המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR בדגימות FFPE.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין
במאמר זה
סיכום
תקציר
ddPCR היא שיטת PCR רגישה ביותר המשתמשת במערכת תחליב מים-שמן. באמצעות מחולל טיפות, דגימת חומצת גרעין שחולצה מחולקת ל~20,000 טיפות בגודל ננו, מים בשמן, והגברת PCR מתרחשת בטיפות בודדות. גישת ddPCR היא בזיהוי מוטציות ברצף, שינויים במספר העותקים וסידורים מחדש מבניים נבחרים הכוללים גנים ממוקדים. כאן, אנו מדגימים את השימוש ב-ddPCR כטכניקה רבת עוצמה לכימות מדויק של מוטציות BRAF V600E נדירות בקווי תאים סטנדרטיים של FFPE, מה שמסייע בזיהוי אנשים עם סרטן. לסיכום, טכניקת ddPCR מציעה פוטנציאל לפרופיל מדויק של המוטציות הנדירות הספציפיות בגנים שונים בסוגים שונים של דגימות FFPE.
מבוא
ההצטברות של מוטציות גנטיות בגנים רגולטורי מפתח משנה תיכנות תא נורמליות כמו התפשטות תאים, התמיינות, והישרדות, שמוביל לסרטן 1. מסלול קינאז RAS-RAF-MAP מתווך תגובות הסלולר לאותות צמיחה. מוטציות הסרטניות BRAF יכולות לנבוע ממוטציות נהג בגן BRAF, שעלול לגרום לBRAF oncoprotein להפוך פעיל יתר על המידה 2. מוטציות בגן BRAF גם לגרום לאיתות במורד הזרם פעיל יתר על המידה באמצעות MEK וERK 3, אשר, בתורו, מוביל לצמיחת תאים מופרזת והפצה עצמאית של רגולציה בתיווך גורם גדילת 4-6.
מספר כלים זמינים לפרופיל המוטציה בדנ"א, כגון מוטציות V600E BRAF כמותית בזמן אמת ב, קווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא על ידי ddPCR. ddPCR היא שיטת PCR מבוסס לכימות מוחלטתמציע דיוק גבוה יותר בהשוואה לזמן האמיתי קונבנציונלי PCR (qPCR) 7,8. ddPCR מספק גם גבוה יותר פתרון כוח ודיוק לגילוי מוטציות נדירות בתבניות DNA, המאפשר חקר סרטן יותר אינפורמטיבי ואבחון 9. יתרונות נוספים של ddPCR על qPCR הקונבנציונלי כוללים רגישות משופרת שלה ודיוק כאשר לומדים מספרי עותק תבנית נמוכה 10-12. במסמך זה, באופן אוטומטי לפרוטוקול חילוץ DNA מהקווים התייחסות FFPE סטנדרטי תא, ואחרי קביעת קיומו או העדרו של מוטציות BRAF V600E ידי ddPCR הוא הוכיח. השימוש בתוכנה לניתוח נתונים וייצוג גרפי של התוצאות גם מתואר. כל ההליך הוא פשוט יחסית ולגמרי תלוי במספר הדגימות שצדודית ומספר מכונות PCR וddPCR קונבנציונליים זמין.
הפרוטוקול הבא מתאר נהלים סטנדרטיים לBR קווי AF-V600E חיובי התייחסות FFPE סטנדרטי תא (HD598, HD593, HD617, HD273 וwildtype (WT)) מתבצע במכשיר אוטומטי לחלוטין באמצעות פרוטוקול רקמות הכנת המערכת (תב"ע). בהמשך לכך, דגימות DNA מבודדות מנותחות לנוכחות מוטציות BRAF V600E באמצעות מערכת ddPCR. ניתוח מוטציה ממוקד מתבצע לאחר כל הדגימות כבר צדודית ונתונים כבר נטענו לתוך תוכנת ניתוח נתונים. תלוי במספר דגימות / קבוצות למדו, ניתוח נתונים עשוי לדרוש מאחד לכמה שעות. הרכיב הניסיוני של המתודולוגיה דורש דיוק בטיפול ב- DNA ובית דגן מטפטף וPipettors, וידאו חינוך מדע יופיטר להסביר יותר על אודות ההקשר של pipetting "> pipetting לתוך 96 צלחות גם, תוך ניתוח נתונים נעשה באמצעות תוכנה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הפקת DNA משורות תאי FFPE ההפניה תקן
הערה: הליך זה, מיצוי DNA בוצע מהקווים התייחסות FFPE סטנדרטיים תא (HD598, HD593, HD617, HD273 וwildtype (WT)) באמצעות ערכת בידוד DNA רקמות FFPE כפי שתואר בפרוטוקול בהמשך. מיצוי DNA אוטומטי הושג על ידי ביצוע הוראות היצרן לסך בידוד DNA.
- באמצעות microtome ולחסום FFPE המקורי, להכין ידני סעיפים טריים לפני מיצוי DNA וניתוח, בהתאם לנהלים שנקבעו. ודא שקלט המדגם לסעיף הרקמות (ים) ניתח אינו עולה על עובי כולל משולב של 10 מיקרומטר וששטחם אינו עולה על 600 מ"מ 2 לסעיף אחד.
1.2 פרוטוקול תב"ע
הערה: הכרכים מוצגים בטבלה 1 מתאים למינימום הנדרש כדי לעבד 48 דגימות, וההליךמוצג הוא בהתאם להנחיות תב"ע. לפני תחילת הניסוי להתיישב דגימות FFPE בדואר הצינור על ידי צנטריפוגה ב 600 XG, כדי למנוע אובדן של דגימות במהלך התכנית האוטומטית.
- הפעל את מכשיר בידוד DNA האוטומטי ומחשב. פתח את תוכנת שליטה על הפעלה ולהכניס מגש עומס אוטומטי לאזור טעינת סיפון תב"ע.
- לוותר ריאגנטים לשקתות המקבילה שלהם כפי שמוצג באיור 1.
- מניחים את 4 הדגימות (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% ו 1%) במדפי ספק מדגם.
- מניחים את תיבות קצה בשקתות בעמודות 2 ו -3 ולבדוק את הטיפים לנוכחות של מסנן אחד או יותר לקצה, אשר לקטוע את המסלול.
- להבטיח ערבוב נכון של מאגר תמוגה ולשטוף חיץ על ידי היפוכם 3-5 פעמים ולטעון אותם לתוך השקתות המתאימות בעמודה 4 (איור 1).
- לאחר היפוך לכמה פעמים או וארט קלexing, לטעון את חיץ elution, חרוזים מגנטיים, וחיץ FFPE בשקתות הקטנות בעמודה 5, משאיר חריץ 1 ריק שבו הצביע (איור 1, לוח 1).
- לטעון צלחת גם עמוקה 2 מיליליטר (DWP) על נושאת הצלחת (איור 1).
- בצע את השלבים הסופיים הבאים לפני שמתחיל לרוץ:
- Uncap כל הצינורות ושקתות מגיב. ודא שקיבולת מספקת זמינה בבקבוק הפסולת הנוזלי. ודא שבקבוק הפסולת המוצק הוא ריק ומרופד בשקית Biohazard. ודא שצלחת הוצאת הקצה מרוכזת בהרכבת הפסולת.
- סגור את המכסה הקדמי.
- הפעל את התוכנה. פתח את קובץ NA_Prep_Main_MLSTARlet.med.
- לחץ על "התחל". מצב המכשיר יעבור ממצב המתנה להפעלה.
- הזן את מספר הדגימות לריצה זו. בחר את השיטה הרצויה לטווח זה (דנ"א = 0). הזן את העמדה הגבוהה כרך הראשוןUme קצה, בחירה "1" אם כל המגשים מלא. הזן את העמדה של קצה הנפח הסטנדרטי הראשון, בחירה "1" אם כל המגשים מלא.
הערה: אז המכשיר יפעל באמצעות צעדים אוטומטיים ללא התערבות משתמש. עבודה מפורטת מוצגת באיור 2. ברגע שהניסוי נגמר, פסולת מגיב וטיפים מוזרקים להרכבת הפסולת. - לכמת DNA הגנומי המטוהר באמצעות שיטת fluorometric.
הערה: דגימות DNA המכילות ריכוז מינימאלי של 3.3 ng / μl נתונים לניתוח ddPCR (סעיף 2).
2. DNA מוטצית פרופיל: ddPCR פרוטוקול
הערה: הפרוטוקול לפרופיל ה- DNA מוטציה כולל 3 שלבים עיקריים: 1) דור אגל, 2) הגברה הקונבנציונלית PCR, 3) קריאת אגל ו4) פרופיל המוטציה בדנ"א.
2.1. דור אגל
הערה: Supermix ddPCR הואמומלץ לddPCR, כמו זה תערובת מכילה חומרים כימיים הנדרשים לדור אגל.
- כדי למנוע זיהום, בצע את אמצעי זהירות סטנדרטית, כגון כפפות, באמצעות מכסה המנוע נקי PCR, pipets הנקי, וצינורות נמוכים מחייב חלבון.
- ודא שהריכוז המינימאלי של דגימת DNA הגנומי אנושית הוא 3.3 ng / μl. הערה: כמות ריכוז דגימת DNA מטוהר תשתנה בהתאם לניתוח של זיהוי תדירות מוטציה%.
- להרכיב תערובות תגובה בצלחות PCR 96-היטב. להפשיר ולאזן את מרכיבי התגובה לRT. הכן PCR תגובות על ידי שילוב של Supermix 2X ddPCR (10 μl) ו -20 פריימרים (קדימה הפוכים, 900 ננומטר) ובדיקה (250 ננומטר) עם כל דגימת DNA מטוהרת (66ng / 2 μl) לעשות עד 20 μl עם מים מזוקקים (כ לגנרטור אגל הפרוטוקול)
- מערבולת לערבב ביסודיות כדי להבטיח צנטריפוגות הומוגניות ובקצרה לאסוף את התוכן בחלק התחתון של הצינור לפני מחלק. עומס 20 & #181; l על המחסנית להיווצרות טיפה.
- מבצע של גנרטור אגל, לפרוטוקול המומלץ של היצרן
- הכנס את המחסנית לתוך המחזיק עם החריץ במחסנית ממוקמת בצד השמאלי העליון של בעל. הוסף 20 μl של תערובת תגובה המכילה דגימות למרכז הרחבה, ו -70 μl של גנרטור שמן לתוך הבארות התחתונה.
- צרף את האטם לרוחב החלק העליון של המחסנית. ודא שהאטם הוא מאובטח מכור בשני קצותיו של בעל; אחרת, לחץ מספיק לדור אגל לא יושג.
- פתח את מחולל אגל על ידי לחיצה על הכפתור הירוק בחלק העליון של המכשיר והכנס את המחסנית. כאשר בעל הוא במיקום הנכון, גם את הכח (משמאל מימין) ובעל (מימין באמצע) נוריות חיווי ירוקות.
- לחץ על הכפתור העליון במכשיר שוב כדי לסגור את הדלת וליזום דור אגל. הערה: לאחר הלחיצה על Button, סעפת עמדות על עצמו שוב את הבארות לשקע, ציור שמן ודגימות באמצעות ערוצי microfluidic, שבו טיפות נוצרות. טיפות לזרום לתוך אגל גם, שבו הם צוברים. נורית חיווי אגל (מימין) הבזקים ירוקים לאחר 10 שניות כדי לציין שדור רביב הוא בהתקדמות.
- כאשר דור רביב הוא מלא, כל 3 נוריות החיווי ישתנו לצבע ירוק מוצק; לפתוח את הדלת על ידי לחיצה על הכפתור, ולהסיר את בעל מהיחידה. הסר את האטם חד פעמי מהמחזיק וזורקים אותו. הערה: הבארות העליונה של המחסנית מכילות טיפות, ובארות אמצע ונמוכות הן כמעט ריקות, עם כמות קטנה של שמן שיורי.
2.2. הכנה לPCR
- עבור כל דגימה, pipet את 40 μl של תוכן הטיפה מהחלק העליון גם המחסניות לתוך באר בודד של צלחת 96-היטב PCR מומלץ כפי שצוין בפרוטוקול המכשיר של היצרן. לאטה: בעזרת פיפטה רב-ערוצים הוא אידיאלי להעברת תחליבי טיפות. שאיפה איטית ועדינה של טיפות מומלץ למזער גז אגל במהלך העברה.
- חותם את צלחת PCR עם רדיד מייד לאחר העברת טיפות, כדי למנוע אידוי. השתמש חותמות צלחת נייר כסף לנקבה שתואמות את אוטם צלחת PCR והמחטים בקורא הטיפה. בצע את ההוראות במדריך הוראות אוטם צלחת PCR.
- הגדר את טמפרטורת אוטם צלחת 180 ° C וזמן 5 שניות.
- גע בחץ כדי לפתוח את דלת המגש. מקם את בלוק התמיכה על המגש עם צד 96-גם פונה כלפי מעלה. מניחים את צלחת 96-גם על לחסום את התמיכה ולהבטיח כי כל בארות הצלחת מיושרות עם בלוק התמיכה.
- מכסה את צלחת 96-היטב עם גיליון 1 של חותם נייר כסף לנקבה. ברגע שצלחת 96-היטב מאובטחת על בלוק התמיכה ומכוסה בנייר כסף את החותם לנקבה, גע בלחצן החותם. המגש ייסגרואיטום חום ייזום.
- כאשר איטום חום הוא מלא, הדלת נפתחת באופן אוטומטי; להסיר את הצלחת מהגוש החום לרכיבת תרמית ולאחר מכן להסיר את הגוש החום.
- ודא שכל הבארות בצלחת חתומות על ידי בדיקה ששקעים בנייר הכסף הם ברורים ממבט על כל טוב. ברגע אטום, הצלחת מוכנה לרכיבת תרמית.
- ברגע שטיפין יוסרו, לחץ על התפסים בבעל המחסנית כדי לפתוח אותו. הסר את המחסנית הריקה וזורקים אותו.
- בצע הגברה PCR קונבנציונלית על ידי ביצוע הפרמטרים מפורטים בטבלה 2.
2.3 קריאת אגל (לפי הפרוטוקול המומלץ של היצרן)
שים לב: בעקבות ההגברה PCR של יעד חומצות גרעין בטיפין, מכשיר טיפת קורא מנתח כל טיפה בנפרד באמצעות מערכת זיהוי 2-צבע 13. אנחנו בדרך כלל להגדיר כדי לזהות FAMfluorophores כתב ד ויק.
- לחץ על "מערכת פלאש" לראש קורא הטיפה ולהפוך אותו מוכן לניתוח ddPCR.
- טען את הצלחת לתוך קורא אגל ולחץ על "התחל". קורא אגל aspirates כל דגימה, singulates הטיפות, ונחליהם בקובץ יחיד עבר גלאי 2-צבע. הגלאי קורא את הטיפות למנות דוגמאות חיוביות ושליליות.
- כאשר קריאת רביב היא מלאה, לפתוח את הדלת ולהוציא את בעל צלחת מהיחידה. הסר את צלחת ה- PCR 96-היטב מהבעל וזורקים אותו.
- לתחזוקה נאותה, להחליף את שמן טיפת הקורא ורוקן את פח האשפה במידת צורך. להוסיף 50 מיליליטר של אקונומיקה 10% לבקבוק הפסולת כדי למנוע התפתחותם של חיידקים.
2.4 פרופיל מוטציה בדנ"א (לפי הפרוטוקול המומלץ של היצרן)
הערה: טיפות PCR חיוביות והשליליות PCR-נספרות לספק quantific המוחלטני של יעד מוטציות BRAF V600E DNA בצורה דיגיטלית, תוך שימוש בתוכנת ניתוח נתונים.
- לחץ על הגדרה להזין מידע על דגימות, מבחני, וניסויים.
- בחלון ההתקנה, לטעון צלחת (filename.qlp), לאחר מכן לחץ על ניתוח כדי לפתוח ולנתח את הנתונים. ממשק ניתוח הנתונים מופרד לשלושה חלונות: לוח תוצאות, ובכן בורר ו / תצוגה גרפית עיבודים.
- בחלון העיבודים, נתונים ריכוז לכל יעד יופיעו בבארות במפת הצלחת ונספרו בטבלת התוצאות. לחץ ריכוז לדמיין נתונים בחלקות ריכוז.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לניתוח ddPCR, למדנו שורות תאי BRAF V600E התייחסות FFPE המוטציה סטנדרטית. קורא הטיפה מתחבר לתוכנת ניתוח נתונים ריצת מחשב נייד. כל טיפה בודדת מוגדרת על הבסיס של משרעת ניאון כמו להיות חיובי או שלילי. התוכנה המסופקת על ידי יצרן גם מאפשרת חיתוך משתמש מוגדר להיות נכנס להגדיר את הסף בין הטיפות החיוביות ושליליות. מספר הטיפות חיוביות ושליליות במדגם משמש לחישוב הריכוז של היעד במונחים של עותקים / μl.
הקרינה זוהתה ו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מדגישים את תחולתו של ddPCR ובידוד DNA מדגימות שורת תאים סטנדרטי התייחסות FFPE להערכת מוטציה הגנטית ספציפית. במחקר זה, שיטת בידוד תב"ע האוטומטית DNA משמשת שניתן להתאים בקלות, אוטומטי, ויכולה להכיל עד 48 מדגמים שונים בו זמנית, מה שמאפשר לניסויים בקנה מידה גדולים יותר והשתנות נמוכה יותר. אחת המגבלות של בידוד DNA בעבודה הנוכחית הוא שכל מדגם FFPE הוא ייחודי, וישתנה אחד אחרת במזהמי משטח, צמחיית חיידקים, ו / או רקע גנטי אנושי. באופן כללי, איכות וכמות ה- DNA חילוץ וההצלחה של...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
מיונג Ryuri אה, סי יון קים, וצעיר Deug קים הן עובדי מלון האביון CRO.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר ופיתוח לחברה של קרן המחקר הלאומית (NRF), ממומנת על ידי משרד המדע, טכנולוגיות מידע ותקשורת ותכנון עתידי (מענק מס '2013M3C8A1075908).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מכשיר Hamilton MICROLAB STARlet IVD | סימנס | 10701001 | מכשיר בידוד DNA אוטומטי |
| מחולל טיפות QX200 | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 קורא טיפות | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| מכונת PCR קונבנציונלית המסוגלת לכוונון | 621BR17718 | ||
| PX1 אוטם צלחות PCR | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| תוכנת QuantaSoft | Bio-Rad | ||
| ריאגנטים להכנת רקמות VERSANT קופסה 1 | סימנס | 10632398 | |
| VERSANT ריאגנטים להכנת רקמות קופסה 1 | סימנס | 10632399 | |
| CO-RE טיפים | סימנס | ||
| ddPCR ניתוח | |||
| ddPCR סופרמיקס | ביו-רד | BR186-3010 | בריכוז 2X |
| ביו-רד | BR186-4008 | ||
| שמן מחולל טיפות | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| אטם | ביו-רד | BR186-3006 | |
| שמן קורא טיפות | Bio-Rad | BR-186-3004 |
מקורות
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943(2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
