מאמר שיטה

מהיר

DOI:

10.3791/53165

⸱

23 בספטמבר 2015

 ,  ,  , 
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכלאה מהירה ופשוטה באתרה אידיאלית למוח עם קידומת פרה-פורמלדהיד, ובכך מפחית את הצורך בשלבים מורכבים ממושכים תוך שימוש ברקמות קפואות טריות. השיטה מאומתת באמצעות זיהוי גן הקולטן סרוטונין 5-HT2A htr2a בחולדות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
רעילות

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; אקסטזי) עלולה לגרום לשינויים ספציפיים לאזור בביטוי mRNA סרוטונרגי עקב תסמונת סרוטונין חריפה (5-הידרוקסיטריפטמין; 5-HT). ניתן לבחון השערה זו באמצעות הכלאה באתרה כדי לזהות את גן הקולטן סרוטונין 5-HT2A htr2a. בעבר, הליכים כאלה, תוך שימוש בריבופרוב רדיואקטיבי, היו קשים בגלל זרימת העבודה המסובכת שדורשת מספר ימים לביצוע והקושי הנוסף שהטכניקה דרשה שימוש ברקמות קפואות טריות שנשמרו בסביבה נטולת RNase. לאחרונה, הפיתוח של בדיקות אוליגונוקלאוטידים קצרות פישט את הליכי ההכלאה באתרם ואיפשר שימוש בקטעי מוח עם קידומת פרפורמלדהיד, הזמינים יותר במעבדות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים לא רדיואקטיביות על רקמות המוח המקודמות. בדיקות הכלאה המשמשות למחקר זה כוללות dapB (גן חיידקי המקודד לדיהידרודיפיקולינט רדוקטאז), ppiB (גן משק בית המקודד לפפטידילפרוליל איזומראז B) ו-htr2a (גן סרוטונין המקודד לקולטני 5-HT2A). שיטה זו פשוטה יחסית, זולה, ניתנת לשחזור ודורשת פחות מיומיים להשלמתה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תסמונת סרוטונין (5-הידרוקסיטריפטמין; 5-HT) היא הפרעה נוירולוגית חריפה הנגרמת על ידי תרופות מקדמות 5-HT כגון תרופות נוגדות דיכאון1, בעוד שהיא מתרחשת גם במצבים של שימוש ב-MDMA למטרות פנאי2. מנגנונים מולקולריים האחראים לשינויים במצב הרוח, ליקויי למידה וזיכרון המתרחשים בקשר לתסמונת החריפה אינם מובנים היטב3,4. הכלאה באתרה היא כלי מחקר רב עוצמה המאפשר זיהוי וכימות של mRNAs ספציפיים המתבטאים באופן פוטנציאלי ברמת תא בודד. הדרך הקונבנציונלית לבצע הכלאה באתרה היא להשתמש בריבופרוב בעל תווית רדיואקטיבית שעושה הכלאה ספציפית של הגן המעניין. עם זאת, החיסרון העיקרי הוא שהשיטה דורשת הכנת בדיקה ושלבי הכלאה מסובכים וגוזלי זמן, כמו גם גישה לרקמות קפואות טריות הנשמרות בסביבה נטולת RNase5,6.

בדיקות אוליגונוקלאוטידים פותחו לאחרונה כדי להכליא שברי RNA קצרים יותר מאלה הנדרשים לריבופרוב7. יתר על כן, הגשושיות מייצרות אות רקע נמוך מבלי להקריב את הספציפיות8. ניתן להשתמש בטכנולוגיית בדיקה חדשה זו שפותחה במקום הכלאה על רקמות מוח עם קידומת פרפורמלדהיד הזמינות בדרך כלל במעבדות אימונוציטוכימיות.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להכלאה באתרה באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים על מוח חולדה עם קידומת פרפורמלדהיד ומשווים את הממצאים לאלה שצוינו במוח קפוא טרי5,6. פרוטוקול זה משמש לבדיקת ההשערה כי שימוש לרעה בחומרים MDMA גורם לשינויים בגן הקולטן 5-HT2A htr2a mRNA במוח. התחלנו את ההליך בטיפול ב-MDMA ואחריו זלוף רקמות פרפורמלדהיד של החיה, הכלאה באתרה של בדיקת thr2a וניתוח נתונים. שימו לב ש-dapB (הגן החיידקי המקודד לדיהידרודיפיקולינט רדוקטאז) משמש כבקרה שלילית, ו-ppiB (קידוד גן משק בית לפפטידילפרוליל איזומראז B) כבקרה חיובית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נהלי שימוש בבעלי חיים מתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת רוס לרפואת וטרינרית ואוניברסיטת פלורידה אטלנטיק. למרות טכניקות וכפפות סטריליות נדרשות, הסביבה נטול RNase אין צורך בעת השימוש בפרוטוקול זה.

1. הכנה

  1. הכנת רקמה וחתך
    1. הקצאת חולדות באופן אקראי לשלוש קבוצות: טרי / מלוח (SAL; 0.9% NaCl), ולפניה / SAL וקידומת / 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ראה פירוט בטבלת 1).
    2. לנהל שלושה מינונים של 1 מיליליטר / קילוגרם SAL ו -10 מ"ג / קילוגרם MDMA intraperitoneally, בהתאמה, לקבוצות SAL וMDMA במרווח 2 שעות. הרשה בעלי חיים כדי לשרוד את הטיפול במשך 6 ימים.
    3. ביום 7, לנהל 100 מ"ג / קילוגרם קטמין בשילוב של 5 מ"ג / קילוגרם xylazine intraperitoneally לחולדות להרדמה עמוקה (כלומר, הפסד של מצמוץ בקרנית ות"אil לצבוט רפלקסים).
    4. לקבוצה הטרי / SAL, לערוף מהירות חולדות ולהסיר את המוח לבדיקת המוח הטרי (ראה פירוט בהתייחסות 5).
    5. לקבוצות / MDMA קידומת / SAL וקידומת, לעשות חתך לאורך עצם החזה על 10 -12 סנטימטרים ולאחר מכן לחשוף את הסוף של עצם החזה.
    6. החזק את הקצה של עצם החזה עם hemostat ולחתוך את הסרעפת רוחבית בשני הצדדים עם מספריים חדים ולאחר מכן לחתוך כלפי מעלה על פני הצלעות ומקבילות לריאות.
    7. ביד אחת, מחזיק את קצה הגחון של הלב עם מלקחיים קטנים. ביד השנייה, פירס החדר השמאלי עם מחט מזרק G 18 (שים לב לצד המתאם של המחט מחוברת עם צינור סיליקון בצורת אות V למכולות SAL וparaformaldehyde קר כקרח ומשאבות peristaltic; ראה התייחסות 9).
    8. הפעל את משאבת SAL ברמה בינונית של קצב הזרימה (~ 5 מיליליטר / דקה) ולנקב את אטריום ימין עם המלקחיים כדי לאפשר הבריחה של circ התמורהulation. לשמור זלוף SAL למשך 30 דקות.
    9. הפעל את משאבת paraformaldehyde ברמה בינונית ולאפשר paraformaldehyde 4% קרים כקרח לינקב את החיה במשך 30 דקות.
    10. הסר מכשיר זלוף ולערוף את החיה. הפוך posteroanterior לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, ואז לנפנף את הגולגולת כדי לחשוף את חלל גולגולת 10.
    11. הסר את המוח עם מרית מחלל הגולגולת ולמקם את המוח בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של 4% paraformaldehyde. שמור את המוח בתוך הצינור המכיל paraformaldehyde ב 4 מעלות צלזיוס מקרר למשך 24 שעות.
    12. הזז את המוח לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של 30% תמיסת סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. לבסוף, לאחסן המוח בתוך שקיות פלסטיק ב -80 ° C עד שימוש.
    13. הר המוח על צ'אק עם תקשורת הטבעה ולהקפיא את תקשורת ההטבעה מכילה מוח בcryostat בטמפרטורה של -26 מעלות צלזיוס. חותך את קפא הטרימוח n ל -20 מיקרומטר חלקים וparaformaldehyde-התחילית מוח לסעיפים 10 מיקרומטר. העבר את הסעיף לשקופית מיקרוסקופ RT על ידי נגיעה בשקופית לסעיף.
    14. אוויר יבש ב RT במשך 4 שעות. אחסן את שקופיות הסעיף בשקית אטומה הדוק ב -80 ° C עד שימוש.
  2. התייבשות
    1. קח שקופיות מהמקפיא -80 ° C ולהקצות חלקים לאחת משלוש בדיקות: HT2A, ppiB (ביקורת חיובית) או dapB (שליטה שלילית); סימן וחתכים תווית עם עט כדורי (לא להשתמש בעיפרון). לצלול שקופיות באלכוהול 100% ב RT במשך 5 דקות. ייבש את השקופיות במשך 5 דקות במנדף.
  3. טיפול מקדים
    1. פיפטה 20 μl של המגיב לפני הטיפול-1 (איון של phosphatase אלקליין) בסעיפים בשקופיות. מניחים את השקופיות על רכבת מתלה במגש לחות (שים לב שהמגש מכוסה במכסה כדי לשמור על לחות גבוהה למניעת אידוי מsolutio התגובהn).
    2. נער בעדינות את מגש הלחות על שייקר אופקי במהירות נמוכה במשך 10 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם מים מזוקקים כפולים (DDH 2 O) במשך 2 דקות. להטביע את השקופיות בכוס 200 מיליליטר המכילה 150 מיליליטר של המגיב לפני הטיפול-2 (שבירה של הקשרים בין-הנגרמים על ידי קיבוע paraformaldehyde). מרתיחים את השקופיות עבור הסכום כולל של 5 דקות ב 100 מעלות צלזיוס (שיקום מושרה חום של מבנה RNA 11).
    3. שטוף את השקופיות פעמיים עם DDH 2 O 2 דקות. מניחים את השקופיות באלכוהול 100% במשך 5 דקות. ייבש את השקופיות במשך 5 דקות במנדף. השתמש בעט הידרופובי לצייר מעגל מסביב לאזור שנבחר בסעיף הרקמות (למשל, מבנים שאינן בקליפת המוח, כוללים התלמוס וההיפותלמוס כפי שמתוארים באיור 2).
    4. פיפטה 10 μl של המגיב לפני הטיפול-3 (עלייה בחדירת בדיקה) לכל אזור שנבחר, ולכסות את מגש הלחות עם המכסה. מניחים את המגש בתנור ההכלאהמצויד בייקר האופקי ולהגדיר את טמפרטורת התנור ב -40 מעלות צלזיוס; נער בעדינות את המגש למשך 30 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם DDH 2 O 2 דקות.

2. הכלאה והגברה

  1. פיפטה 10 μl של htr2a, ריאגנטים בדיקה ppiB וdapB, בהתאמה, באזורים הנבחרים. מכסה את מגש הלחות עם המכסה כדי למנוע אידוי של המגיב. נער בעדינות על שייקר האופקי להגדיר במהירות נמוכה. דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס בתנור למשך 2 שעות.
  2. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-1 על כל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-2 על כל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  4. שטוף את השקופיות פעמיים wה- i כביסה חיץ במשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-3 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-4 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  6. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-5 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב RT למשך 30 דקות.
  7. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-6 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב RT במשך 15 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות.

3. גילוי אותות

  1. פיפטה 10 μl של המגיב האדום לכל אזור שנבחר (שים לב שמגיב היא תערובת של אדום-B ואדום-ביחס 1:60 ויש להשתמש ביmmediately). מניחים את השקף במגש הלחות על שייקר האופקי ב RT וללחוץ בעדינות במהירות נמוכה במשך 10 דקות.
  2. שטוף את השקופיות פעמיים עם (DDH 2 O) במשך 10 דקות. ייבש את השקופיות על 60 מעלות צלזיוס בתנור במשך 15 דקות. מניחים את השקופיות בקסילן מתחת למכסת מנוע קטר במשך 5 דקות. פיפטה 20 μl של תקשורת הרכבה מבוססת קסילן בכל אזור שנבחר ולכסות עם coverslip.

לכידת 4. תמונה

  1. קח microphotographs הדיגיטלי של האזורים הנבחרים (לדוגמא, ההיפותלמוס, איורים 1 ו 3) עם הגדלה של 4 × 20 × ועדשות אובייקטיביות. שמור את קובץ התמונה.

ניתוח חלקיקים 5. תמונה

  1. גרור ושחרר את קובץ התמונה בחלון ImageJ העיקרי. עבור לשורת תפריטים ובחרו 'תמונה', הבא לבחור "סוג" מהתפריט הנפתח, ובחר '8 סיביות ".
  2. בחירה 'התאם', ולאחר מכן בחר 'Threshold 'כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח. התאם את ערך הסרגל התחתון בתיבת הדו שיח כדי שהרקע לא רצוי יוסר. עבור לשורת תפריטים ובחרו 'לנתח', ולאחר מכן בחר 'לנתח חלקיקים' כדי לפתוח תיבה דו-שיח שנייה.
  3. הגדר את גודל חלקיקים בגיל 10, הבא בחר 'הצג מתווה' ובחר 'צג תוצאות "ו'קופסות' לסכם. לבסוף, לחץ על 'אישור' כדי להציג נתונים חלקיקים בתיבות דו-שיח.

חישוב 6. גיליון אלקטרוני

  1. הזן את הנתונים לגיליון Excel וממוצע המספרים של חלקיקים בקבוצת SAL כבסיס. לחשב את האחוז של כל קטע ולעשות גרף בהתאם (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש בבדיקות RNA oligonucleotide (<25 NT), הכלאה יכולה להתגלות כנקודות אדומות בתאי ההיפותלמוס הוכנו מהמוח הקפוא-התחילית paraformaldehyde וטרי. מולקולות mRNA htr2a נמצאות בכמה תאים (המסומנים בחצים מוצקים), אך לא לאחרים (חיצים פתוחים). הבחנו כי אין הבדל בין-התחילית paraformaldehyde והרקמות קפואים (איור 1). הכלאה מוצלחת ניתן להעריך ראשון בעין בלתי מזוינת (איור 2). מצאנו שהאזור שנבחר (מסומן בעיגולים) הכלאה עם הבדיקה dapB לא הראה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד החששות העיקריים של בדיקת הכלאה באתרה הוא בחירת טכניקות מתאימות המשמשות לשימור RNA בגלל אנזימי RNase. ידוע כי אנזימים אלה נמצאים באופן נרחב בתאים ובסביבה מה שיכול להשפיע על התוצאות. עם זאת, ניתן להבחין במהירות בפעילות האנזים על ידי הנחת הרקמה בתמיסת הקרח היבש/אלכוהול5,12. למרות ששימור מהיר הוא קריטי להכלאה באמצעות ריבופרוב13, מעט ידוע על תנאי ניסוי לבדיקות אוליגונוקלאוטיד. במחקר זה באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטיד, מצאנו כי אין הבדל בין המוח הקידומתי פרפורמלדהיד לבין המוח הטרי שנשמר במהירו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH (R15DA029863), מענק אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק מחקר לתואר ראשון (M30014) ואוניברסיטת רוס של מענק מחקר לרפואת הווטרינרית. ברצוננו להודות למכון הלאומי לשימוש בסמים (Rockville, MD) למתן (±) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (± MDMA) עבור עבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בדיקת בקרה שלילית RNAscope-DapBאבחון תאים מתקדם, INC310098
RNAscope Pretreat 4אבחון תאים מתקדם, ערכת
אבחון תאים מתקדםאדום310036
אבחון תאים מתקדםRn-Ppib313921
Htr2aחולדהאבחון תאים מתקדם, INC300031
CryostatLeicaCM 1850
שייקר אופקיVWR88032-088
תנור היברידיזציהתרמו פישר סיינטיפיק222000
שקופית מיקרוסקופ סופרפרוסט פלוספישר סיינטיפיק12-550-15
עט הידרופוביוקטורH-4000
מיקרוסקופאולימפוספרוביס AX70
ריאגנטים RNAscope 2.0 HD 320046 - , בדיקת RNAscope INC- , INC

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
  3. Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234(2013).
  4. Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
  5. Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
  6. Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
  8. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
  10. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
  11. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
  12. Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
  13. Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
  14. Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
  15. Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
  16. Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
  17. Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
  18. Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HTR2AFast RedImage JRNA

מאמרים קשורים