתת חשמל סטטי ביומסה, שיפור מאפייני הטיפול. אם אפשרויות אחסון אחרות משמשות, ביומסה נוספת עשויה להידרש בהתאם להיצמדות יומסה לצד השני של מיכל האחסון.
    13. העבר לפחות 50 מ"ג של ביומסה היבש להופר המינימרקטים (באמצעות יותר חומר הוא טוב יותר מחלק מדויק). Sיכולים ברקודים של שקיות אנטי סטטי והופר מקבל על מנת להבטיח מעקב אחר מדגם מדויק.
    14. מין עומס על מוצקים במשקל רובוט, הקדשת תשומת לב לצו של הדגימות במדפים. לטעון מספיק צלחות כור להכיל את כל הדגימות ובחרו את הפרוטוקול מחלק המבוסס על מספר הצלחות בשימוש.
    15. רובוט שוקל 5 מ"ג של הדגימות מיובשות (± 0.3 מ"ג) ל96-גם צלחות נירוסטה עמידה חומצה. לשקול את 3 משכפל של כל דגימה חולקה סביב הצלחת כדי למזער כל וריאציות מקומיות.
    16. כולל 8 דגימות ביומסה השליטה של ​​חומר רגיל ביומסה מאופיינת היטב כדי לעקוב אחר ביצועי assay. לצלחות מרובות, השימוש במין ביומסה סטנדרטי מרובה יהיה למזער להיסחף גודל חלקיקים נגרמו על ידי הסינון במינן על חזרו מחזורים מחלק.
      הערה: בכל צלחת, לא אמורה להיות 24 דגימות עם 3 חזרות, 4 כדורי סרק בהיקף של מים והאנזים דה-יוניזציה, ו8 controLS, באמצעות ביומסה סטנדרטית מתאפיינת בעבר. 3 בארות הפינה של כל אחד מ4 פינות של הצלחת שמורות לסטנדרטים הסוכר.
    17. בדוק בארות סטנדרטיים ריקות וסוכר לחלקיקי ביומסה תועים ולהסיר אם קיימים.
    18. הוסף 250 μl של מים ללא יונים היטב כל אחד, ולאטום את הצלחות עם polytetrafluoroethylene מגובה דבק סיליקון קלטת (PTFE).
    19. באמצעות קצה 1/8 "מלחם, לנקב את קלטת PTFE בכל יציאת אדים (117 סך הכל) לכל צלחת. השתמש בצלחת ריקה שנערמו על צלחת כור אטומה כמדריך ולהגביל PTFE תנועת סרט.
    20. הצמד את הצלחות באופן הדוק עם 0.031 אטמי "עבים מחוזק זכוכית PTFE (טרום-אגרוף עם חורים ליציאות קיטור) בין צלחות וצלחות ריקות בחלק העליון ותחתון של ערימה. Pretreat הדגימות באמצעות כור קיטור מוגדר 180 מעלות צלזיוס במשך 17.5 דקות, או שילובי טמפרטורה / זמן אחרים המבוססים על חומרה רצויה.
    21. צלחות כור מגניבים עד 50 °; C על ידי הצפה במים ללא יונים.
  2. אנזימתי Saccharification
    1. הכן פתרון saccharification האנזימטית בהיקף של 8% (V / V) פתרון אנזים ב1.0 M נתרן ציטרט, pH 5.0. הכן 5 מ"ל לכל צלחת כור. הערה: דילול הנדרש צריכים להיקבע על בסיס תוכן פעילות וחלבון של פתרון אנזים מניות הספציפי.
    2. כאשר הצלחות הם מגניבים, צנטריפוגות בהרוטור דלי מתנדנד ב1,500 XG במשך 20 דקות. הסר איטום סרט. הערה: צלחות אלו הן כבדות ומפרטי צנטריפוגות צריכים להיבדק לתאימות.
    3. הוסף 40 μl של פתרון מניות אנזים 8% לכל אחד גם (אנזים 70 מ"ג לביומסה ז).
    4. לאטום עם קלטת PTFE חדשה. מניחים צלחת אטומה למהדק צלחת מגנטי.
    5. לערבב בעדינות את הדגימות על ידי היפוך (לפחות 15 פעמים), ולדגור על 50 מעלות צלזיוס במשך 70 שעות.
    6. כאשר saccharification הגיע למסקנה, לערבב על ידי היפוך צנטריפוגות הצלחות ב1,500 xגרם במשך 20 דקות.
  3. Assay סוכר
    1. להכין סט של גלוקוז 6 וסטנדרטים כיול קסילוז משולב ב0.014 חיץ M ציטרט (pH 5.0) החל 0-0.750 מ"ג / מיליליטר (0, 0.2, 0.3, 0.45, 0.65, 0.75 ומ"ג / מיליליטר מומלץ) ו0-0.600 מ"ג / מיליליטר (0, 0.1, 0.2, 0.35, 0.45, ו -0.6 מ"ג / מיליליטר מומלץ) לגלוקוז וקסילוז, בהתאמה.
    2. הכן את גלוקוז אוקסידאז / peroxidase (GOPOD) וריאגנטים דהידרוגנז קסילוז (XDH) על פי הוראות שבערכה.
    3. בעזרת פיפטה, להסיר 200 μl של נוזל מהבארות 4 הפינה ובארות קצה סמוכות לבארות הפינה (12 בארות כוללת) של צלחת הכור.
    4. בעזרת פיפטה, לוותר 180 μl deionized מים היטב בכל צלחת דילול שטוח תחתונה קלקר 96-היטב. אל תוסיפו מים לבארות סטנדרטי פינה וסוכר 12 (להסיר טיפים אלה אם באמצעות ראש 96 ערוצים).
    5. בעזרת פיפטה, לוותר מגיב GOPOD 180 μl היטב בכל assay גלוקוז plאכלתי.
    6. בעזרת פיפטה, לוותר מגיב XDH 180 μl היטב בכל צלחת assay קסילוז.
    7. בעזרת פיפטה, להעביר 20 μl aliquots hydrolyzate מצלחת הכור 96-גם לצלחת הדילול. Pipet מהחלק העליון של הבארות כדי למנוע מוצק ביומסה ונוזל שיורית בבארות פינה. מערבבים על ידי טחינה דקה לפחות 10 מחזורים.
    8. בעזרת פיפטה, להעביר 110 μl תקני סוכר, בשני עותקים, לבארות הפינה של צלחת הדילול.
    9. בעזרת פיפטה, להעביר 20 aliquots μl מצלחת הדילול לצלחות assay גלוקוז וקסילוז. מערבבים על ידי טחינה דקה.
    10. דגירה צלחות גלוקוז וassay קסילוז בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות. לשבור את כל בועות לפני שטח בזהירות לפני הקריאה. אקדח חום עבר בקצרה על פני השטח של הצלחת עובד היטב.
    11. באמצעות קורא צלחת 96-גם אולטרה סגול / גלוי, להגדיר את אורך הגל שנמדד 510 ננומטר ולהקליט את הספיגה נגד ריק מגיב.מדידה זו מנטרת את היווצרות quinonimine, שהוא פרופורציונאלי לריכוז סוכר. ריכוז הסוכר מחושב מעקום הכיול המבוסס על תקני הכיול שהוכנו ב1.3.1.
    12. באמצעות קורא צלחת 96-גם אולטרה סגול / גלוי, להגדיר את אורך הגל שנמדד עד 340 ננומטר ולהקליט את הספיגה. מדידה זו מנטרת את ההפחתה של NAD + לNADH, שהוא פרופורציונאלי לריכוז קסילוז. ריכוז קסילוז מחושב מעקום הכיול המבוסס על תקני הכיול שהוכנו ב1.3.1.

קביעת 2. תפוקה גבוהה של סה"כ ליגנין ותוכן monomeric ליגנין שימוש pyMBMS 28

  1. לדוגמא הכנה
    1. לטחון ולחלץ את ביומסה באמצעות השיטות שתוארו בצעדים 1.1.1, ו1.1.6-1.1.8. זה כולל טחינה והחילוץ של מערכת של סטנדרטים לשימוש שולט ניסיונית כ.
      הערה: measur pyMBMSements אינם חלקיקים בגודל תלוי, כך שאם באמצעות פרוטוקול pyMBMS רק, הכנת ביומסה צריכה להתבצע כדי לאפשר המדגם להשתלב בעל המדגם, <4 מ"מ.
    2. השימוש לוותר מרית קטנה כ 4 מ"ג (3 עד 5 מ"ג העדיף) של ביומסה מוכנה לכוס נירוסטה 80 μl המיועדת ל- סמפלר האוטומטי.
    3. ודא כי לפחות 10% מהדגימות להיות מנותחות תקני בקרה כגון אלה זמינים מהמכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (פסולת-8491 קנה סוכר; צפצפה-8492; אורן-8,493; או חיטת קש-8494). הסטנדרטי יכולים להיות גם כל מינים מקבילים לדגימות להיות מנותחים שכבר מאופיינים בשיטות סטנדרטית.
    4. באופן אקראי לטעון דגימות לתוך הכוסות האוטומטית סמפלר באמצעות פינצטה כדי למנוע הטיה בשל סחף ספקטרומטר אפשרי לאורך זמן. הערה: אקראי טיפוסית של הדגימות יכלול המדידה של כל הדגימות פעם אחת, ואחריו מחדש אקראימסדר גודל של הדגימות למדידה כפולה. תוכניות אקראיות זמין באופן מקוון.
    5. באמצעות חור-אגרוף סטנדרטי, לייצר באופן ידני דיסקי מסנן זכוכית מגיליונות סיבי זכוכית / D סוג, ללא קלסר. החזק את מסנן סיבי זכוכית העגול עם פינצטה, מרכז זה על כוס המדגם, ולדחוף לתוך המדגם באמצעות מפתח ברגים אלן 3.5 מ"מ להגביל את החומר בכל כוס במהלך הניסוי.
  2. פרוטוקול אינסטרומנטלי
    1. כייל את ספקטרומטר המסה באמצעות סטנדרטי שיש עוצמות שיא על מגוון השלם של תרכובות שיכולים להתקיים לדגימות ניסוי ידוע. עבור דגימות ביומסה טיפוסיות, להשתמש perfluorotributylamine (PFTBA).
    2. הגדר את זרימת גז שיעור ספק הליום 0.9 ליטר / דקה באמצעות זרימת גז מטר.
    3. הגדר את התנור האוטומטי סמפלר לטמפרטורת פירוליזה של 500 מעלות צלזיוס וטמפרטורת ממשק 350 מעלות צלזיוס באמצעות התוכנה האוטומטית סמפלר. הערה: "נירוסטה 1/8 מחוממתקו ההעברה העטוף בקלטת חום שמחברת את-סמפלר האוטומטי לספקטרומטר המסה נשלט באמצעות בקר חום ב 250 מעלות צלזיוס.
    4. בגין רכישת נתונים על ספקטרומטר המסה ולחכות לפחות 60 שניות כדי לקבל נתונים מספיקים לאוסף ספקטרום רקע.
    5. התחל בשיטה האוטומטית סמפלר האוטומטי עם המפרטים מ2.2.2. הערה: סמפלר-אוטומטי טיפות כל דגימה בנפרד לתוך הכבשן האוטומטי סמפלר. סך הכל זמן רכישת נתונים הוא כ 1.5 דקות; עם זאת, פירוליזה של מדגם מ"ג טיפוסי 4 תושלם לאחר 30 שניות.
    6. תוכן רשומה כולל יון (TIC) של כל דגימה באמצעות תוכנת ספקטרומטר מסה בקצב סריקה של 0.5 שניות. שיא עוצמות בין מ '/ z 30-450.
      הערה: תרכובות ביומסה אופייניות להשתמש יינון רך בגיל 17 eV. המכשיר יכול להקליט מרווחים גדולים יותר ממ '/ z 1 1,000; עם זאת, קצב סריקה יהיה מוגבל על ידי כוח מעבד מחשב.
    7. הסר רקע מהספקטרום באמצעות manual לשפר תכונה בתוכנה. הערה: חלק 60 סריקה של קו הבסיס בתחילת איסוף הנתונים משמשת לחישוב ערך ממוצע רקע. ספקטרום רקע ממוצע זה הוא להסיר את ספקטרום המדגם הניסיוני באופן אוטומטי בתוכנת ספקטרומטר המסה.
    8. לייבא את קובץ טקסט בעמודה אחת שנוצר על ידי תוכנת ספקטרומטר מסה המכילה את נתוני רפאים עבור כל דגימה, לתכנית מסד נתונים ולשלב את כל הדגימות לתוך מסד נתונים אחד. להוסיף metadata החלים על הגיליון האלקטרוני. לייבא את הנתונים בפורמט (גיליון אלקטרוני / קובץ CSV) לחבילת תוכנה סטטיסטית ואומרים לנרמל את הספקטרום לחשבון לוריאציה בהמונים מדגם pyrolyzed.
    9. השתמש בחבילת תוכנה סטטיסטית כדי לבצע ניתוח מרכיב עיקרי (PCA) תוך שימוש בנתונים ספקטרליים לנתח קיבוץ של הדגימות סטנדרטי המשוכפלות בשימוש במדידות, כמו גם להעריך שפסגות הם חלק בלתי נפרד מהסיווג כימיתרכובות בעומסי עלילה 28.
      הערה: קבוצות PCA הדגימות המבוססות על הדמיון של הספקטרום שלהם, ומאפשר בדיקה של הסטנדרטים כדי לאמוד את השגיאה ניסיונית בשל סחף מכשיר בזמן הריצה.
    10. כדי לחשב את syringyl ליגנין (S) / guaiacyl יחס (G), לסכם האזורים של פסגות S (m / z = 154, 167, 168, 182, 194, 208, ו -210) ולחלק בסכום של פסגות G ב124, 137, 138, 150, 164, 178 ו.
    11. כדי לחשב כולל תוכן ליגנין, לסכם פסגות ליגנין עם m / z = 120, 124, 137, 138, 150, 152, 154, 164, 167, 178, 180, 182, 194, 210 ו.
    12. לחשב גורם תיקון לקנה המידה של מדידת pyMBMS לשיטה סטנדרטית להערכה הכולל ליגנין, כגון ליגנין Klason. מחלקים את ערך ליגנין Klason של התקן הבודד על ידי תוכן ליגנין הכולל שנמדד שלמדגם סטנדרטי באמצעות pyMBMS.
    13. החל גורם תיקון זה לכל המינים דמויי בערכת הנתונים. חזור על פעולה עבור כל סוג של ביומסה ניתח. NOTE: גורם התיקון יכול להשתנות בהתאם לאופן משמעותי על S / G של ביומסה ניתחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההשפעה המשולבת של הטיפול המקדים תרם-וsaccharification אנזים שלאחר מכן נמדדת כפונקציה של המסה של גלוקוז וקסילוז שוחררה בסוף assay. התוצאות מדווחות במונחים של מיליגרם של גלוקוז וקסילוז שוחרר לגרם של ביומסה. זאת בניגוד מוחלט לנתונים שדווחו ממבחני ספסל בקנה מידה, אשר בדרך כלל הוא כפי שדווחו תשואה תיאורטית אחוזים המבוססים על ניתוח הלחנה של החומר מוצא. כפי שהוא עדיין לא מעשי לבצע ניתוח הלחנה באלפי דגימות בשבוע, הנתונים שדווחו כטוב ביותר רמות המרה על בסיס המוני. זה מאפשר להערכת מדגם סביר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

צעדי הכנת מדגם המפתח לקבלת נתונים מדויקים ושחזור בעת ביצוע ניסויי הקרנת תפוקה גבוהה הם כדלקמן:

סוכר השחרור Assay:

באופן כללי, דגימות ערוכים הרבה הנע בין כמה עשרות לכמה אלף בכל פעם. כל צעד גדול מתבצע בדרך כלל על כל הדגימות לפני לנוע קדימה על מנת למזער וריאציות בהכנה בין דגימות. דה-עמילן לא היה במקור חלק מהפרוטוקול וניתן להשמיט במקרים מסוימים. דגי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות למתמחה אוולין פון ניידה שסיפקה תובנות חשובות ביותר לגבי הכנת דגימות ביומסה עבור שני הצינורות בעלי התפוקה הגבוהה שנדונו בכתב יד זה. תמיכה בפיתוח עבודה זו וכתב היד ניתנה על ידי המרכז למדעי הביו-אנרגיה. המרכז למדעי ביו-אנרגיה הוא מרכז מחקר ביו-אנרגיה של משרד האנרגיה האמריקני הנתמך על ידי המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי במשרד המדע של משרד האנרגיה. המעבדה הלאומית לאנרגיה מתחדשת (NREL) היא מעבדה לאומית של משרד האנרגיה האמריקאי ליעילות אנרגטית ואנרגיה מתחדשת, המופעלת עבור DOE על ידי הברית לאנרגיה בת קיימא, LLC. עבודה זו נתמכה על ידי משרד האנרגיה של ארצות הברית תחת חוזה מס. DE-AC36-08-GO28308 עם המעבדה הלאומית לאנרגיה מתחדשת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Biomek FX תחנת עבודה אוטומטיתבקמן קולטרBiomek FXמטפל נוזלי אוטומטי
טחנת וויליתומאס סיינטיפיק3375E15 (דגם 4), או 3383L20 (מיני-מיל)
שקיות אנטי סטטיותMinigrip*MGST4P025032.5x3 אינץ', מספר ספקים זמינים
חוט נחושת מצופה פחMcMaster-Carr8871K84קוטר 0.016 אינץ', שקיות תה חוט לכופף ולהישאר
שקיות תהHerbcoPress n' brew3.5x5 אינץ'
גלוקו-עמילאזNovozymesSpirizyme Fuel 
אלפא-עמילאזNovozymesLiquozyme SC DS
נתרן אצטט טריהידראטכל ספקמגיב
חומצה אצטיתכל ספקמגיב דרגה
190 הוכחה (95%) אתנולכל ספקריאגנט כיתה
הופריםFreeslate
96- ובכן C-276 Hastelloy לוחותאספן עיבוד שבבי (לאפאייט, קולורדו)N / A (נבנה בהתאמה אישית)
1/8 אינץ' קצה ברזל הלחמהסירס
סיליקון דבק מגובה טפלון קלטת3M51803 אינץ' רחב (36 יארד)
תמיסת אנזיםNovozymesCellic CTec2
חומצת לימון מונוהידראטכל ספק
טריסודיום ציטראט דיהידראטכל ספק
חד פעמי, פוליסטירן 96 בארות צלחותגריינר ביו-וואן655101או שווה ערך; ספקים מרובים זמינים
גלוקוז אוקסידאז/פרוקסידאז ערכת בדיקת MegazymeK-GlucMegazyme D-glucose ערכת בדיקת
קסילוז דהידרוגנאזMegazymeK-Xyloseערכת בדיקת D-xylose
סטנדרטי גלוקוזMegazymeK-Glucערכת בדיקת D-גלוקוז
פתרון סטנדרטי xyloseMegazymeK-Xyloseערכת בדיקת Megazyme D-xylose
כוסות מדגם נירוסטהFrontier LaboratoriesPY1-EC80F
Pall662278x10 אינץ'; עיגולים מנוקבים עם ניקוב חורים סטנדרטי
בגאס קנה סוכר חומרי הזנה ביומסה שלמיםNIST8491
מזרח כותנה (צפצפה) חומרי הזנה של ביומסה שלמהNIST8492
אורן מונטריי ביומסה שלמהNIST8493
חיטה חומרי הזנה קש ביומסה שלמהNIST8494
כימי כימי כימי כימיכימי פתרון יריעות סיבי זכוכית

מקורות

  1. U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. Perlack, R. D., Stokes, B. J. , Oak Ridge National Laboratory. Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , Earthscan. 53-80 (2009).
  3. Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
  6. Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
  7. Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
  8. DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
  9. Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
  10. Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
  11. Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
  12. Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
  13. Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
  14. Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
  15. Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
  16. Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
  17. Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
  18. Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
  19. Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
  20. Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
  21. Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
  22. Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
  23. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93(2014).
  24. Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
  25. Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
  26. Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
  27. Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
  28. Sykes, R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. Mielenz, J. R. 581, 169-183 (2009).
  29. Decker, S., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. Himmel, M. E. 908, Humana Press. 181-195 (2012).
  30. Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים