הומאוסטזיס סידן ברטיקולום אנדופלזמי מופרע בפתולוגיות מגוונות. ניתן להשתמש במדווח חלבון ניטור סידן מופרש (SERCaMP) כדי לזהות שיבושים במאגר הסידן של ER. פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב-Gaussia luciferase SERCaMP לבחינת הומאוסטזיס סידן ER במבחנה וב-vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Reticulum endoplasmic (ER) מכיל את הרמה הגבוהה ביותר של סידן תוך תאי, עם ריכוזים כ -5,000 פי יותר מרמות cytoplasmic. פיקוח הדוק על סידן ER הכרחי לקיפול חלבונים, שינוי וסחר. הפרעות לסידן ER יכולות לגרום להפעלה של תגובת החלבון מקופלת, מנגנון תגובת לחץ ER שלוש שיניים, ותורמות לפתוגנזה במגוון רחב של מחלות. היכולת לעקוב אחר שינויי סידן ER במהלך התפרצות מחלה והתקדמות חשובה בעיקרון, אך מאתגרת בפועל. שיטות זמינות כעת עבור סידן ER הניטור, כגון צבעי ניאון סידן תלוי וחלבונים, סיפקו תובנה דינמיקת סידן ER בתאים, אולם הכלים אלה אינם מתאימים ללימודים בvivo. המעבדה שלנו הוכיחה ששינוי לcarboxy-הסופית של לוציפראז Gaussia מקנה הפרשת הכתב בתגובה לדלדול סידן ER. השיטות לשימוש בלוציפראז מבוסס, חלבון ניטור סידן מופרש ER (SERCaMP) במבחנה וביישומי vivo מתוארות במסמך זה. וידאו זה מדגיש זריקות כבד, מניפולציה תרופתית של GLuc-SERCaMP, איסוף דם ועיבוד, ופרמטרי assay לניטור אורך של סידן ER.
מבוא
Reticulum endoplasmic (ER) פונקציות רבות יכולות סלולריות כוללים קיפול חלבונים, הפרשת חלבון, שומנים הומאוסטזיס, ואיתות תאית 1. מרכז לתפקוד נורמלי ER הוא שמירת ריכוזי סידן luminal ב ~ 5000 פעמים אלה שנמצאו בציטופלסמה 2-4. תהליך עתיר אנרגיה זה מוסדר על ידי ATPase סידן Sarco / reticulum endoplasmic (SERCA), משאבה שזז יוני סידן לחדר המיון. זרימה של סידן מחדר המיון מתווכת בעיקר על ידי ryanodine (RyR) וקולטני אדנוזין אינוזיטול (IP3R). בגלל תהליכי מיון רבים תלויים בסידן, לשבש את החנות יכולה להוביל ללחץ ER ומוות של תאי סופו של דבר.
ER חוסר ויסות ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. במבחנה Assay: זיהוי שחרור SERCaMP משורת תאי SH-SY5Y יציב
- טופל SH-SY5Y-GLuc-ASARTDL צלחת (SERCaMP) בתרבית רקמת צלחות ב150,000 תאים לכל 2 סנטימטר של שטח פנים. 96 צלחות גם, למשל, זרע 50,000 תאים לכל היטב (איור 1 א). לגדל תאי SH-SY5Y בDMEM סרום + 1x פניצילין / סטרפטומיצין (הגבוה של גלוקוז, Glutamax, פירובט) + צמיחת שור 10%.
- תאי מעבר עד 15 פעמים (איור 1). מספר מעבר גבוה לא נבדק.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שיטת GLuc-SERCaMP מאפשרת הערכה של הומאוסטזיס סידן ER על ידי דגימת נוזלים תאיים. ניתן לכלול מספר פקדים בעיצוב ניסיוני כדי לשפר את הפרשנות של תוצאות. ראשית, שימוש בכתב constitutively מופרש (למשל GLuc ללא ASARTDL C-המסוף או "GLuc-אין תג") יכול להיות מועסק על מנת להעריך את ההשפעות של טיפולים ניסיוניים על מסלול ההפרשה (הפרשה סלולרית העולמית) וביטוי transgene. לדוגמא, עלייה ברמות תאי של שתי GLuc-SERCaMP וGLuc-אין תג תיחשב תוצאה חד משמעית. לחלופין, עלייה בהפרשת GLuc-SE.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מדגיש במבחנה ובשירות vivo של GLuc-SERCaMP לפקח דלדול סידן ER. למרות שינוי החלבון כדי ליצור SERCaMP מופיע להכליל לחלבוני כתב אחרים 12, בחרנו בלוציפראז Gaussia לפליטת האור שלו חזק (200-1,000 הגדול יותר פי) בהשוואה לluciferases האחר 18. אנו מדגימים שחרור GLuc-SERCaMP זיהוי מושרה thapsigargin על פני מגוון מינון של פי 100 של וירוס GLuc-SERCaMP נמסר לנוירונים עכברוש עיקרי בקליפת המוח, תאי SH-SY5Y, וכבד חולדה (איורים 3 ו -4).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר הפנימי במכון הלאומי לשימוש בסמים. אנו מודים לדאג הווארד, כריס ריצ'י, לוולה פורטונו וג'וש הינקל על תרומתם לפיתוח שיטה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שפופרות 1.5 מ"ל | פישר | 02-682-550 | |
| פתרון 10% NP-40 | פירס | 28324 | לבדיקות GLuc תוך-תאיות |
| 1 מ"ל מזרקי לואר-לוק | פישר | 14-823-30 | |
| קצות סינון 200 מיקרוליטר | Rainin | RT-L200F | |
| 3-0 תפרים כירורגיים | פישר | NC9598192 | |
| 30 גרם מחטים | פישר סיינטיפיק | 14-821-13A | |
| יריעות איטום מיקרופלייט דביקות | תרמו | AB-0558 | |
| רפידות הכנה לאלכוהול | פישר | 22-246-073 | |
| הרדמה מערכת זרימה אוטומטית | EZ הרדמה | EZ-AF9000 | |
| תא התאוששות בעלי חיים | ליון וטרינר | ICU-912-004 | |
| B27 תוסף | חיים טכנולוגיות | 17504-044 | |
| תמיסת בטדין | Fisher | NC9386574 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| סרום גידול בקר | Thermo | SH30541.03 | |
| Coelenterazine, Native | Regis Technologies | 1-361204-200 | |
| אפליקטורים עם קצה כותנה | Puritan | 806-WC | |
| מחטי חיתוך 3/8 תפרים מעגליים | WPI | 501803 | |
| מנקה אולטראסקוני דיגיטלי | פישר סיינטיפיק | FS60D | |
| DMEM גלוקוז גבוה, GlutaMAX, פירובט | Life Technologies | 10569-010 | |
| סולם מסת DNA | Life Technologies | 10496-016 | |
| Gaussia luciferase (חלבון רקומביננטי) | Nanolight | 321-100 | |
| נוגדן Gaussia luciferase (עבור WB, ICC או IHC) | ניו אינגלנד ביולאבס | E8023S | 1:2,000 (WB) |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | DS-401 | |
| לוחות בדיקת גלוק (96 באר, אטום) | פישר | 07-200-589 | |
| תמיסת המלח המאוזנת של האנק | Life Technologies | 14175-095 | |
| הפרין | Allmedtech | 63323-276-02 | |
| איזופלורן | באטלר שיין | 29404 | |
| קטמין | הנרי שיין | 995-2949 | |
| קוויק סטופ אבקת סטיפטיק | באטלר שיין | 5867 | |
| L-גלוטמין | סיגמא | G8540 | |
| מתנול | פישר | a452-4 | |
| מיקרופוגה 22R צנטריפוגה | בקמן קולטר | 368831 | |
| נאוספורין | פישר | 19-898-143 | |
| טכנולוגיות חיים | בינוניות נוירובזאליות | 21103049 | |
| Nikon סטריאוסקופ | ניקון | SMZ745T | |
| ג'ל נוקלאוספין וניקוי PCR | Machery-Nagel | 740609 | |
| P200 פיפט | Rainin | L-200XLS+ | |
| p24 ערכת טיטר מהירה Lenti-X | Clontech | 632200 | |
| PCR חותם סרט | פישר | AB0558 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Life Technologies | 15140-122 | |
| קוקטייל מעכב פרוטאז | סיגמא | P8340 | |
| מיכל מסנן פחם ReFresh | EZ הרדמה | EZ-258 | |
| להבי אזמל, #10 | Fine Science Tools Inc | 10010-00 | |
| SD חולדות 150-200 גרם | נהר צ'ארלס | חולדות | שהוזמנו ב-150-200 גרם. ניתוח 5 ימים לאחר ההגעה |
| תגי אוזניים של בעלי חיים קטנים | Band and Tag co | 1005-1 | |
| וילונות כירורגיים סטריליים | Braintree Scientific | SP-MPS | |
| Synergy 2 קורא צלחות | BioTek | n/a | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | מזיק ל בריאות האדם |
| Virapower lentiviral אריזות תערובת Life | Technologies | K4975-00 | |
| מגיב Xfect Transfection | Clontech | 631318 | |
| קסילזין | ואלי וטרינר | 468RX |
מקורות
- Sitia, R., Braakman, I. Quality control in the endoplasmic reticulum protein factory. Nature. 426 (6968), 891-894 (2003).
- Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
