הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידול של הקו הסלולרי SH-SY5Y האדם נוירובלסטומה

79.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53193

⸱

17 בפברואר 2016

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University

במאמר זה

סיכום

זה קריטי בנוירוביולוגיה ובנוירו-וירולוגיה שתהיה מערכת מבחנה אמינה וניתנת לשכפול המשמשת כמודל תרגומי למה שקורה in vivo בנוירונים אנושיים. פרוטוקול זה מתאר כיצד לתרבית ולהבדיל תאי נוירובלסטומה אנושיים SH-SY5Y לנוירונים ברי קיימא לשימוש ביישומי מבחנה.

תקציר

קיום מערכות מתאימות in vivo ו-in vitro המספקות מודלים תרגומיים למחלות אנושיות הוא היבט אינטגרלי של מחקר בנוירוביולוגיה ובמדעי המוח. מודלים ניסויים מסורתיים במבחנה המשמשים בנוירוביולוגיה כוללים תרביות עצביות ראשוניות מחולדות ועכברים, קווי תאים נוירובלסטומה כולל תאי B35 של חולדות ותאי Neuro-2A של עכברים, תאי PC12 של חולדות ותרביות פרוסות לטווח קצר. בעוד שחוקרים רבים מסתמכים על מודלים אלה, הם חסרים מרכיב אנושי והשפעות ניסיוניות שנצפו יכולות להיות בלעדיות למין המתאים ועשויות שלא להתרחש באופן זהה בבני אדם. בנוסף, למרות שתאים אלה הם נוירונים, ייתכן שיש להם קריוטיפים לא יציבים, מה שהופך את השימוש בהם לבעייתי למחקרים על ביטוי גנים ומחקרים הניתנים לשחזור של איתות תאים. לכן חשוב לפתח מודלים עקביים יותר של מחלות נוירולוגיות אנושיות.

ההליך הבא מתאר שיטה קלה לביצוע וניתנת לשחזור להשגת תרביות עצביות אנושיות הומוגניות וברות קיימא, על ידי בידול קו תאי הנוירובלסטומה האנושי היציב כרומוזומלית, SH-SY5Y. שיטה זו משלבת מספר שיטות שתוארו קודם לכן1-4 ומבוססת על הסרה רציפה של סרום מהמדיה. ציר הזמן כולל הרעבה הדרגתית של הסרום, עם הכנסת חלבוני מטריצה חוץ-תאיים וגורמים נוירוטרופיים. זה מאפשר לנוירונים להתמיין, בעוד שתאי אפיתל נבחרים נגדם, וכתוצאה מכך נוצרת תרבית עצבית הומוגנית. תוצאות מייצגות מדגימות את ההתמיינות המוצלחת של תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y מפנוטיפ תא ראשוני דמוי אפיתל לפנוטיפ עצבי נרחב ומסועף יותר. פרוטוקול זה מציע דרך אמינה ליצור אוכלוסיות הומוגניות של תרביות עצביות שניתן להשתמש בהן לניתוחים ביוכימיים ומולקולריים עוקבים, מה שמספק לחוקרים מודל תרגומי מדויק יותר של זיהום ומחלות אנושיות.

מבוא

היכולת להשתמש במערכות מודל במבחנה שיפרה מאוד בתחומי נוירוביולוגיה מדעי המוח. תאים בתרבית לספק פלטפורמה יעילה לאפיין פונקציונליות חלבון מנגנונים מולקולרי תופעות ספציפיות בסיסיות, להבין את הפתולוגיה של מחלות וזיהומים, וכדי לבצע הערכות בדיקות סמים ראשוניות. בנוירוביולוגיה, הסוגים העיקריים של מודלי תרבית תאים כוללים תרבויות עצביות עיקריות נגזרו חולדות ועכברים, שורות תאי נוירובלסטומה כגון תאי העכברוש B35 5, בתאים עכבר נוירו-2A 6, ותאי PC12 עכברוש 7. למרות השימוש של שורות תאים כאלה התקדמה בתחום מזה, אך קיימים מספר גורמים מבלבלים הקשורים בטיפול הלא-אנושי תאים ורקמות. אלה כולל מינים ספציפי הבנת הבדלים בתהליכי חילוף חומרים, פנוטיפים של ביטוי מחלה, בפתוגנזה בהשוואה לבני אדם. כמו כן, חשוב לציין כימחדש הבדלים משמעותיים בין עכבר ביטוי גנים אנושיים ואיתות גורם שעתוק, המדגישות את המגבלות של מודלים מכרסמים ואת החשיבות של הבנה אשר מסלולים שמורה בין מכרסמים ובני אדם 8-11. אחרים המועסקים השימוש של שורות תאים עצביים האנושי כולל N-Tera-2 (NT2) בקו האנושי teratocarcinoma התא בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרה (iPSCs). שורות תאים אלה מספקים מודל טוב במבחנת מערכות אדם. עם זאת, התמיינות של תאי NT2 עם חומצה רטינואית (RA) תוצאות בדור של אוכלוסייה המעורבת של נוירונים, האסטרוציטים, ותאי גלייה רדיאלי 12, דבר מחייב צעד טיהור נוסף כדי להשיג אוכלוסיות טהורות של נוירונים. בנוסף, תאי NT2 להפגין קריוטיפ משתנה מאוד 13, עם יותר מ -60 כרומוזומים 72% של תאים. iPSCs להפגין השתנות בידול בין שורות תאים שונות, ונבדלים זה מזה יעיל בידול 14. לכן רצוי שיהיה מודל תאים עצבי אדם עקבי לשחזור כדי להשלים חלופות אלה.

SH-SY5Y תאים דמויי neuroblast הם subclone של הקו הסלולרי נוירובלסטומה הורית SK-N-SH. שורת תא ההורים נוצרה בשנת 1970 מתוך ביופסית מח עצם המכיל את שני neuroblast דמוי תאים דמויים אפיתל 15. יש תאי SH-SY5Y קריוטיפ יציב המורכב של 47 כרומוזומים, והוא יכול להיות מובחן ממצב neuroblast הדמוי אל הנוירונים שמהם מתפתחים שורה באמצעות מגוון רחב של מנגנונים שונים כולל שימוש RA, אסטרים phorbol, ו neurotrophins הספציפי כגון מוח נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF). ראיות לפני עולה כי שימוש בשיטות שונות ניתן לבחור עבור תת נוירונים ספציפיים כגון אדרנרגיים, כולינרגית, ו נוירונים דופאמינרגיים 16,17. ההיבט השני הזה גורם לתאי SH-SY5Y שימושי עבור מספר רב של ניסויים לנוירוביולוגיה.

ontent "> מספר מחקרים הראו ההבדלים חשובים בין תאי SH-SY5Y במדינות המובחנות בדיל שלהם. כאשר תאי SH-SY5Y הם מובחנים, הם מתרבים במהירות להיראות בלתי מקוטב, עם מעט מאוד, תהליכים קצרים. הם לרוב גדלים בגושים ולהביע סמנים המעידים על נוירונים בשלה 18,19. כאשר בדיל, תאים אלה להאריך ארוכים, מסועפים תהליכים, ירידה בהתרבות, ובמקרים מסוימים לקטב 2,18. תאי SH-SY5Y בדיל באופן מלא כבר הוכיחו בעבר להביע מגוון של סמנים שונים של נוירונים בוגרים לרבות גידול הקשורים החלבון (GAP-43), גרעינים עצביים (NeuN), synaptophysin (SYN), הסינפטי שלפוחית ​​חלבון II (SV2), נוירון אנולאז ספציפי (NSE) ו microtubule הקשורים החלבון (MAP) 2,16,17,20, ואת חוסר ביטוי של סמנים גליה כגון חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) 4. ב תמיכה נוספת שהבדילו SH-SY5Y תאים represeNT אוכלוסייה עצבית הומוגנית, הסרת BDNF התוצאה הסלולר אפופטוזיס 4. הדבר מצביע על כך ששיעור ההישרדות של תאי SH-SY5Y בדיל תלוי בגורמים תזונתיים, בדומה להבשיל נוירונים.

השימוש בתאי SH-SY5Y גדל מאז subclone הוקם בשנת 1978 3. כמה דוגמאות של השימוש שלהם כוללות חוקרת מחלת פרקינסון 17, מחלת אלצהיימר 21, ו בפתוגנזה של זיהום ויראלי כולל poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 אבעבועות רוח, שלבקת חוגרת, וירוס (VZV) 1, ציטומגלווירוס אדם 25, ו נגיף הרפס סימפלקס (HSV) 2,26. חשוב לציין כי מספר מחקרים באמצעות תאי SH-SY5Y השתמשו בתאים אלה בצורתם המובחנת, במיוחד בתחום neurovirology 27-36. ההבדל הפנוטיפ הנצפה של מובחן לעומת תאי SH-SY5Y בדיל מעלה את שאלת wheיס את התקדמות הזיהום נצפה יהיה שונה נוירונים בדיל בוגרים. לדוגמה, תאים SH-SY5Y הבדיל יש יעילות גבוהה יותר של ספיגת HSV-1 לעומת תאים שלא עברו התמיינות, SH-SY5Y מתרבים, אשר יכול להיות בגלל חוסר הקולטנים אשר נקלטות HSV ולווסת הכניסה על תאים SH-SY5Y מובחן 2. לכן זה קריטי כי בעת תכנון ניסוי התמקד בבדיקת נוירונים במבחנה, תאים SH-SY5Y צריך להיות מובחן על מנת לקבל את התוצאות המדויקות ביותר עבור תרגום השוואה למודלים in vivo.

פיתוח שיטה אמינה לייצר תרביות נוירונים אדם הוא הכרחי כדי לאפשר לחוקרים לבצע ניסויי translational במדויק מודל מערכת עצבים אנושי. הפרוטוקול המובא כאן הוא הליך תוחם מומלצים נגזר שיטות קודמות 1-4 להעשיר נוירונים אדם נחלקיםבאמצעות חומצה רטינואית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. שיקולים כלליים

  1. ראה טבלה של חומרים / ציוד כדי לקבל רשימה של ריאגנטים הצורך. ביצוע כל הצעדים בתנאים aseptic קפדנית.
  2. השתמש בסרום שור עובר חום המומת (hiFBS) עבור כל הכנות מדיה הכוללת FBS. כדי לחמם-להשבית, לחמם aliquot 50 מ"ל של FBS ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, היפוך כל 10 דקות (ראה גם לוח 1).
    הערה: כאשר FBS משמש ללא-איון חום, את הפנוטיפ דמוי אפיתל מתקדמת מהר יותר לאורך בתרביות תאים SH-SY5Y.
  3. לפני השימוש, לאפשר התקשורת לחמם לאזן באינקובטור כדי ליצור איזון pH תקין לפני כל צעד. לדוגמה, 50 מ"ל של התקשורת לוקח כשעה כדי לאזן באופן מלא (pH 7, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
    הערה: פרוטוקול זה משתמש הליך פיצול שני שלבים הדורש תאים מובחנים חלקית SH-SY5Y להיות trypsinized מחדש מצופה. זהו מלחיץתהליך התאים שברירי במיוחד אלה. לכן, חשוב כדי לדגור התאים טריפסין עבור כמות מינימלית של זמן. זה יאפשר עבור ההמראה המועדפת של נוירונים, עזב דמוי תאי אפיתל עדיין מחובר המנה.
  4. בצע טחינה דקה של תאים מובחנים לאט עם pipet פלסטיק 10 מ"ל עם קצה נגד התחתון של צינור חרוטי המכיל את התאים. בצע טחינה דקה במהירות איטית, מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים.

2. מעבר של תרבויות תחזוקה SH-SY5Y

  1. תרבויות תחזוקת פיצול כאשר התאים הגיעו 70-80% confluency, ואל תעלה על 10 עד 15 קטעים. תרבויות בדרך כלל צריכות להיות passaged כל 3-5 ימים (תרבויות בהנחה אינן מדוללות יותר פי 5 במהלך הפיצול).
  2. עד היום תאים קטע מתוך בקבוק T-75, לשאוב את התקשורת, ולאחר מכן לשטוף עם כ 10 מ"ל 1x PBS.
    הערה: איננו ממליצים לפצל את פו תרבויות תחזוקה SH-SY5Yrther מ -1: 5 במהלך passaging כיוון שהדבר עלול לגרום לתאים למות בשל confluency נמוכה.
  3. לשאוב PBS, ולאחר מכן להוסיף 2.5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA (1x).
  4. מדגירים דקות חממה 2-3 ולהטות בעדינות כדי לשחרר תאים מפני השטח של הבקבוק.
  5. הוסף 10 מיליליטר תקשורת צמיחת יסוד (ראה טבלה 2) ו triturate 1-2 פעמים.
  6. ספין למטה במשך 2 דקות XG ב 1000, תקשורת לשאוב, ואז resuspend גלולה ב 5 מיליליטר מדיה צמיחה בסיסית.
  7. לדלל תאים 1: 3 ל -1: 5 בנפח כולל של 20 מ"ל עבור ציפוי נורמלי בקבוק T-75, או לספור צלחת לבידול (סעיף 5).

3. תאים מקפיאים SH-SY5Y

  1. להקפיא קטעים מוקדמים של תאי נוירובלסטומה SH-SY5Y בתקשורת צמיחה בסיסית בתוספת 5% (v / v) DMSO.
  2. בתחילה, להקפיא aliquots ב -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.
    הערה: לצורך הפניה, ומחוברות (75-85%) בקבוק T-75 תניב חמש1 מ"ל aliquots של תאים SH-SY5Y להקפאה. כל אחד aliquots אלה יכילו מקום בין 2-5 מיליון תאים בסך הכל.

4. הפשרה והתרבות המובחנת SH-SY5Y תאי נוירובלסטומה

  1. כן תקשורת צמיחה בסיסית.
  2. במהירות להפשיר תאים קפואים בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס (כ 2 דקות).
  3. תאים Resuspend ב 9 מ"ל מדיה צמיחה בסיסי בתוך שפופרת חרוטי 15 מ"ל, ואז צנטריפוגות במשך 2 דקות ב 1000 x ז.
  4. לשאוב supernatant תוך הקפדה שלא להפריע את תאי pelleted, ותאי resuspend בעדינות 10 מיליליטר תקשורת צמיחה בסיסית.
  5. תאי פלייט על בקבוק T-25 או 60 מ"מ 2 צלחת.
  6. למחרת, להחליף תקשורת להסיר תאים מתים.

5. יום 0: תאי ציפוי לבידול

  1. ראה איור 1 עבור לוח זמני בידול.
  2. לשטוף תאים שלא עברו התמיינות עם 1x PBS, לשאוב, ולאחר מכן trypsinize באמצעות 1-2 מ"ל חימם1x 0.05% טריפסין- EDTA.
  3. כאשר התאים נמצא טריפסין, דגירה במשך כ 3 דקות באינקובטור.
  4. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 10 מ"ל התקשורת צמיחה בסיסי, יש לשטוף את הצדדים של הבקבוק או צלחת, בעדינות triturate 1-3 פעמים. העבר תוכן אל צינור חרוטי 15 מ"ל.
  5. צנטריפוגה במשך 2 דקות XG ב 1000, ואת לשאוב התקשורת תוך הקפדה שלא להפריע את הכדור.
  6. Resuspend גלולה ב 5 מיליליטר מדיה צמיחה בסיסית triturate 1-3 פעמים.
  7. ספירת תאים באמצעות hemocytometer, ואז לדלל באמצעות התקשורת צמיחה בסיסי מקסימלי של 50,000 תאים / מ"ל.
  8. פלייט 2 מ"ל של תאים לכל 35 מ"מ 2 צלחת עבור סכום כולל של 100,000 תאים לכל צלחת ומניחים בחזרה לתוך החממה.

6. יום 1: מדיה שינוי (# 1 מדיה בידול)

  1. Aliquot 50 מ"ל של בידול מדיה # 1 (ראה טבלה 2) דגירה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  2. כאשר התקשורת היא חיממה, ולאפשר לו לאזן באינקובטור (37מעלות צלזיוס, 5% CO 2) לפחות שעה אחת כדי ליצור איזון pH נאותה לפני השימוש.
  3. הוספת החומצה הרטינואית (ע"ר) (ראו טבלה 1) כדי חימם ומדיה equilibrated מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
    הערה: חומצה רטינואית אור רגיש צריך להיות מאוחסן בקבוקי בחושך ב 4 ° C
  4. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
  5. הוסף 2 מ"ל בידול מדיה # 1 עם RA לכל 35 מ"מ 2 צלחת ולחזור חממה.

7. יום 3: מדיה שינוי (# 1 מדיה בידול)

  1. סעיף 6 חזור (שלבים 1-5)

8. יום 5: מדיה שינוי (# 1 מדיה בידול)

  1. סעיף 6 חזור (שלבים 1-5)

9. יום 7: תאי פיצול 1: 1

  1. להוסיף RA כדי התחמם equilibrated בידול מדיה # 1 מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
  2. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
  3. הוסף 200 μl1x טריפסין EDTA 0.05% לכל צלחת 35 מ"מ 2 וחמים החממה חיממו כ 2-3 דקות או עד התאים הם הרימו בעליל מהצלחת כפי שנצפה תחת מיקרוסקופ.
  4. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 2 מדיה בידול מ"ל # 1 עם RA לכל 35 מ"מ 2 צלחת ו להשתמש בתקשורת כדי לשטוף הנותרים תאים עצביים מצלחת. ואז להעביר תכנים אל צינור חרוטי 50 מ"ל.
    הערה: במהלך trypsinization צעדים, לא trypsinize יותר מדי מנות בבת אחת. פעולה זו מסייעת להבטיח תרביות נוירונים אינם וטופחו טריפסין במשך זמן רב מדי, אשר יכול להיות ציטוטוקסיות.
  5. שלב תוכן ממרחק של עד 10 מנות בצינור חרוטי 50 מ"ל בעדינות triturate באיטיות מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים עם pipet פלסטיק 10 מ"ל.
  6. Aliquot ההשעיה תא 2 מ"ל לתוך מנות טריות 35 מ"מ 2 ולחזור חממה.

10. יום 8: מדיה שינוי (# 2 מדיה בידול)

  1. להוסיף RA (ראה טבלה 1) כדי התחממה equilibrated תקשורת מייד לפני הוספת תקשורת מנות.
  2. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
  3. לאט לאט להוסיף 2 מ"ל בידול מדיה # 2 (ראה טבלה 2) עם RA לכל צלחת 35 מ"מ 2 ולחזור חממה. אל תאפשר נוירונים להיות חשופים לאוויר במשך תקופה ארוכה של זמן כפי שהם יכולים להתייבש מהר.

11. יום 9: כן מטריקס (ECM) צלחות מצופות

  1. להפשיר בקבוקון אחד של פתרון ECM על קרח לדלל 1: 100 לתוך DMEM קר.
  2. לוותר על 2 מ"ל של התערובת לתוך כל מנה 35 מ"מ 2 ולהבטיח את הבסיס כולו של המנה מכוסה.
  3. מקום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור שעה 1 או לילה.
  4. תערובת לשאוב ולאפשר לאוויר יבש עבור כ 1 hr במנדף. אחסן בטמפרטורת החדר עד 2 חודשים.

12. יום 10: העברת תאים עלצלחות ECM מצופות 1: 1

  1. להוסיף RA (ראו טבלה 1) כדי חימם ומדיה equilibrated מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
  2. בעדינות לשאוב את התקשורת וזורקת.
  3. הוסף 200 μl חימם טריפסין על כל מנה 35 מ"מ 2 ולאפשר כדי לדגור בטמפרטורת החדר למשך כ 1-2 דקות או עד נוירונים הם הרימו בעליל מצלחת כפי שנצפה תחת מיקרוסקופ.
    הערה: Execute trypsinization שלב זה בטמפרטורת החדר כדי לא להפריז דגירה הנוירונים עם טריפסין ולגרום נזק. נוירונים לשחרר מצלחות הרבה יותר מהר מאשר תאים דמויי אפיתל בשלב זה.
  4. להרוות את טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל בידול מדיה # 2 לכל 35 מ"מ 2 צלחת ולהשתמש בתקשורת לשטוף הנותרים תאים עצביים מצלחת. ואז להעביר תכנים אל צינור חרוטי 50 מ"ל.
  5. שלב תוכן ממרחק של עד 10 מנות בצינור חרוטי 50 מ"ל בעדינות triturate באיטיות מעלה ומטה לא יותר מחמש פעמים עםpipet פלסטיק 10 מ"ל.
  6. לוותר על 2 מ"ל תרחיף תאים לתוך ECM מצופה 35 מ"מ 2 מנות ולחזור חממה.

13. יום 11: מדיה שינוי (מדיה בידול # 3)

  1. להוסיף RA (ראו טבלה 1) כדי חימם ומדיה equilibrated מיד לפני הוספת התקשורת מנות.
  2. בעדינות לשאוב את המדיה הישנה וזורקים.
  3. לאט לאט להוסיף 2 מ"ל בידול מדיה # 3 (ראה טבלה 2) עם RA לכל צלחת 35 מ"מ 2 ולחזור חממה. אל תאפשר נוירונים להיות חשופים לאוויר במשך תקופה ארוכה של זמן.

14. יום 14: מדיה שינוי (מדיה בידול # 3)

  1. מקטע חוזר 13 (שלבים 1-3)

15. יום 17: שינוי מדיה האחרון (בידול מדיה # 3)

  1. מקטע חוזר 13 (שלבים 1-3)

16. יום 18: תרבויות עצביות מוכנות להשתמש

  1. שינוי תקשורת כדי הגירסות טריותerentiation מדיה # 3 עם RA כל 3 ימים כדי לשמור על בריאות הנוירון.
    הערה: תאים צריכים להיות מובחנים לתוך הנוירונים ולהציג פנוטיפ עצבית. תרבויות הן בדרך כלל יציבה עד 14 יום לאחר בידול הטרמינל, אולם משך הכדאיות נוירון תלויה במספר המעבר של תאים שלא עברו התמיינות בתחילת בידול. מספרים מעבר גבוהים יותר מניבות נוירונים בדיל עם אורך חיים שימושי קצר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נכון לעכשיו, ישנם מקרים רבים בתחום נוירוביולוגיה neurovirology שבו תאים SH-SY5Y מובחן נמצאים בשימוש כמודל פונקציונלי עבור נוירונים האדם 27-36, וחשוב מכך, תאים שלא עברו התמיינות עשוי היעדר פנוטיפים כגון ספיגת ויראלי אופטימלי 2 כי הם הכרחי פרשנות מדויקת. זה קריטי, כי בעת שימוש תאים SH-SY5Y או כל סוג אחר במבחנה המערכת העצבית, תאים הם מובחנים כראוי לתוך הנוירונים, על מנת לקבל נתונים כי הוא הייצוג הטוב ביותר האפשרי של מה שעשוי להיות המתרחשים נוירונים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול לעיל מספק שיטה פשוטה לשחזור כדי ליצור תרביות נוירונים אדם הומוגנית ובת קיימא. פרוטוקול זה מנצל טכניקות ושיטות עבודה המשלבים מספר שיטות שפורסמו בעבר 1-4 ומטרתה להתוות את שיטות העבודה המומלצות של כל אחד. התמיינות של תאי SH-SY5Y מסתמכים על קיפוח בסרום הדרגתי; תוספת של חומצה רטינואית, גורמים neurotrophic וחלבונים מטריקס; פיצול סדר לבחור נוירונים חסידים בוגרת בדיל. שורת תאים יתחילו אוכלוסייה הטרוגנית של תאי חסיד מושעים. פרוטוקול זה נועד לשמר שתי האוכלוסיות באמצעות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו אסירי תודה על תרומתה של יולנדה טפורי באופטימיזציה של התנאים להתמיינות SH-SY5Y, ועל תמיכתה של ד"ר לין אנקוויסט, שבמעבדתה החלה עבודה זו. Y. Tafuri תרם את התמונות המוצגות באיור 3. עבודה זו נתמכה על ידי NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR), מרכז המשאבים הביואינפורמטיים (MLS ו-L. Enquist) ו-K22 AI095384 (MLS).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
B-27ThermoFisher Scientific17504-044ראה <חזק>טבלה 1 להכנת
גורם נוירוטרופי מוחי (BDNF)SigmaSRP3014 (10 μ g)/B3795 (5 μ ז)ראה <חזק>טבלה 1 להכנה
דיבוטיריל AMP מחזורי (db-cAMP)סיגמאD0627ראה <חזק>טבלה 1 להכנה
DMSOATCC4-X-Minimum
Essential Medium Eagle (EMEM)SigmaM5650-סרום
בקר עוברי (FBS) HycloneSH30071.03ראה <חזק>טבלה 1 להכנה
GlutamaxILife Technologies35050-061-Glutamine
HycloneSH30034.01-Potassium
Chloride (KCl)Fisher ScientificBP366-1ראה <חזק>טבלה 1 להכנת
תמיסת MaxGel Extracellular Matrix (ECM)SigmaE0282ראה שלב 11 של הפרוטוקול
NeurobasalLife Technologies21103-049-Penicillin
/Streptomycin (Pen/Strep)Life Technologies15140-122-חומצה
רטינואית (RA)SigmaR2625יש לאחסן בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות; C מכיוון שמגיב זה רגיש לאור
תאי SH-SY5YATCCCRL-2266-0.5
% טריפסין + EDTALife Technologies15400-054-Falcon
35 מ"מ צלחות TCפלקון (מותג קורנינג)353001-

מקורות

  1. Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
  2. Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
  3. Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
  4. Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
  5. Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
  8. Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
  9. Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
  10. Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
  11. Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
  12. Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174(2011).
  13. Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
  14. Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
  15. Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
  16. Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
  17. Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
  18. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
  19. Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
  20. Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
  21. Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
  22. La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
  23. Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826(2012).
  24. Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948(2013).
  25. Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
  26. Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
  27. Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290(2014).
  28. Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
  29. Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
  30. Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
  31. Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
  32. Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
  33. Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
  34. Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
  35. Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
  36. Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
  37. Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862(2013).
  38. Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
  39. Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

דיפרנציאציה של SH-SY5Yתרבית נוירונים אנושיתהרעבת סרוםחלבוני מטריקס חוץ-תאיפקטורים נוירוטרופייםTrypsin EDTAמצע דיפרנציאציהצלחונות מצופים ב-ECMדיפרנציאציה סופית
בידול של הקו הסלולרי SH-SY5Y האדם נוירובלסטומה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.