ללא תווית מולקולה בודדת איתור באמצעות תהודה אופטית Microtoroid

Summary

פיתחנו מערכת חישה ביולוגית נטולת תוויות המבוססת על טכנולוגיית תהודה אופטית הידועה בשם Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) המסוגלת לזהות מולקולות בודדות בתמיסה. כאן מתוארים ומוצגים הנהלים מאחורי עבודה זו.

Abstract

יש גילוי ריכוזים קטנים של מולקולות עד לגבול המולקולה הבודד השפעה על תחומים כגון גילוי מוקדם של מחלה, ומחקרים בסיסיים בהתנהגות של מולקולות. שיטות לזיהוי מולקולה בודדות נפוצות לנצל תוויות כגון תגי ניאון או נקודות קוונטיות, לעומת זאת, תוויות לא תמיד זמינות, להגדיל את העלות ומורכבות, ויכולות להפריע האירועים נחקר. תהודה אופטית צמחה כאמצעי מבטיח לזהות מולקולות בודדות ללא השימוש בתוויות. נכון לעכשיו החלקיקים הקטנים ביותר שזוהו על ידי מערכת שאינה plasmonically משופרת חשופה אופטית מהוד בפתרון הוא תחום פוליסטירן 25 ננומטר ^1. פיתחנו טכניקה המכונית תדר נעילה אופטי לוחש חלוף מהוד (פרח) שיכול לעלות ממגבלה זו ולהשיג זיהוי מולקולה בודד ללא תווית בתמיסה מימית ^2. כעוצמת אות מאזניים עם חלקיקי נפח, העבודה שלנו מייצגת improveme 100x>NT ביחס האות לרעש (SNR) על המצב הנוכחי של האמנות. כאן הנהלים מאחורי הפרחים מוצגים במאמץ להגדיל את השימוש שלה בתחום.

Introduction

ניסויי זיהוי מולקולה בודדים הם שימושיים להפחתת כמות אנליטי המשמשת בחיישנים, לגילוי מוקדם של מחלה, ולבדיקת התכונות הבסיסיות של מולקולות ^3. ניסויים כאלה בדרך כלל מבוצעים באמצעות תוויות, לעומת זאת, תוויות לא תמיד ניתן להשיג לחלבון מסוים, להגדיל את העלות, יכול להפריע האירועים הנחקרים, ויכולות להיות לא נוח, במיוחד בזמן אמת באתר ניסויים או נקודה-של- אבחון טיפול.

תקן הזהב הנוכחי לbiosensing ללא תווית הוא תהודת plasmon פני השטח ^4, עם זאת יש לי מערכות תהודת plasmon פני השטח המסחרית בדרך כלל גבול תחתון אופייני לזיהוי על סדר ננומטר. לאחרונה, תהודה אופטית צמחה כטכנולוגיה מבטיחה לbiodetection מולקולה בודדת ללא תווית ^5. בהתבסס על הטווח הארוך (NS) תהודה עבודה אופטית כליאה של ^6,7 אור. האור הוא evanescentlyבשילוב למכשירים אלה בדרך כלל באמצעות סיב אופטי. כאשר אורך הגל של האור עובר הסיבים תואם את אורך גל התהודה של המהוד, להדליק יעילות זוגות למהוד. אור שילוב זה לגמרי פנימי משקף בתוך החלל של מהוד יצירת שדה חלוף בקרבת ההיקף של המהוד. כחלקיקים להיכנס לתחום ולאגד חלוף למהוד, גל התהודה של שינויי המהוד באופן יחסי להיקף החלקיקים ^8.

במונחים של יכולת איתור, תהודה microsphere שקודם לכן שימשה לזיהוי שפעת יחידה חלקיקי נגיף (100 ננומטר) ^9,10. לאחרונה, תהודה אופטית microsphere plasmonically משופר כבר משמשת לאיתור סרום שור יחיד אלבומין מולקולות ¹¹ וoligonucleotides 8-Mer ^12, לעומת זאת גישה זו מגבילה את האזור ללכוד חלקיקי 0.3 מיקרומטר ² לדהסְגָן. חיישנים גדולים יותר באזור ללכוד הם אידיאליים למקסם את הסיכוי לגילוי חלקיקים. טכנולוגיות נוכחית מבוסס פתרון ללא תווית biosensing עם אזורי לכידה (> 100 מיקרומטר ²⁾ גדולים היו מוגבלות לגילוי חלקיקי פוליסטירן ≥ 25 ננומטר.

פיתחנו מערכת ללא תווית biosensing המבוססת על טכנולוגית מהוד אופטית הידוע בתדר נעילה אופטי לוחש חלוף מהוד (פרח) ¹³ (איור 1), כי הוא מסוגל זיהוי של מולקולות בודדות בפתרון הזמן נפתרה. פרח משתמש החיים פוטון הארוכים של תהודה אופטית microtoroid בשילוב עם בקרת תדר נעילת משוב, זיהוי מאוזן, וסינון חישובית לאיתור חלקיקים קטנים עד מולקולות חלבון בודדות. השימוש בנעילת תדר מאפשרת המערכת תמיד לעקוב אחר תהודת ההסטה של ​​microtoroid כחלקיקים לאגד, ללא הצורך לטאטא או לסרוק את אורך גל הלייזר עלטווחים גדולים. העקרונות של פרח יכולים לשמש כדי לשפר את יכולות זיהוי של טכניקות אחרות, כוללים שיפור plasmonic. בדברים שלהלן, ההליכים לביצוע פרח מתוארים.

Protocol

1. התקנה ניסיונית והכנת דוגמאות

1. לפברק microtoroids באמצעות יתוגרפיה, תחריט, ונמס הליך כפי שתואר לעיל ^6. לפברק microtoroids על גבי פרוסות סיליקון (שבב) שיש לי קוטר גדול של 80-100 מיקרומטר, וקוטר קטן של 2 מיקרומטר בדרך כלל.
2. להירגע בערך מטר של סיבים במצב יחיד אופטיים (125 חיפוי מיקרומטר, 4.3 מיקרומטר קוטר שדה במצב) מסליל הסיבים שלה.
3. באמצע החלק התיר של הסיבים האופטיים, להפשיט קטע קטן (2.5 סנטימטרים) של ציפוי הפולימר סביב הסיב האופטי באמצעות חשפניות תיל. הערה: זה הוא החלק מהסיבים האופטיים שישמשו לevanescently זוג אור לתוך microtoroid.
4. נקה את הסיבים הפשיטו עם אלכוהול isopropanol ומוך חופשי למחוק.
5. להחזיק חלק זה של הסיבים במקום באמצעות בעל סיבים עשוי מהדק מגנטי.
6. הסיבים הפשיטו דקים ל~ 500 ננומטר ידי meltinז ומושך באמצעות לפיד מימן ושני מנועי צעד נעים בכיוונים מנוגדים על 60 מיקרומטר / min. מקם את הסיבים האופטיים בתוך החלק העליון של הלהבה, שאמורה להיות ~ 10 מ"מ גבוה. פסק למשוך הסיבים כאשר השידור דרך הסיבים מפסיק משתנה, אשר יכול להיות במעקב או חזותי (על ידי צפייה באור שמפוזר רוחבי ממצמוץ הסיבים לסירוגין) או על ידי חיבור הסיבים לphotodiode אשר מצורף לאוסצילוסקופ .
7. קליב קצה אחד של הסיבים האופטיים ולהכניס אותו לתוך מתאם סיבים חשוף. הנח הקצה הזה של הסיבים לקלט של photoreceiver.
8. כמה סיבי הקצה השני של סליל הסיבים לליזר באמצעות מצמד סיבים אופטי.
9. מניחים את שבב microtoroid על גבי בעל מדגם (פלדת אל-חלד, 37.8 מ"מ x 6.4 מ"מ x 3.2 מ"מ) או באמצעות אפוקסי או סרט דו צדדי.
10. הר בעל מדגם על גבי שלב מיצוב שכולל של ננו-הבלטה 3-ציר (nשלב anocube) (ראה רשימת ציוד) על גבי מיקרומטר 3-ציר. לבצע את כל הניסויים על שולחן אופטי מבודד פניאומטית כדי למזער תנודות.
11. עמדה גסה שבב המדגם באמצעות מיקרומטר 3-הציר.
12. יישר מקביל שבב המכיל microtoroid לסיבים האופטיים באמצעות ננו-positioner. הערה: יישר את microtoroid במרחק של אורך גל אחד של אור הקלט (~ 633 ננומטר). להדמיה של תהליך זה משתמש בשתי עמודות הדמיה (צינור עם עדשה ומצלמה אובייקטיביות, לראות את רשימת ציוד) ממוקם בחלק העליון ובצד של השבב.
13. לייעל את הקיטוב של אור הלייזר המכוון דרך הסיבים האופטיים באמצעות בקר קיטוב ב- קו (ראה רשימת ציוד) עם ידית כדי להתאים את הקיטוב. הערה: קיטוב אופטימלי מושגת כאשר לטבול הנמדד בהעברת הסיב האופטי מופיע הצר. שים לב לטבול זה על אוסצילוסקופ (ראה שלב 2.2 לפרטים נוספים).
14. לִבנוֹתמדגם קאמרי ידי epoxying coverslip זכוכית על הבמה המדגם באמצעות שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית כspacer. הערה: מארז פרספקס מכסה את כל ההתקנה עשוי להיות שימושי עבור מזעור זרמי אוויר. פתח קטן יש להשאיר כדי לאפשר פתרון להישאב בבאמצעות צינורות.
15. תרמית לאזן השעיות חלקיק או תמיסות מימיות מולקולה בודדת ל≥ 1 שעה באמבט מים RT (~ 500 מיליליטר). הערה: דוגמאות מדוללות לריכוז הרצוי בצינורות microcentrifuge באמצעות המאגרים הקשורים צוינו מהיצרן, למשל, PBS או HEPES. אם אין אירועים מחייבים מזוהים, להגדיל את ריכוז מלח למאגר.
16. חלקיקי מערבולת המכילים פתרונות קצרים (1 מיליליטר) ל~ 2 שניות.
17. הזרק פתרונות חלקיקים המכילים לתוך תא המדגם של 1 מיליליטר / דקה באמצעות משאבת מזרק 1 מיליליטר.
18. לאחר המדגם קאמרי מילא, לכבות את משאבת המזרק.
19. המתן 30 שניות לפני שנתוני הקלטה כדי למזעראת ההשפעות של תנודות מכאניות הנובעות מזרימת נוזל שיכול להשפיע על המדידה.

נעילת 2. תדר

1. Re-זוג toroid לסיבים האופטיים על ידי הזזת בעל המדגם עם nanopositioner, כי הצימוד יופרע בשל ההזרקה של נוזל.
2. אתר את גל התהודה של microtoroid ידי סריקת לייזר קלט מבוקר מחשב באמצעות מגוון רחב של אורכי גל. לבצע שלב זה על ידי שליחת אות מתח צורת גל משולשת לאלמנט פיזואלקטריים בתוך בקר הלייזר המסדיר את אורך הגל של הלייזר. לבצע ניסויים באמצעות אור הנראה (635 ננומטר ± 2.5 ננומטר) כפי שיש קליטה נמוכה של אור במים באורך גל זה.
3. מדוד את העברת האור דרך הסיבים האופטיים על ידי חיבור הפלט של הסיבים האופטיים לphotoreceiver אוטומטי מאוזנת. חבר את הפלט של photoreceiver לאוסצילוסקופ באמצעות כבל BNC. שים לב on אוסצילוסקופ כי באורך גל התהודה של microtoroid, שידור דרך הסיב האופטי טיפות.
4. צרף את הפלט של photoreceiver לכניסה הראשית של תדירות נעילת בקר משוב (ראה רשימת ציוד) באמצעות כבל.
5. הפעל את בקר משוב תדירות נעילה במצב נעילה אוטומטית באמצעות שיא העליון של נעילה עם תדר רעד של 2 קילוהרץ והמשרעת של תנודה אורך גל של 19 FM. באופן אמפירי להגדיר את ההגדרות יחסיות-נפרד נגזרות בחלון התוכנה באמצעות כללי כוונון זיגלר-ניקולס ^14. הערה: ערכים אלה צריכים להיות מוגדרים רק פעם אחת בתחילת כל הניסויים.
6. Auto-לנעול את אורך הגל של הלייזר לגל התהודה של microtoroid. לבצע שלב זה לאחר מילוי המדגם קאמרי. הערה: אם שינוי אורך הגל גדול מדי, אז בקר המשוב יאבד מנעול ולעבור באופן אוטומטי למצב סריקה כדי לאתר את מיקום אורך גל תהודה. OC זהכלאיים לגל עובר גדולים יותר מכ אחד linewidth (לפחות 600 FM עבור כל המערכות נחקרו כאן).
7. להקליט את הפלט של בקר המשוב על 20 קילוהרץ באמצעות כרטיס רכישת נתונים 24 סיביות. לייצא את הנתונים כקובץ טקסט באמצעות תוכנת רכישת נתונים.

3. עיבוד נתונים וניתוח

1. התמרת פורייה נתונים בMATLAB.
2. נמוך לעבור את הנתונים באמצעות מסנן "לבנים-קיר" עם הפסקת בkHz 1 כדי להסיר את תדר הרעד שהוטל של 2 קילוהרץ (ראה נוסף קוד קובץ 1 צילום המסך).
3. המחשוב ברמה גבוהה לסנן את הנתונים באמצעות גודל חלון של 16 הרץ. הערה: זה נעשה כדי להסיר מקורות ידועים של רעש, במקרה זה, רעש 60 הרץ קו אלקטרוני וההרמוניות שלה, כמו גם 100 הרץ (מגיע מהנהג הלייזר) וההרמוניות שלה (ראה נוסף קוד קובץ 1 צילום המסך).
4. פורייה הפוך להמיר את הנתונים חזרה לתחום הזמן.
5. מסנן חציון נתונים באמצעות חלוןגודל של 1,001 דגימות (ראה נוסף קוד קובץ צילום המסך 2).
6. אתר שינויי צעד באורך גל התהודה באמצעות אלגוריתם הצעד-מציאת של et al Kerssemakers. ^15.
7. צור היסטוגרמות של משרעת של כל צעד מחייב.
8. חישוב גודל חלקיקים באמצעות משוואה. (1) (ראה דיון).

Results

חלקיקים מחייבים אירועים נראים בבירור כשינויי צעד כמו באורך גל התהודה של microtoroid לאורך הזמן (איור 2 א). הגבהים של צעדים אלה מוצגים כהיסטוגרמה באיור 2. איורים 2-4 להראות עקבות נציג המחייב של exosomes (nanovesicles), חרוזים סיליקה 5 ננומטר, ואינטרלויקין -2 מולקולות אנושיות אחת, בהתאמה. העובדה שאירועי צעד כמו בקנה מידה עם גודל חלקיקים מראה כי הטכניקה שבוצעה כהלכה. זה עשוי להיות מנותח על ידי יצירת היסטוגרמה של גבהים צעד (אי...

Discussion

כחלקיקים נקשר, גל התהודה (λ) של עליות toroid. אם חלקיק מסיר את חבלים מעל, גל התהודה יורד בהתאמה (אירוע צעד למטה). קוטר החלקיקים (ד) ניתן לקבוע באמצעות היסטוגרמות של משרעת של כל שלב אורך גל. הגובה של כל שלב אורך גל משתנה בהתאם לשינויים בגודל של החלקיקים הכבולים ובשל המיקום על microtoroid בי החלקיקים נקשר. השינוי המרבי באורך גל תהודה (גובה צעד) מתרחש כאשר חלקיקים לאגד בקו המשווה של microtoroid שבו השדה החשמלי (E _{0, מקסימום)} היא מקסימאלי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
לייזר דיודה מתכוונן	Newport	TLB-6300
בקר לייזר	Newport	TLB-6300-LN
בקר משוב נעילת תדרים	Toptica Photonics	Digilock 110
מקלט פוטו מאוזן אוטומטית	Newport	דגם 2007
בקר קיטוב מקוון	General Photonics	PLC-003-S-90
כרטיס רכישת נתונים 24 סיביות	National Instruments	NI-PCI-4461
אינטרלוקין אנושי רקומביננטי-2	פירס ביוטכנולוגיה	R201520
חרוזי פוליסטירן 20 ננומטר	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
שולחן אופטי	ניופורט	VH3660W-OPT
עדשת אובייקטיבית לעמודת הדמיה	Navitar Machine Vision	1-60228
עמודת הדמיה (צינור מתאם)	Navitar Machine Vision	1-60228
מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה לעמודת הדמיה	Edmund Industrial Optics	NT39244