חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

סיכום

כאן, מוצג פרוטוקול ליצירת כרומוזום מלאכותי חיידקי זיהומי המכיל cDNA באורך מלא של ה-RNA הגנומי החיובי של נגיף דלקת המוח היפני. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לבניית cDNA פונקציונלי של נגיפי RNA חיוביים אחרים, מה שהופך אותו לכלי גנומי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של נגיפים.

תקציר

גנטיקה הפוכה, גישה להצלת נגיף זיהומי לחלוטין מ-cDNA משובט, חוללה מהפכה בתחום נגיפי ה-RNA החיוביים, שלגנום שלהם יש קוטביות זהה ל-mRNA תאי. מערכת הגנטיקה ההפוכה מבוססת cDNA היא שיטה מכוננת המאפשרת מניפולציה ישירה של ה-RNA הגנומי הנגיפי, ובכך מייצרת וירוסים רקומביננטיים למחקרים מולקולריים וגנטיים של רכיבי RNA נגיפיים ותוצרי גנים בשכפול ופתוגנזה ויראליים. הוא גם מספק פלטפורמה רבת ערך המאפשרת פיתוח של חיסונים מוגדרים גנטית ווקטורים נגיפיים להעברת גנים זרים. עם זאת, עבור נגיפי RNA חיוביים רבים כגון נגיף דלקת המוח היפני (JEV), ה-cDNA המשובטים אינם יציבים, ומהווים מכשול מרכזי לבנייה והתפשטות של ה-cDNA התפקודי. כאן, הדוח הנוכחי מתאר את השיקולים האסטרטגיים ביצירה והגברה של cDNA זיהומי באורך מלא של JEV יציב גנטית כרומוזום מלאכותי חיידקי (BAC) תוך שימוש בהליכי הניסוי הכלליים הבאים: בידוד RNA נגיפי, סינתזת cDNA, תת-שיבוט ושינוי cDNA, הרכבה של cDNA באורך מלא, ליניאריזציה של cDNA, במבחנה סינתזת RNA ושחזור וירוסים. פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה כללית החלה על שיבוט cDNA באורך מלא עבור מגוון נגיפי RNA חיוביים, במיוחד אלה עם גנום באורך של >10 kb, לווקטור BAC, שממנו ניתן לתמלל RNA זיהומי במבחנה עם RNA פולימראז בקטריופאג'.

מבוא

לירולוגים RNA, כניסתו של טכנולוגיית ה- DNA רקומביננטי בשנתי ה -1970 המאוחרות שאפשר להמיר את הגנום רנ"א נגיפי לשיבוטי cDNA, אשר לאחר מכן יכול להיות מופץ כפלסמידים בחיידקים למניפולציה הגנטית של נגיפי RNA. ¹ להיות וירוס RNA הראשון מולקולרי המשובטים היה Qβ bacteriophage, וירוס RNA חיובי גדיל שמדביק coli Escherichia. פלסמיד המכיל עותק cDNA מלא של RNA הגנומי Qβ הוליד פאגים Qβ זיהומיות כאשר הציג לE. coli. ² זמן קצר לאחר מכן, בטכניקה זו יושמה לנגיף פוליו, נגיף RNA חיובי גדיל של בני אדם ובעלי חיים. פלסמיד הנושא cDNA באורך מלא של RNA הגנומי נגיף הפוליו היה מידבק כאשר transfected לתאי יונקים ומסוגלים לייצר virions זיהומיות ³ בזה גישה "שהושק ה- DNA", צריך להיות עיבד cDNAs המשובט intracellularly ליזום שכפול רנ"א נגיפי.;עם זאת, לא ברור כיצד השעתוק הוא יזם ואיך התמלילים מעובדים לרצף הנגיפי הנכון. חשש זה הוביל לפיתוח של חלופה "שהושק RNA" גישה, לפיה עותק cDNA מלא של הגנום רנ"א הנגיפי הוא משובט תחת אמרגן מוכר על ידי א ' coli או RNA פולימראז הפאג לייצור RNAs הסינתטי במבחנה עם 'ו 3' טרמיני המוגדרים 5, שעובר את מחזור השכפול הנגיפי השלם כאשר הוכנסו לתאי מארח. ^4,5 ההצלחה הראשונה עם גישה זו דווחה לוירוס פסיפס ברום , ^6,7 וירוס RNA חיובי גדיל של צמחים. מאז, הגישה השיק RNA פותחה עבור מגוון רחב של וירוסי RNA חיובי גדיל, כולל caliciviruses, alphaviruses, flaviviruses, arteriviruses, וקורונה. ^1,4,5,8

בשני דנ"א ורנ"א השיק מערכות גנטיקה הפוכה, הבנייה של פולשיבוט cDNA L-אורך הוא המפתח ליצירת DNA או RNA של וירוסי RNA חיובי גדיל מדבק, אבל זה הופך להיות אתגר משמעותי טכני כמו הגודל של עליות הגנום נגיפיות. ^9-17 בפרט, הגנום RNA גדול של ~ 10 -32 Kb מציג שלושה מכשולים עיקריים לשיבוט של cDNA הפונקציונלי באורך מלא. ¹⁸ הקושי הראשון הוא הסינתזה של cDNA נאמן להעתיק, מאז הנאמנות של RT-PCR היא ביחס הפוך לאורכו של רנ"א הנגיפי. המשוכה השנייה היא נוכחותם של רצפים רעילים, מאז מולקולות RNA ארוכות יותר עלולות להכיל רצפים בלתי צפויים מסוגלים לבצע את בר cDNA בפלסמידים לא יציבים בE. coli. הנושא השלישי והקריטי ביותר הוא הזמינות של וקטור מתאים, שכן קשה למצוא וקטור שיבוט שיכול לשכן להוסיף cDNA ויראלי של> 10 KB. במהלך שלושת העשורים האחרונים, חסמים אלה היו להתגבר על ידי כמה התקדמויות בenzymology, מתודולוגיה,vectorology ד. ^1,4,5,8 מבין אלה, הפיתוח המבטיח וחדשני ביותר הוא השיבוט של וירוסים גדולים חיובי גדיל RNA כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי זיהומיות כ( BACS). וקטור BAC הוא פלסמיד נמוך עותק שיבוט (1-2 עותקים / תא) המבוסס על ה גורם פוריות coli, עם גודל ממוצע של ה- DNA להוסיף ~ 120-350 kb ^19-21 קטע DNA מוכנס לתוך וקטור BAC באופן דומה לשיבוט לתוך וקטורי שיבוט כלליים.; השיבוטים BAC וכתוצאה מכך הם יציבים לאורך דורות רבים בE. coli. ^22,23 עד כה, טכנולוגית BAC נעשה שימוש כדי ליצור שיבוטים cDNA מדבקים ל> 10 חברי שלוש משפחות חיוביות גדיל RNA וירוס, כלומר, Flaviviridae, ^24-29 Arteriviridae, ³⁰ וCoronaviridae. ^{9,16,17 , 31,32}

שימוש בוירוס דלקת מוח יפני (JEV) כדוגמא, את העבודה הנוכחית מדווחת נהלים מפורטים שיכול להיותמשמש לבניית BAC זיהומיות באורך מלא יציב מבחינה גנטית עבור מגוון רחב של וירוסי RNA חיובי גדיל. JEV הוא flavivirus zoonotic ³³ שמועבר בטבע בין ציפורים, חזירים, ומארחי חוליות אחרים על ידי וקטורי יתושים. ^34,35 בבני אדם, זיהום JEV יכול לגרום לדלקת קרום המוח הקטלנית לעתים קרובות החמורה המחלה נוירולוגית היפנית (י"א), ³⁶ אשר מתרחש ב אסיה וחלקים של האוקיינוס ​​השקט במערב, ^37,38 עם שכיחות שנתית משוערת של ~ 50,000-175,000 מקרים קליניים. ^39,40 הגנום של JEV היא 11 KB, מולקולה ~ חד-גדילים, חיובי תחושת RNA ומורכבת מסגרת קריאה פתוחה יחידה (ORF) מוקפת שני אזורי קידוד-עישון (NCRs) ב5 'ו 3' מסתיימת. ^41,42 ORF מקודד polyprotein שהוא ביקע על ידי מארח ופרוטאזות הנגיפית כדי לייצר 10 חלבונים בודדים, מיועד C, PRM, E, ns1, NS2A, NS2B, ns3 NS4A, NS4B, וNS5 בN- לכיוון C-מסוף. ^34,43,44 כמו כן, דוארטופס xtended של ns1 (ns1 ') בא לידי הביטוי על ידי -1 frameshifting ריבוזומלי בקודונים 8-9 של NS2A. ^45,46 של 11 חלבונים אלה, שלושה החלבונים המבניים (C, PRM, ו- E) הם חיוניים ליצירה של זיהומיות virions, ^47,48 ושמונת חלבוני nonstructural הנותרים (ns1 לNS5, וns1 ') הם קריטיים עבור שכפול נגיפי RNA, הרכבה ^49-51 חלקיקים, ^52-56 והתחמקות חסינות מולדת. ^57-59 שניהם 5' ו 3 "NCRs מכיל רצפי שימור ראשוניים ומבני RNA צורה משניים / יישונים, ^60-62 שהם חשובים לויסות שכפול רנ"א נגיפי. ^63,64

פרוטוקול זה מתאר את הכלים, שיטות והאסטרטגיות ליצירת באורך מלא BAC זיהומיות של JEV ₁₄ SA -14-2. ²⁸ שיבוט BAC פונקציונלי זה מכיל עותק מלא cDNA של RNA הגנומי JEV, ⁶⁵ אשר הקיף על ידי אמרגן לRNA פולימראז SP6 במעלה הזרםשל 5'-הסוף הנגיפי ואתר הגבלה ייחודי Xba אני במורד הזרם של 3'-הסוף הנגיפי במבחנה תעתיק ניגר. טכנולוגית BAC זה חל על בניית שיבוט מולקולרי cDNA פונקציונלי מלא עבור מערך של וירוסי RNA חיובי גדיל.

פרוטוקול

הערה: איור 1 מציג אסטרטגיה לבניית באורך מלא זיהומיות JEV cDNA כBAC ²⁸ טבלה 1 מספקת רשימה של oligonucleotides שימוש בפרוטוקול זה ^28..

1. חלץ רנ"א הנגיפי מחלקיקי JEV בתא Supernatants התרבות

1. התחל עם מדיום תרבית תאים המכיל JEV SA ₁₄ -14-2, וירוס חיסון י"א חי שדורש רמת בטיחות ביולוגית בלימת 2.
   הערה: כייל הנגיף הוא כ 1-3 × 10 ⁶ יחידות / מיליליטר יוצרי פלאק.
2. קח את הכשרת הבטיחות הביולוגית הכרחית לכל שיטות סטנדרטי המיקרוביולוגית, ציוד בטיחות, ומתקני מעבדה לפני העבודה עם JEV SA ₁₄ -14-2.
3. לטהר רנ"א הנגיפי מaliquot של מדיום תרבית תאים המכיל וירוס באמצעות פתרון monophasic של פנול וguanidine isothiocyanate ⁶⁶ (איור 1 א).
   1. מוֹדָעָהד 600 μl של מגיב monophasic 200 μl של supernatant התרבות בmicrotube 1.7 מיליליטר. Homogenize התערובת ביד רועד הצינור במרץ במשך 30 שניות ודוגרת במשך 5 דקות ב RT.
   2. להוסיף 160 μl של כלורופורם המדגם הומוגני. מערבבים היטב ביד רועדת הצינור במרץ במשך 15 שניות ומשאירה אותו במשך 2-3 דקות ב RT.
   3. צנטריפוגה lysate סך 13,400 ב× גרם במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס, וכתוצאה מכך הפרדה של שני שלבי נוזל, כלומר, שלב אורגני נמוך ושלב מימי עליון. מעבירים את השלב העליון המימי (פחות מ -200 μl) המכיל את הרנ"א לmicrotube חדש.
   4. לזרז את הרנ"א על ​​ידי הוספת 1 μl של 5 מיקרוגרם / גליקוגן μl 400 μl של isopropanol 100% ודוגרים במשך 10 דקות ב RT.
   5. צנטריפוגה את התערובת בז × 13,400 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant ולשטוף את גלולה RNA עם 1 מ"ל של אתנול 75% על ידי דופק vortexing 04:57פעמים וצנטריפוגה ב13,400 × גרם במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
   6. האוויר יבש גלולה RNA במשך 10 דקות ולפזר אותו ב -40 μl של DH ₂ O. אחסן את RNA חילוץ ב -80 ° C עד שימוש.

2. לסנתז סט של ארבע חופפים cDNA שברים (F1 כדי F4) פורש ויראלי הגנום RNA השלם על ידי שעתוק לאחור (RT) -PCR

1. בצע תגובת RT 20 μl עם aliquot 10 μl של רנ"א הנגיפי המטוהר כתבנית וצורה שונה של וירוס לוקמיה עכברי מולוני ההפוך transcriptase. ⁶⁷
   1. הגדר את תערובת 13 μl מכילה 10 μl של RNA המטוהר, תערובת dNTP 1 μl 10 מ"מ, 1 μl 4 pmol / פריימר μl, וμl dH 1 ₂ O. השתמש בפריימר הבר-ספציפי לכל תגובת RT: 1RT לF1, F2 2RT ל, 3RT לF3, ו4RT לF4.
   2. דגירה את התערובת על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, מקום על קרח דק 1, ולאחר מכן מהיר ספין כדי לאסוף את קונטהNTS בחלק התחתון של הצינור.
   3. הוסף 4 μl 5 × חיץ RT, 1 μl 0.1 M DTT, 1 מעכב RNase μl 40 U / μl, וμl 1 200 U / μl הפוך transcriptase. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה שלושה עד חמש פעמים.
   4. בואו להמשיך התגובה על 50 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן חום להשבית המדגם על 70 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. אחסן את cDNA ראשון גדיל מסונתז ב -20 ° C עד לשימוש.
2. בצע תגובת PCR 100 μl עם aliquot 5 μl של תגובת RT חום מומת כתבנית ופולימראז באיכות גבוהה DNA thermostable ⁶⁸ (איור 1).
   1. הגדר את תגובת PCR 100 μl על קרח, המכיל 5 μl של תגובת RT, 20 μl 5 × חיץ PCR, 4 μl תמהיל dNTP 10 מ"מ, פריימר קדימה 5 μl 10 מיקרומטר, 5 μl 10 מיקרומטר פריימר הפוכה, 1 μl 2 U / Μl DNA פולימרז, ו DH μl 60 ₂ O. השתמש בזוג פריימר הבר-ספציפי לכל reactio PCRn: 1F + 1R לF1 (2,573 נקודות בסיס), 2F + 2R לF2 (4171 BP), 3F + 3R לF3 (3922 BP), ו4F + 4R לF4 (1798 BP).
   2. מערבבים בעדינות על ידי שלושה עד חמש פעמים את הצינור מרפרף-אצבע ובקצרה צנטריפוגות כדי לאסוף את התוכן שלה בתחתית.
   3. בגין thermocycling עם שלב ראשוני denaturation של 30 שניות על 98 מעלות צלזיוס, ואחריו 25-30 מחזורים עם פרופיל PCR הבא: 10 שניות על 98 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 60 מעלות צלזיוס, ו1-2 דקות (30 שניות / KB) על 72 מעלות צלזיוס. אחסן את מוצרי ה- PCR על 4 מעלות צלזיוס עד ניתח.
3. הפעל aliquot 2-5 μl של כל תגובת PCR על 0.8% agarose ג'ל המכיל 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר ethidium ברומיד (EtBr) (איור 2).
   זהירות: EtBr הוא mutagen חזק ודורש חלוקי מעבדה, משקפיים בטיחות, וכפפות כדי להשתפשף וזהירות רבה כדי להיות שנצפה בשימוש, האחסון, וסילוקה.

3. subclone כל אחד מארבעת שברי cDNA (F1 כדי F4) לוקטור BAC ליצירת pBAC / F1 כדי pBAC / F4 בטכניקות מולקולריות y שיבוט

1. לעכל את הווקטור והכנס DNAs עם שני endonucleases ההגבלה המתאים, כדלקמן:
   1. בצע עיכול רציף של pBAC / PRRSV / פלורידה (וקטור), ³⁰ נגזר של פלסמיד pBeloBAC11 (7507 BP, U51113 מספר הצטרפות GenBank), עם PME אני ולא אני בהיקף כולל של 60 μl (המכיל ~ 500 ng DNA , 10 אנזים U, חיץ עיכול 1x, ו1 × BSA) על 37 מעלות צלזיוס במשך 12-15 שעות, אשר מניבה בר וקטור 15,426-נ"ב.
   2. בצע עיכול רציף של כל אחד מארבע amplicons cDNA (להוסיף) עם Sma אני ולא אני בהיקף כולל של 60 μl (המכיל DNA ~ 1 מיקרוגרם, 20 אנזים U, 1 × חיץ עיכול, ו1 × BSA) ב 25 מעלות צלזיוס (SMA אני) או 37 ° C (לא אני) 12-15 שעות, אשר מניבה הברים הכנס הבאים בגודל הרצוי: F1 (2,559 נקודות בסיס), F2 (4,157 נקודות בסיס), F3 (3908 BP), ו F4 (1784 BP).
2. לטהררצוי וקטור ולהכניס קטעי DNA על ידי מיצוי ג'ל.
   1. הפרד את המוצרים מתעכלים כפליים על 1% ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה המכיל 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר EtBr. לגזור להקה של קטע DNA הרצוי עם כמות מינימאלית של agarose (בדרך כלל ~ 200 μl) תחת אור אולטרה סגול גל ארוך.
   2. הוסף נפח שווה של חיץ TEM (10 מ"מ טריס-Cl, 1 mM EDTA, ו -10 מ"מ MgCl ₂₎ לנכרת agarose בmicrotube 1.7 מיליליטר. דגירה המדגם ב 72 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות, עם vortexing כל דקות 2-3 עד agarose נמס לחלוטין.
   3. הוסף נפח שווה של פנול-רווי חיץ מראש חימם, מערבולת במרץ דקות 1, וצנטריפוגות ב 13,400 × גרם במשך 10 דקות ב RT.
      הערה: התערובת מפרידה לשלב אורגני נמוך ושלב מימי עליון. מעבירים את השלב המימי העליון המכיל את ה- DNA לmicrotube חדש.
   4. הוסף נפח שווה של כלורופורם: אלכוהול isoamyl (24: 1), מערבולת דקות 1, וצנטריפוגות ב 13,ז 400 × 10 דקות ב RT. מעבירים את השלב העליון המימי לmicrotube חדש.
   5. הוסף 0.5 μl של 10 מיקרוגרם tRNA שמרים / μl, 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט, ו -2.5 כרכים של 100% אתנול. שמור את התערובת על קרח למשך 20 דקות.
   6. צנטריפוגה את התערובת על 13,400 × גרם במשך 10 דקות ב RT. הסר את supernatant ולשטוף את כדור DNA עם 1 מיליליטר של אתנול 70% על ידי דופק vortexing שלושה עד חמש פעמים וצנטריפוגה ב13,400 × גרם במשך 10 דקות.
   7. האוויר יבש גלולה דנ"א למשך 10 דקות ולפזר אותו ב -20 μl של TE חיץ (10 מ"מ טריס-Cl ו 1 mM EDTA [pH 7.6]).
3. לקשור את הווקטור הרצוי ולהכניס קטעי דנ"א באמצעות האנזים T4 DNA.
   1. הגדר את תגובת קשירת 20 μl מכילה 50-100 ng של DNA הווקטור, עודף טוחנת ~ פי 3 של ה- DNA להוסיף, 400 האנזים U T4 DNA, וחיץ × קשירה 1. דגירה תגובת קשירה על 16 מעלות צלזיוס למשך 12-15 שעות.
      הערה: כלול contr שליליתגובת ol, כלומר, וקטור בלבד ללא ההוספה, במקביל.
   2. לבצע ארבע קשירה נפרדת, כל אחד שהצטרף PME אני- לא אני שבר 15,426-נ"ב של pBAC / PRRSV / פלורידה עם 2,559-נ"ב (לF1), 4,157-נ"ב (לF2), 3908-נ"ב (לF3), או 1,784-נ"ב (לF4) Sma אני- לא אני שבר של אחד מארבע amplicons cDNA, כדי ליצור subclones pBAC / F1 כדי pBAC / F4.
4. להפוך את ה- DNA ligated לתוך E. coli DH10B בשיטת הלם -heat CaCl _2.
   1. קח 100 aliquots μl של CaCl ₂ -treated תאי DH10B מוסמך ⁶⁹ מאוחסנים ב -80 ° C ולהפשיר אותם על קרח.
      הערה: שימוש בתאים לכל שינוי 100 μl.
   2. הוסף aliquot 10 μl של תגובת קשירת DNA לתאים המופשרים 100 μl בmicrotube 1.7 מיליליטר, לערבב בעדינות על ידי הקשה על הצינור, ולשמור על קרח למשך 30 דקות.
   3. חום הלם תערובת ה- DNA בתאי במשך 45 שניות בwa 42 מעלות צלזיוסהאמבטיה ter, מניח על קרח למשך 2 דקות, ולאחר מכן להוסיף 900 ​​μl של מרק LB מחומם מראש לRT.
   4. דגירה תאי החום המום על 35 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, עם רעד ב225-250 סל"ד.
   5. מורחים 50 עד 200 aliquots μl של התאים בתרבית על צלחות אגר LB המכילות chloramphenicol 10 מיקרוגרם / מיליליטר (CML). שמור את הצלחות על RT, בצד ימין למעלה, עד שהם יבשים.
   6. הפעל את הצלחות הפוכות ולדגור על 35 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות.
5. לשחזר את ה- DNA BAC המשובט מתאי המארח בשיטת טיהור מבוסס עמודה (איור 1 ג).
   1. פיק שישה עד שמונה מושבות חיידקים מהצלחות אגר LB-CML ולחסן אותם ל 3 מיליליטר של מרק 2xYT המכיל 10 מיקרוגרם / מיליליטר CML. דגירה התרבויות על 35 מעלות צלזיוס במשך 10 שעות עם רעד נמרץ (225-250 סל"ד).
   2. לבודד רקומביננטי BAC DNAs 1-1.5 מיליליטר של תרבויות חיידקים באמצעות עמודות ספין, כמו בבימויו של היצרן. ⁷⁰ Elute DNA שחולץ (typing קאלי 100-200) ב -20 μl של TE חיץ.
   3. לבצע שני digestions אנזים הגבלה אנליטי של BACS המבודד ל~ 6 שעות בהיקף כולל של 10 μl, אחד לזהות את נוכחותו של הווקטור עם הוספה נכונה באמצעות אותו האנזימים המשמשים לשיבוט (ראה פרוטוקול 3.1), והשני כדי לבדוק את תקינות BACS המשובט עם אנזים מתאים (למשל, BGL השני, מש"ק אני, או Pst אני), יצירת תבנית בר הגבלה ייחודית.
   4. הפץ BACS המשובט בצורה הנכונה על ידי ייחס 500 μl של תרבויות חיידקים החיוביות (מפרוטוקול 3.5.1) ב500 מיליליטר של מדיום 2xYT-CML וטיפוח הבידוד במשך 6 שעות ב 35 ° C תוך רועד ב225-250 סל"ד. לטהר את ה- DNA BAC (בדרך כלל 10-20 מיקרוגרם) מתרבות 500 מיליליטר באמצעות עמודות מסנן, כפי שהומלץ על ידי היצרן. ⁷¹
      הערה: ארבע subclones BAC הראשוני, המכיל בר cDNA של RNA הגנומי JEV, עשוי להוכיח שיש בדואר או מוטציה לא רצויה יותר (ים) בהשוואה לרצף הקונצנזוס של הגנום הנגיפי ⁴² (המשמש כרצף התייחסות). כל מוטציה כזו צריכה להיות מתוקנת על ידי מכוון mutagenesis אתר מבוסס PCR לפני ההרכבה של באורך מלא JEV cDNA. ²⁷

4. יצירה באורך מלא JEV cDNA עם 5 'SP6 יזם ו'3 אתר RUN-OFF

1. הפוך שלושה שינויים גנטיים (ראו להלן פרוטוקולים 4.1.1-4.1.3) בcDNAs המשובט כדי לאפשר שעתוק ניגר במבחנה של RNAs הגנום באורך עם 5 האותנטיים 'ו 3' מסתיים של הגנום הנגיפי.
   1. להציג את אמרגן SP6 ישירות במעלה הזרם של סוף '5 של הגנום הנגיפי על ידי הארכת החפיפה PCR (איור 1D, pBAC / F1 ^SP6).
      1. להגביר שני שברי DNA חופפים באמצעות PCR הסטנדרטי הראשון של pBAC / F1 עם שני זוגות פריימר SP6F + SP6R (גודל מוצר, 173 נ"ב) וF1F + F1R (מוצר שלize, 676 נ"ב), כל אחד בתגובת 50 μl מכילה תבנית ה- DNA μl 1 (~ 200 pg / μl), 10 μl 5 × חיץ PCR, 2 μl 10 מ"מ dNTPs, 2.5 μl כל 10 מיקרומטר קדימה הפוך פריימרים, 0.5 μl 2 U / μl DNA פולימרז, ⁶⁸ ו -31.5 dH μl ₂ O. לבצע PCR באמצעות פרופיל הרכיבה על אופניים הבאים: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -25 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות.
      2. ג'ל לטהר שני שברי DNA מוגברים-PCR אחרי ריצת כל אחד משני מוצרי ה- PCR על 1.5% ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה, כפי שתואר בפרוטוקול 3.2.
      3. הפתיל שני שברי DNA מטוהר ג'ל באמצעות ההיתוך השני PCR באמצעות SP6F + F1R פריימרים החיצוניים (גודל מוצר, 821 נ"ב) בתגובת 100 μl כולל 1 μl כל אחד משני שברי DNA המטוהרים (~ 100 pg / μl), 20 μl 5 × חיץ PCR, 4 μl 10 מ"מ dNTPs, 5 μl כל 10 מיקרומטר קדימה הפוך פריימרים, 1 μl2 פולימראז U / μL DNA, ⁶⁸ ו DH μl 63 ₂ O. השתמש בפרופיל הבא תרמית רכיבה על אופניים: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -25 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
      4. ג'ל לטהר את amplicon PCR התמזגו מ1% ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה, כפי שתואר בפרוטוקול 3.2.
      5. בצע את הליך שיבוט חמשת שלבים שתואר בפרוטוקולים 3.1-3.5 וללקשור בר פאק אני- BSI WI 760-נ"ב של amplicon PCR-מטוהר ג'ל התמזגו עם בר פאק אני- BSI WI 9,532-BP של pBAC / F1 כדי ליצור pBAC / F1 ^SP6.
   2. הסר את קיים מראש, אתר Xba אני פנימי בנוקלאוטיד 9,131 ידי החדרת מוטציה שקטה נקודה ^(9,134 → T) באמצעות הרחבת החפיפה PCR (איור 1D, pBAC / F3 ^KO).
      1. להגביר שני שברי DNA חופפים על ידי PCR הסטנדרטי הראשון של pBAC / F3 עם שני זוגות פריימר X1F + X1R(גודל מוצר, 746 נ"ב) וX2F + X2R (גודל מוצר, 316 נ"ב) בתגובת 50 μl תחת תנאי הניסוי מתוארים בפרוטוקול 4.1.1.1.
      2. ג'ל לטהר שני שברי DNA מוגברים-PCR לאחר הפרדת electrophoretic על ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה של 1.5%, כמפורט בפרוטוקול 3.2.
      3. הפתיל שני שברי DNA מטוהר ג'ל באמצעות ההיתוך השני PCR באמצעות X1F פריימרים החיצוניים + X2R (גודל מוצר, 1033 BP) בתגובת μl 100 תחת תנאי הניסוי מתוארים בפרוטוקול 4.1.1.3.
      4. ג'ל לטהר את amplicon PCR התמזגו מ1% ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה, כמפורט בפרוטוקול 3.2.
      5. בצע את הליך שיבוט חמשת שלבים שתואר בפרוטוקולים 3.1-3.5 וללקשור AVR II- לא אני שבר 949 נ"ב-של amplicon PCR-מטוהר ג'ל התמזגו עם 16,245-נ"ב לא אני- BSI WI ו2,141-נ"ב BSI W אני - ברי AVR השני של pBAC / F3 לייצר pBAC / F3 ^KO.
   3. מהנדס Xba המלאכותי חדש שאתר ניגר רק במורד הזרם של סוף '3 ​​של הגנום הנגיפי על ידי מכוון mutagenesis אתר מבוסס PCR (איור 1D, pBAC / F4 ^RO).
      1. צור קטע DNA אחד על ידי PCR של pBAC / F4 עם ROF פריימרים + ROR (גודל מוצר, 324 נ"ב) בתגובת 100 μl מכיל תבנית ה- DNA μl 1 (~ 200 pg / μl), 20 μl 5 × חיץ PCR, 4 μl 10 מ"מ dNTPs, 5 μl כל 10 מיקרומטר קדימה ופריימרים הפוכים, 1 μl 2 U / μl DNA פולימרז, ⁶⁸ ו -64 dH μl ₂ O. לבצע PCR באמצעות פרופיל הרכיבה על אופניים הבאים: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -25 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ו -72 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות.
      2. ג'ל לטהר את קטע DNA המוגבר-PCR 1% ג'ל agarose נקודת התכה נמוכה, כמפורט בפרוטוקול 3.2.
      3. בצע את הליך שיבוט חמשת שלבים שתואר בפרוטוקולים 3.1-3.5 וללקשור 283-נ"ב SFI אני- Not אני בר של amplicon PCR-מטוהר ג'ל עם SFI אני- לא אני שבר 16,933-נ"ב של pBAC / F4 כדי ליצור pBAC / F4 ^RO.
2. להרכיב סט של ארבעה שונה, החופפים cDNAs לאורך מלא יחיד SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / ₁₄ SA -14-2) על ידי הצטרפות בשלושה אתרי הגבלה טבעית (GI בסר, Bam HI, ואווה אני ) באופן רציף באמצעות חמשת שלבי שיבוט נהלים המפורטים בפרוטוקולים 3.1-3.5 (איור 1E): F1 ^SP6 → F1 ^SP6 F2 (על ידי החלפת שבר בסר G אני- לא אני של pBAC / F1 ^SP6 עם זה של pBAC / F2) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO (על ידי החלפת שבר Bam H אני- לא אני של pBAC / F1 F2 ^SP6 עם זה של pBAC / F3 ^KO) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO F4 ^RO (על ידי החלפת שבר אווה אני- לא אני של pBAC / F1 F2 ^SP6F3 ^KO עם זה של pBAC / F4 ^RO).

5. הכן גבוהה טוהר מקסי-הכנה של האורך המלא ₁₄ SA -14-2 BAC

1. לגדול מושבה אחת של א ' coli DH10B ביצוע ₁₄ -14-2 ב 3 מיליליטר pBAC / SA של מרק 2xYT מכיל CML 10 מיקרוגרם / מיליליטר במשך 10 שעות ב 35 מעלות צלזיוס עם רועד ב225-250 סל"ד, ולאחר מכן בהיקף של עד 500 על ידי ייחסת μl של 10 שעות תרבות חיידקים לתוך 500 מיליליטר של מדיום 2xYT-CML וטיפוח הבידוד במשך 6 שעות ב 35 ° C עם רעד נמרץ.
2. צנטריפוגה תרבות החיידקים בשני בקבוקים 250 מיליליטר בז × 3107 במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס. Resuspend כל גלולה ב 30 מיליליטר של תמיסת GTE (50 גלוקוז מ"מ, 25 מ"מ טריס-Cl, ו -10 מ"מ EDTA [pH 8.0]), ולאחר מכן להוסיף 500 μl של 60 מ"ג / מיליליטר יזוזים. דגירה שתי השעיות תא על קרח במשך 10 דקות.
3. להוסיף 60 מיליליטר של תמיסת תמוגה טריה (0.2 N NaOH ו -1% SDS) לכל השעיה תא, ומערבב היטב עד שברור, ולשמור lysatesב RT במשך 10 דקות.
4. להוסיף 45 מיליליטר של תמיסת ניטרול (100 מיליליטר, בהיקף של 60 מיליליטר 5 M אצטט אשלגן, חומצה אצטית קרחונית 11.5 מיליליטר, ו28.5 מיליליטר DH ₂ O) לכל בקבוק, ומערבב היטב על ידי היפוך הבקבוקים, ודגירת lysates נוטרל על קרח במשך 10 דקות.
5. צנטריפוגה lysates נוטרל בז × 18566 עבור 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant של שני הבקבוקים לשני בקבוקים 250 מיליליטר חדשים; להוסיף 0.6 נפח של 100% isopropanol לכל אחד, ולשמור אותם על קרח למשך 20 דקות.
6. ספין למטה משקעים ב18566 ז × במשך 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס. ממיסים כל גלולה ב 5 מיליליטר של חיץ TE, לשלב אותם בצינור 50 מיליליטר (10 מיליליטר סה"כ), ולזרז את הרנ"א על ​​ידי הוספת נפח שווה של 5 M כלוריד ליתיום. דגירה את התערובת על קרח למשך 10 דקות.
7. צנטריפוגה משקע RNA בז × 14636 עבור 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את supernatant לצינור 250 מיליליטר חדש ולזרז DNA על ידי הוספת 2 כרכים של isopropanol 100%.דגירה את התערובת על קרח למשך 20 דקות.
8. ספין למטה משקע DNA ב18566 ז × במשך 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant, resuspend גלולה DNA ב9.5 מיליליטר של חיץ TE (pH 7.6), ולהוסיף 10 גרם של צזיום כלוריד (CsCl) וμl 390 של 10 מ"ג / מיליליטר EtBr.
9. טען את פתרון ה- DNA CsCl-EtBr לתוך צינור פוליפרופילן 16 × 76 מ"מ סגר באמצעות מזרק מצויד במחט 18 G. ספין שיפוע CsCl האטום בultracentrifuge ב401700 ז × במשך 16 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס (איור 3).
10. לאסוף להקת DNA של פלסמיד BAC משיפוע CsCl באמצעות מחט G 18 כדי ליצור פתח אוורור בחלק העליון של השיפוע ומזרק 20-מצויד מחט G כדי לאחזר את ה- DNA BAC מהצד של השיפוע.
11. להוסיף 2.5 כרכים של DH ₂ O-רווי butanol לדגימת DNA BAC הצבעוני EtBr ומערבבים על ידי vortexing. צנטריפוגה את התערובת בז × 13,400 דקות 1 ולהעביר את השלב המימי הנמוך למיקרופון 1.7 מיליליטר חדשrotube. חזור על תהליך זה שש פעמים.
12. להאיץ את ה- DNA BAC EtBr-בחינם על ידי הוספת 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט ו 2.5 כרכים של אתנול 100% ל- DNA BAC-חילוץ butanol ודוגר במשך 10 דקות על קרח. צנטריפוגה המשקע בז × 13,400 במשך 10 דקות, לשטוף את כדור DNA עם 1 מיליליטר של אתנול 70%, ומחדש גלולה זה על ידי צנטריפוגה.
13. האוויר יבש גלולה דנ"א למשך 10 דקות ולפזר אותו ב200 μl של TE חיץ (pH 7.6).
    הערה: איור 4 מציג סקירה של מערכת הגנטיקה ההפוכה לJEV SA ₁₄ -14-2.

6. לתמלל RNAs סינטטי במבחנה מה- DNA JEV BAC באורך מלא לינארית

1. בצע עיכול אנזים הגבלה בקנה מידה גדולה של pBAC / ₁₄ SA -14-2 עם Xba אני בנפח כולל של 100 μl (המכיל 3 מיקרוגרם DNA, 60 אנזים U, חיץ × עיכול 1, ו 1 × BSA) על 37 מעלות C 12-15 שעות. בדוק aliquot 3 μl של דתגובת igestion על 0.8% agarose ג'ל המכיל 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר EtBr.
2. דגירה תגובת העיכול נוסף עם 25 U של nuclease שעועית מונג (MBN) על 30 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות (איור 4 א).
3. תביא את הנפח של המדגם-מתעכל אני Xba, שטופל MBN עד 300 μl עם DH ₂ א ' הוסף נפח שווה של פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1) המדגם המדולל, מערבולת במרץ דקות 1, ספין ב13,400 × גרם במשך 10 דקות, ולאחר מכן להעביר את השלב מימי העליון ל1.7 מיליליטר חדש microtube. הוסף נפח שווה של כלורופורם ולחזור על תהליך החילוץ.
4. לשחזר את פנול BAC, לינארית חילוץ, כלורופורם / על ידי משקעים אתנול: הוסף 1/10 נפח של 3 M נתרן אצטט ו 2.5 כרכים של 100% אתנול, ולדגור על קרח במשך 20 דקות. צנטריפוגה המשקע בז × 13,400 במשך 10 דקות, לשטוף את כדור DNA עם 1 מיליליטר של אתנול 70%, ולאחר מכן לסובב אותו מחדש על ידי צנטריפוגה.
5. אוויר יבש Pelle DNAלא עבור 10 דקות ולפזר אותו בμl 30 של DH ₂ O. בדוק aliquot μl 1 של BAC התאושש על ג'ל agarose 0.8% עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר EtBr (איור 5 א).
6. לבצע שעתוק נגר של ה- DNA BAC לינארית בהיקף כולל של 25 μl (המכיל ~ 200 ng DNA תבנית, 0.8 אנלוגי כובע מ"מ [מ ⁷ G (5 ') PPP (5')], 1 מ"מ rNTPs, 40 מעכב U RNase, 20 פולימראז U SP6 RNA, ⁷² ו 1 × חיץ שעתוק) על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (איור 4). כולל 0.5 מיקרומטר ^[3 H] UTP לכימות RNA על הבסיס ^[3 H] התאגדות UTP, כפיקוח על ידי ספיחה לנייר DE-81 מסנן. ⁶⁹
7. הפעל aliquot 1-2 μl של תגובת השעתוק נגר על 0.6% agarose ג'ל המכיל 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר EtBr (איור 5).

7. לקבוע RNA infectivity ותשואת וירוס

1. לטפח BHK-21 תאים בcultu 150 מ"ממחדש מנות בצפיפות של 3 × 10 ⁶ תאים / צלחת למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
   הערה: שמור BHK-21 התאים במדיום חיוני מינימאלי אלפא בתוספת 10% בסרום שור עוברי, גלוטמין 2 מ"מ, ויטמינים, ופניצילין / סטרפטומיצין.
2. יש לשטוף את monolayer התא עם 10 מיליליטר של תמיסה קרה (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 8.1 מ"מ Na ₂ HPO _4, ו -1.5 מ"מ KH ₂ PO _4). לנתק את התאים מהמנות על ידי טיפול עם 4 מיליליטר של טריפסין EDTA (0.25%), ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 270 × גרם בצנטריפוגה שולחן עבודה למשך 2 דקות.
3. Resuspend התא גלולה עם 50 מיליליטר של תמיסה קרה בצינור חרוטי 50 מיליליטר ו צנטריפוגות ההשעיה התא ב 270 × גרם במשך 2 דקות. חזור על תהליך זה לשטוף שלוש פעמים; לאחר השטיפה האחרונה, resuspend התא גלולה בצפיפות של 2 × 10 ⁷ תאים / מיליליטר בא סול
4. מערבבים aliquot 400 μl של השעיה תא עם 2 μגרם של RNA הסינתטי בקובט פער 2 מ"מ, ומייד electroporate התערובת עם electroporator בתנאים אופטימליים electroporation: אורך 980 V, 99 μsec דופק, ו -5 פעימות (איור 4C).
   הערה: השתמש בRNA שכותרת H ³ מסונתז בפרוטוקול 6.5 ישירות לelectroporation ללא טיהור נוספת.
5. השאר את תאי electroporated ב RT במשך 10 דקות ולהעביר לmicrotube 1.7 מיליליטר מכיל 600 μl של מדיום תרבות השלם.
6. הכן דילול סדרתי של פי 10 של תאי electroporated ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות השלם וצלחת aliquot 100 μl של כל דילול על monolayers של BHK-21 תאי unelectroporated (5 × 10 ⁵⁾ בצלחת 6 היטב.
7. לאחר 4-6 שעות של דגירה, כיסוי התאים עם agarose 0.5% במדיום חיוני מינימאלי המכילים 10% בסרום שור עוברי. דגירה הצלחות במשך 4 ימים על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
8. דמיין את מרכז זיהומיותs (פלאק) על ידי קיבוע עם פורמלדהיד 7% וצביעה עם 1% סגולים קריסטל ב 5% ²⁷ (איור 6 א) אתנול.
   1. אופציונאלי: בדוק תאים-electroporated RNA בשעות 18-20 לאחר transfection לביטוי חלבון JEV ידי מבחני immunofluorescence ^27,73 (איור 6), ולקצור את supernatants מהתאים-electroporated RNA ב 22 ו -40 שעות שלאחר transfection לוירוס טיטרציה על ידי מבחני פלאק ^27,63 (איור 6 ג).

תוצאות

לכל וירוסי RNA חיובי גדיל, האמינות והיעילות של מערכת גנטיקה הפוכה תלויה ביציבות הגנטית של cDNA באורך מלא משובט, הרצף שהוא שווה ערך לרצף הקונצנזוס של RNA הגנומי ויראלי. ²⁷ איור 1 מציג חמישה אסטרטגית צעד לבניית cDNA זיהומיות באורך מלא כBAC לJEV SA ₁₄ -14-2 ^28: שלב 1, טיהור של רנ"א הנגיפי מsupernatant תרבית תאים של BHK-21 תאים נגועים JEV (איור 1 א); שלב 2, סינתזה של ארבע amplicons החופפות cDNA (F1 כדי F4) פורש הגנום הנגיפי השלם (איור 1); שלב 3, subcloning של כל אחד מארבעת שברי cDNA רציפים לתוך וקטור BAC, יצירת pBAC / F1 כדי pBAC / F4 (איור 1 ג); שלב 4, שינוי של cDNAs המשובט לשעתוק ניגר במבחנה עם RNA פולימראז SP6, כלומר, הצבת SP6רצף אמרגן מייד במעלה הזרם של 5'-הסוף הנגיפי (pBAC / F1 ^SP6), ביטול מראש קיימים-פנימי אתר Xba אני בנוקלאוטיד 9,131 ידי החדרת מוטציה נקודה שקטה, ^9,134 → T (pBAC / F3 ^KO), והכנסת אתר Xba המלאכותי החדש אני רץ-מייד במורד הזרם של 3'-הסוף הנגיפי (pBAC / F4 ^RO) (איור 1D); ושלב 5, הרכבה של באורך מלא SA ₁₄ -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA ₁₄ -14-2 (איור 1E). טבלת 1 רשימות oligonucleotides המשמש בתהליך שכפול זה. ²⁸

לבניית JEV cDNA פונקציונלי, הצעד החשוב הראשון הוא הסינתזה של ארבעה שברי cDNA החופפים באמצעות רנ"א הנגיפי המטוהר כתבנית לRT-PCR. איור 2 מספק תוצאת נציג לארבעה מוצרי RT-PCR שהיו electrophoresed על 0.8%agarose ג'ל. ג'ל זו ממחיש באופן ברור כי באורך מלא JEV cDNA מוגבר לארבעה שברי cDNA חופפים. מדי פעם, תגובות RT-PCR עשויות להניב מוצרי וירוס ספציפי או ספציפי נוסף אחת או יותר, כי הם קטנים יותר מאשר ברוב המוצר הצפוי, בגלל חישול ספציפי של פריימרים במהלך סינתזה / ההגברה cDNA. מצד השני, קטן או לא צפוי מוצר RT-PCR היה להיות מוגבר בגלל זיהום RNase המקרי במהלך בידוד RNA הנגיפי או ביצועי RT-PCR לא תקינים.

הצעד הבא הוא מפתח השיבוט והשינוי של אורך מלא partial- או JEV cDNA בBAC, שהנו הליך פשוט יחסית שמשתמש בטכניקות DNA רקומביננטי סטנדרטיים. ⁶⁹ איור 3 מציג תוצאות נציג לטיהור שיבוט BAC מכילה cDNA באורך מלא של JEV SA ₁₄ -14-2 על ידי רצועות בשיפוע CsCl-EtBr.בניסוי זה, לאחר צנטריפוגה במשך 16 שעות ב401700 × גרם, שתי להקות שונות, כלומר, א ' DNA coli כרומוזומליות לעיל ופלסמיד דנ"א BAC supercoiled להלן, נראה באמצע הצינור תחת אור אולטרה סגול גל ארוך. נפח מינימאלי (~ 400 μl) של להקת ה- DNA BAC הנמוכה נאסף בקפידה על ידי תוקע חור עם מזרק בצד של הצינור. בהמשך לכך, EtBr הופק מה- DNA BAC על ידי מיצוי butanol, וללא EtBr BAC DNA היה מרוכז על ידי משקעים אתנול.

השלב האחרון הוא קביעת infectivity הספציפי של RNAs הסינתטי עיבד במבחנה באורך המלא SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / ₁₄ SA -14-2) לאחר transfection RNA בתאי יתר (איור 4). צעד זה כרוך בשלושה שלבים עוקבים: שלב 1, linearization של האורך המלא SA ₁₄ -14-2 cDNA ב'3-end של הגנום הנגיפי (איור 4 א); שלב 2, ייצור RNAs הסינתטי מcDNA לינארית על ידי שעתוק נגר (איור 4); ושלב 3, הצלה של וירוסי רקומביננטי בBHK-21 תאים transfected עם RNAs הסינתטי (איור 4C). בניסוי, שני שיבוטים עצמאיים של pBAC / ₁₄ SA -14-2 היו לינארית עם Xba אני עיכול וטופלו בMBN להסיר 5 הסככה ארבעה-הבסיס "שנוצרה על ידי עיכול Xba אני. BACS ינארית נוקה על ידי מיצוי פנול, כלורופורם, ואחריו משקעים אתנול. Linearization של שני BACS המטוהר הודגם על 0.8% agarose ג'ל (איור 5 א '). חילוץ פנול, כלורופורם חייב להיעשות בזהירות כדי להבטיח שBACS לינארית הוא RNase ללא. כל אחד משני BACS ינארית שימש כתבנית cDNA לשעתוק נגר באמצעות פולימראז SP6 RNA בנוכחות G מ ^'7 (5') PPP (5') אנלוגי כובע. שלמות RNAs הסינתטי הוצגה על ידי הפעלת aliquots של שתי תערובות תגובת שעתוק על 0.6% agarose ג'ל, יחד עם סולם DNA KB התייחסות 1 (איור 5). ב assay זה פשוט, להקת RNA הבולט הגדולה תמיד היגרה רק להלן 3 kb התייחסות להקת DNA ונראיתי חד. עם זאת, מושפל RNA יהיה בעלת מראה מרוח על אותו ג'ל.

Assay מרכז זיהומיות הוא סטנדרט הזהב להחלטת infectivity הספציפי של RNAs הסינתטי. assay זה נעשה על ידי electroporating BHK-21 תאים עם דגימות RNA, זריעת aliquots שווה של פי 10 בדילול סדרתי התאים electroporated 6 צלחות המכילות גם BHK-21 תאים נאיביים (3 × 10 ⁵ תאים היטב /), וכיסית agarose על monolayers התא. לאחר הדגירה במשך 4 ימים, תאים ששרדו היו קבועים עם פורמלדהיד ומוכתם בים סגול גבישolution לכמת את מספר מרכזי זיהומיות (פלאק), אשר תואם את מספר מולקולות RNA זיהומיות מועברות לתוך התאים (איור 6 א). מאז תבנית cDNA משמשת לשעתוק במבחנה הוכחה להיות שאינו מדבק, ²⁷ aliquot של תערובת תגובת השעתוק היה ישירות המשמש לelectroporation. Electroporation הוא השיטה המועדפת לtransfection RNA; לחלופין, ניתן transfected RNAs בשיטות אחרות באמצעות יפוזומים DEAE-dextran וקטיוני. electroporation RNA הוא מאוד יעיל, אבל "קשתי" של הדופק החשמלי מתרחש רק לעתים נדירות, אם מלחים נמצאים בתגובת electroporation או אם קובט electroporation הוא שימוש חוזר. הביטוי של חלבונים נגיפיים בתאים-transfected RNA נבדק על ידי מבחני immunofluorescence באמצעות antiserum ארנב נגד ns1 (איור 6). הייצור של חלקיקים נגיפיים שנצברו בsupernatants של תאי transfected RNA היהalyzed על ידי מבחני פלאק (איור 6 ג). התוצאות של ניסויים אלה מראים בבירור כי RNAs הסינתטי נגזר cDNA הם מדבק בBHK-21 תאים מתירנית, יצירת כייל גבוה של וירוסי רקומביננטי.

Oligonucleotide	רצף (5 'ל 3')	ב מיקום	קוטביות
1RT	TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT	2578-2603	Antisense
1F	aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT	1-22	לָחוּשׁ
1R	attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT	2532-2553	Antisense
2RT	TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA	5975-6000	נְמָלָהisense
2F	aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT	1800-1821	לָחוּשׁ
2R	attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC	5929-5950	Antisense
3RT	ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT	9426-9451	Antisense
3F	aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT	5500-5521	לָחוּשׁ
3R	attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT	9380-9401	Antisense
4RT	AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA	10,952-10,977	Antisense
4F	aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA	9200-9221	לָחוּשׁ
4R	attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC	10,956-10,977	Antisense
SP6F	cataccccgcgtattcccac ת"א		לָחוּשׁ
SP6R	ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa	1-14	Antisense
F1F	aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG	1-17	לָחוּשׁ
F1R	TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA	638-662	Antisense
X1F	CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG	8403-8427	לָחוּשׁ
X1R	AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC	9120-9148	Antisense
X2F	GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT	9120-9148	לָחוּשׁ
X2R	cacgtggacgagggcatgcc tgcag		Antisense
ROF	CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC	10,670-10,694	לָחוּשׁ
ROR	agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC	10,954-10,977	Antisense
רצפי JEV מוצגים באותיות רישיות, ורצפי BAC מסומנים באותיות קטנות. עמדת נוקלאוטיד ב מתייחסת לרצף הגנום המלא של JEV SA 14 -14-2 (מספר הצטרפות GenBank JN604986).

טבלה 1: Oligonucleotides משמש לסינתזת cDNA, הגברה PCR, וmutagenesis BAC.

איור 1.0; אסטרטגיה לבניית cDNA באורך מלא של JEV SA ₁₄ -14-2 כBAC בידוד () של רנ"א הנגיפי מחלקיקי JEV.. מוצג הוא תרשים סכמטי של RNA הגנומי של JEV SA ₁₄ -14-2. (ב) סינתזה של ארבעה שברי cDNA חופפים (F1 כדי F4) המכסה את כל הגנום הנגיפי. Subcloning (C) של ארבעה שברי cDNA חופפים לוקטור BAC, יצירת pBAC / F1 כדי pBAC / F4. שינוי (D) של cDNAs המשובט לשעתוק נגר במבחנה. pBAC / F1 ^SP6 הוא נגזר של pBAC / F1 שמכיל את רצף אמרגן SP6 במעלה הזרם של 5'-סוף ויראלי. pBAC / F3 ^KO הוא נגזר של pBAC / F3 המכיל מוטציה שקטה נקודה ^(9,134 → T, כוכבית). pBAC / F4 ^RO הוא נגזר של pBAC / F4 המכיל Xba אני מלאכותי אתר נגר במורד הזרם של 3'-סוף ויראלי. (E strong>) עצרת של באורך מלא SA ₁₄ -14-2 BAC (pBAC / ₁₄ SA -14-2). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. סינתזה של ארבעה שברי cDNA חופפים (F1 כדי F4) פורש RNA הגנומי באורך המלא של JEV SA ₁₄ -14-2. ארבעה מוצרי RT-PCR מוערכים על ידי אלקטרופורזה בג'ל 0.8% agarose. M, סולם DNA 1 KB. הגדלים הצפויים של ארבעה שברי cDNA מסומנים בתחתית תמונת ג'ל. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
טיהור איור 3. של BAC מכיל cDNA באורך מלא של ₁₄ JEV SA -14-2. פלסמיד BAC מבודד מא coli DH10B בשיטת תמוגה SDS-בסיסית ומטוהר יותר על ידי רצועות בשיפוע CsCl-EtBr. הציג הוא דוגמא לשיפוע CsCl-EtBr באמצעות צינור פוליפרופילן סגר 16 × 76 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סקירת איור 4. ההתאוששות של וירוסים מדבקים באורך מלא JEV SA ₁₄ -14-2 cDNA התאסף בBAC. (א) לינאריזציה של תבנית cDNA. באורך המלא JEV BAC הוא לחתוך עםטופלתי Xba אני ועם MBN. סינתזה (ב) לתעתיקי הרנ"א. CDNA לינארית הוא עיבד על ידי RNA פולימראז SP6 בנוכחות מ ^'7 G (5') PPP (5 ') אנלוגי כובע. (ג) שחזור של JEVs הסינתטי. במבחנה RNAs עבד הם transfected לBHK-21 תאים על ידי electroporation, אשר מייצר כייל גבוה של וירוס סינטטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. סינתזה של RNAs ידי שעתוק במבחנה באמצעות BAC JEV באורך מלא כתבנית cDNA. דור (א) לאורך המלא לינארית JEV BAC, pBAC / ₁₄ SA -14-2. שני שיבוטים עצמאיים של pBAC/ SA ₁₄ -14-2 (Cl.1 וCl.2) הם ינארית על ידי עיכול עם Xba אני וטיפול שלאחר מכן עם MBN. BACS ינארית נבחנים על ידי אלקטרופורזה בג'ל 0.8% agarose. הפקה (ב) לRNAs הסינתטי על ידי שעתוק נגר. כל אחד משני BACS ינארית משמש כתבנית לשעתוק ניגר RNA פולימראז SP6. Aliquots של שתי תגובות השעתוק מנוהלים על 0.6% agarose ג'ל. M, 1 KB סולם DNA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6. infectivity ספציפי של RNAs הסינתטי עיבד מBAC JEV באורך מלא וההתאוששות של וירוס סינטטי. BHK-21 תאים (מוק)-electroporated מדומים או electroporated עם תעתיקי הרנ"א נגזרים frאום כל אחד משני השיבוטים העצמאיים של BAC JEV באורך מלא (Cl.1 וCl.2). () Infectivity RNA. התאים הם כיסו עם agarose ומוכתם בסגולים קריסטל ב 4 ימים לאחר transfection. infectivity RNA נקבע על ידי מבחני מרכז זיהומיות כדי להעריך את הכמות של RNA זיהומיות electroporated לתוך התאים (פנל משמאל). כמו כן, נציג תמונות של מרכזי זיהומיות מוצגות (פנל מימין). ביטוי חלבון (B). התאים בתרבית שקופיות קאמריות 4 היטב. ביטוי חלבון נגיפי בתאים-electroporated RNA ב 20 שעות שלאחר transfection (HPT) מנותח על ידי מבחני immunofluorescence באמצעות antiserum עיקרי נגד ns1 ארנב וIgG העז Cy3 מצומדות- המשני נגד ארנב (אדום). הגרעינים counterstained עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (כחול). תמונות immunofluorescence הם כיסו על תמונות התערבות ההפרש לעומת זאת מקביל שלהם. תשואת וירוס (C). התאים בתרבית 150 מנות תרבות מ"מ. הייצור של virions זיהומיות שנצבר בsupernatants התרבות של תאי electroporated RNA ב 22 ו -40 HPT נבדק על ידי מבחני פלאק. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

הפרוטוקול הנוכחי שמש בהצלחה לייצר שיבוטים cDNA זיהומיות באורך מלא לשני זנים שונים (CNU / ²⁷ LP2 ו _-14 SA -14-2 ²⁸⁾ של JEV, flavivirus שפונקציונלי cDNA הוכיח להיות קשה מטבעו לבנות ו להפיץ בגלל רעילות תא מארח וחוסר היציבות הגנטית של cDNA המשובט ^8,74-76 פרוטוקול זה כולל שלושה מרכיבים עיקריים:. ראשון, למקסם את הסינתזה / ההגברה של עותק cDNA נאמן של רנ"א הנגיפי באמצעות טרנסקריפטאז באיכות גבוהה / DNA פולימראז; שני, שיבוט האזור הנגיפי PRM-E קידוד המכיל רצפים רעילים (נתונים שלא פורסמו) ^74,77,78 בBAC וקטור מספר מאוד נמוך עותק מcDNA הראשוני subcloning לצעדי ההרכבה cDNA באורך מלא הסופיים; ושלישית, ניצול BAC וקטור שיבוט שיכול להכיל דנ"א זר עם גודל של 120-350 kb, ^19-21 ממוצע שככל הנראה סובל inse DNA הגדולRTS מאשר לעשות וקטורי שיבוט אחרים. גישת שיבוט זה תהיה בדרך כלל החלים רב וירוסים אחרים חיובי גדיל RNA, במיוחד אלו עם הגנום RNA גדול של ~ 10-32 קילו. דור של שיבוט cDNA זיהומיות הוא צעד מפתח בפיתוח מערכת גנטיקה הפוכה לאיתור וירוסי RNA, במיוחד לוירוסי RNA חיובי גדיל, כי הגנום שלו פועל mRNA ויראלי כמו שמתורגמת לחלבונים על ידי הריבוזומים תא מארח. לפיכך, שכפול נגיפי יכול להיות שיזם את ההקדמה של מולקולת רנ"א הגנום באורך נגזר cDNA לתוך תא מארח רגיש. הזמינות של שיבוט JEV cDNA זיהומיות, בשילוב עם טכנולוגיית ה- DNA רקומביננטי, גדלה ההבנה של היבטים שונים של מחזור החיים של נגיפנו ברמה המולקולרית, כגון ביטוי גנים ^73,79 ושכפול הגנום. ^63,64 כמו כן, באורך מלא שיבוט JEV cDNA הוכיח להיות כלי רב ערך לפיתוח של חיסונים אנטי ²⁸ ווקטורי מסירת הגן. ^80,81

כמו בכל וירוסי RNA חיובי גדיל, ישנם צעדים קריטיים מרובים בבניית cDNA הפונקציונלי אמין לJEV שממנו יכול להיות מסונתז RNAs המידבק ביותר במבחנה. באופן אידיאלי, הרצף של RNAs הסינתטי עיבד משיבוט של cDNA באורך מלא צריך להיות זהה לזה של RNA הגנומי ויראלי, במיוחד 5'- ו3'-מסוף הרצפים הנדרשים לייזום של שכפול רנ"א הנגיפי . ^60-62 בפרוטוקול הנוכחי, האותנטי 5'- ו3'-קצוות היו מובטח על ידי הצבת רצף אמרגן SP6 במעלה הזרם של נוקלאוטיד אדנין הראשון של הגנום הנגיפי ומיצוב אתר הגבלה ייחודי מלאכותי Xba אני במורד זרם של האחרון נוקלאוטיד תימין של הגנום הנגיפי, בהתאמה. כתרים RNAs הסינתטי עם 5 האותנטיים 'ו 3' קצוות הופקו על ידי שעתוק נגר של te cDNA Xba אני-לינארית וטופל MBNmplate באמצעות פולימראז SP6 RNA דרוך עם G מ ^'7 (5') PPP (5 ') אנלוגי כובע. פרוטוקול זה יכול להיות שונה בכמה דרכים. לשעתוק במבחנה, אחר RNA פולימראז bacteriophage (למשל, T3 או T7) יכול לשמש בשילוב עם רצף האמרגן המוגדר היטב שלה. ²⁷ כאתר נגר, אתר הגבלה שונה יכול להיות מנוצל אם היא לא נמצאת ב הגנום הנגיפי ואם RNA הסינתטי מcDNA לינארית מסתיים בסופו של הדבר האותנטי 3 '. החשיבות של רצף נוקליאוטידים 3'-הסוף הודגמה על ידי ירידה ~ של פי 10 בinfectivity RNA כאשר RNA סינטטי מכיל שלושה או ארבעה נוקלאוטידים וירוס-שאינו קשור בסופה 3 ". ²⁷ בתגובת שעתוק במבחנה, שני מ ^'7 G (5') PPP (5 ') ומטר ⁷ G (5') PPP (5 ') אנלוגי כובע יכול לשמש G באותה מידה, אם כי המקומות האחרונים נוקלאוטיד G נוסף שאינו קשור במעלה הזרם של נגיפי 5 "-end, אבל שבנוסף אינו משנה את ההדבקה או שכפול של RNA הסינתטי. ²⁷ יתר על כן, הסרת תבנית cDNA מתעתיקי הרנ"א על ידי DNase אני עיכול אין צורך לבדיקות infectivity RNA, כי תבנית cDNA עצמו אינה מדבקת. ²⁷

טכנולוגית BAC עכשיו הוחל בבניית השיבוטים cDNA מדבקים לקומץ של וירוסים חיוביים גדיל RNA, כלומר, שתי JEVs, CNU / ²⁷ LP2 וSA ₁₄ -14-2 ²⁸ (גודל הגנום, ~ 11 KB); שני וירוסים דנגה, BR / 90 ²⁶ ו- NGC ²⁹ (~ 11 KB); וירוס שלשולים הנגיפי שור, SD1 (~ 12 KB); ²⁵ שני וירוסים קלאסיים קדחת חזירים, C ו- פאדרבורן (~ 12 KB); ²⁴ וירוס המחלה גבול, Gifhorn (~ 12 KB); ²⁴ וירוס תסמונת רבייה ונשימה חזירי , PL97-1 / LP1 (~ 15 KB); ³⁰ וירוס גסטרו-ההעברה, PUR46-MAD (~ 29 KB); ¹⁶ וירוס דלקת הצפק המדבק של חתולים,DF-2 (~ 29 KB); ³² קורונה החמור החריף בדרכי הנשימה תסמונת, Urbani (~ 30 KB); ⁹ קורונה תסמונת הנשימה המזרח התיכון, EMC / 2012 (~ 30 KB); ¹⁷ וקורונה האנושי, OC43 (~ 31 KB) ³¹ היתרון העיקרי של שימוש בBACS לבניית cDNA הוא היציבות הגנטית הגבוהה של פלסמידים BAC הגדולים, 1 או 2-עותק.; עם זאת, הטבע הפנימי של מאוד נמוך העותק מספרו הוא גם חסרון גדול, בגלל תשואות נמוכות מאוד של DNA BAC וההפחתה הסוגר בטוהר של ה- DNA BAC ביחס לארח DNA כרומוזומליות. בפרוטוקול הנוכחי, התשואה של BAC DNA מוגדל על ידי גידול E. coli DH10B הפך עם pBAC BAC המדבק / ₁₄ SA -14-2 במדיום עשיר בחומרים מזינים, 2xYT. למרות מאמץ זה, התשואה הממוצעת היא רק ~ 15 מיקרוגרם של ה- DNA BAC מ 500 מיליליטר של מרק 2xYT. כמו כן, את הטוהר של ה- DNA BAC הוא הטוב ביותר להשיג באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות CsCl-EtBr לטיהור, ולא בידוד פלסמיד המבוסס על טור הנפוץ. עם זאת, חשוב לזכור כי א-שינה BAC coli לא צריך לגדול יותר, כי זה עלול לסכן את היציבות הגנטית של cDNA המשובט, וצמיחה גבוהה יותר לא בהכרח תוביל לתשואות גדולות יותר או DNA BAC גבוה-הטוהר.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא ושיטה מותאמות, יעילים, יעילה לבנייה וההפצה של שיבוט cDNA זיהומיות יציב מבחינה גנטית באורך מלא כBAC לJEV, הליך חשב כמעט בלתי אפשרי פעם אחת. אותה אסטרטגית שיבוט זה יכול גם להיות מיושם לרב וירוסי RNA חיובי גדיל אחרים. באופן כללי, שיבוטים cDNA זיהומיות יאפשר לנו להציג את מגוון רחב של מוטציות (למשל, מחיקות, הוספות, ומוטציות נקודה) לגנום רנ"א נגיפי ללמוד פונקציות הביולוגיות שלהם בשכפול ופתוגנזה ויראלי. מערכת גנטיקה ההפוכה מבוסס cDNA זה מאפשר לפתח וTESחיסון לא ומועמדים טיפוליים מיקוד גורם ארסיות (ים) של נגיף RNA חיובי גדיל מסוים של עניין. בנוסף, טכנולוגית cDNA זיהומיות זה יכול גם לשמש כוקטור נגיפי, מסוגל להביע גן זר (ים) של עניין עבור יישומים רבים במחקר ביו-רפואי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>1. שיבוט מולקולרי
2xYT מרק	סיגמא-אולדריץ	' Y2377
[3H]UTP	PerkinElmer	NET380250UC	רדיואקטיבי
50 מ"ל שפופרת	תרמו סיינטיפיק (Nalgene)	3114-0050
בקבוק 250 מ"ל	בקמן קולטר	356011
אגרוז	לונזה	50004
Agarose (נקודת התכה נמוכה)	Life Technologies (Invitrogen)	16520-100
AvaI	New England BioLabs	R0152S
AvrII	New England BioLabs	R0174S
BamHI	New England BioLabs	R0136S
BsiWI	New England BioLabs	R0553S
BsrGI	חדש אנגליה BioLabs	R0575S
בוטנול	פישר סיינטיפיק	A399-1
צזיום כלוריד	פישר מדעי	BP1595-1
כלורמפניקול	סיגמא-אולדריץ'	C0378
כלורופורם	סיגמא-אולדריץ'	C2432	מסרטן
DE-81 נייר סינון	GE Healthcare Life Sciences	3658-023
dNTP mix	Life Technologies (Invitrogen)	18427-088
E. coli DH10B	Life Technologies (Invitrogen)	18297-010
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
אתנול	Sigma-Aldrich	E7023
Ethidium broomide	Sigma-Aldrich	E7637	רעיל ומוטגני מאוד
(ערכת Plasmid Maxiprep)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-26
חומצה אצטית קרחונית	Sigma-Aldrich	A6283
גלוקוז	Sigma-Aldrich	G5400
גליקוגן	Roche	10901393001
DNA פולימראז בנאמנות גבוהה	ניו אינגלנד BioLabs	M0491S
איזואמיל אלכוהול	סיגמא-אולדריץ'	I9392
איזופרופנול דליק	Amresco	0918	Flammable
LB Broth	Life Technologies (Invitrogen)	12795-027
ליתיום כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	L9650
ליזוזים	אמרסקו	0663
מגנזיום כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	M8266
M-MLV טכנולוגיות חיים של טרנסקריפטאז הפוך	(Invitrogen)	18080-044
מונג שעועית נוקלאז	ניו אינגלנד BioLabs	M0250S
מחט (18 גרם, 20 גרם)	BD	305196, 305175	ביולוגית מסוכנת (פסולת חדה)
NotI	ניו אינגלנד BioLabs	R0189S
		סינתזת אוליגונוקלאוטידים מותאמת אישית
		R0547S
pBeloBAC11	New England BioLabs	ER2420S (E4154S)
פנול (רווי חוצץ)	Life Technologies (Invitrogen)	15513-039	רעיל וקורוזיבי מאוד
: כלורופורם: Isoamyl Alcohol	Life Technologies (Invitrogen)	15593-031	רעיל וקורוזיבי מאוד
: Guanidine Isothiocyanate	Life Technologies (אמביון)	10296-010	רעיל, קורוזיבי ומגרה
I	ניו אינגלנד BioLabs	R0560S
אשלגן אצטט	אמרסקו	0698
RNase Inhibitor	Life Technologies (Invitrogen)	10777-019
rNTP Set	GE Healthcare Life Sciences	27-2025-01
צינור פוליפרופילן אטום (16 ופעמים; 76 מ"מ)& נ.ב.פ;	בקמן קולטר	342413
SfiI	ניו אינגלנד BioLabs	R0123S
Sma I	ניו אינגלנד BioLabs	R0141S
נתרן אצטט	סיגמא-אולדריץ'	S2889
נתרן דודציל סולפט	אמרסקו	0227
נתרן הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	S5881
SP6 RNA פולימראז	ניו אינגלנד BioLabs	M0207S
עמוד ספין (ערכת מיני-הכנה לפלסמיד)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-11
מזרק	HSW NORM-JECT	4200.000V0
T4 DNA Ligase	ניו אינגלנד BioLabs	M0202S
טריס	אמרסקו	0826
tRNA (שמרים)	Life Technologies (Invitrogen)	15401-011
XbaI	New England BioLabs	R0145S
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. תרבית תאים
אלפא טכנולוגיות חיים בינוניות מינימליות חיוניות	(Gibco)	12561-049
צינור חרוטי (50 מ"ל)	VWR	21008-242
סגול קריסטל	Sigma-Aldrich	C0775
(150 מ"מ)	TPP	93150
קובט (מרווח 2 מ"מ)	מכשירי הרווארד	450125
סרום בקר עוברי	Life Technologies (Gibco)	16000-044
פורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	F1635	גלוטמין רעילות ומסרטנות
	(Gibco)	25030-081
בינוניות חיוניות מינימליות	(Gibco)	61100-061
פניצילין/סטרפטומיצין	טכנולוגיות חיים (Gibco)	15070-063
אשלגן כלורי	סיגמא-אולדריץ	P3911
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	P9791
צלחת שש בארות	TPP	92006
נתרן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	S3014
נתרן פוספט דו-בסיסי	סיגמא-אולדריץ'	S3264
טריפסין-EDTA (0.25%)	טכנולוגיות חיים ( Gibco)	25200-056
ויטמינים	סיגמא-אולדריץ'	M6895
שם	חברה	מספר קטלוגי	Comments
3. ציוד
מערכת אלקטרופורזה ג'ל אגרוז	Mupid	MPDEXU-01
CO2 אינקובטור	Thermo Scientific	Heracell 150i
צנטריפוגה שולחנית	Thermo Scientific	ST16R
Electroporator	הרווארד מכשיר	ECM 830
מנורות אולטרה סגולות גל ארוך (כף יד)	UVP	UVGL-58
צנטריפוגה שולחנית	בקמן קולטר	368826
Thermocycler	Life Technologies (Applied Biosystems)	GeneAmp PCR System 9700
Vortexer	Scientific Industries	G-560
אמבט מים	Jeio Tech	WB-10E