הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

9.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53202

⸱

30 בספטמבר 2015

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Biomedical Center, Uppsala University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

תקציר

הרשתית היא מודל טוב למערכת העצבים המרכזית בפיתוח. הגודל הגדול של העין והכי חשוב הנגישות למניפולציות ניסוייות באובו / in vivo הופך את הרשתית העוברית עוף מודל ניסיוני רב-תכליתי ויעיל מאוד. למרות רשתית העוף קלה למקד באוב על ידי זריקות או electroporation התוך עיני, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים בתוך הרשתית עלול להיות קשה לשליטה מלאה. זה יכול להיות בגלל וריאציות של האתר המדויק הזרקה, דליפה מהעין או דיפוזיה אחידה של החומרים. יתר על כן, בתדירות של מומים ותמותה לאחר מניפולציות פולשנית כגון electroporation היא גבוהה למדי.

פרוטוקול זה מתאר לשעבר אובו הטכניקה לculturing explants רשתית שלם מעוברי עוף ומספק שיטה לחשיפה מבוקרת של הרשתית לחומרים כימיים. פרוטוcol מתאר כיצד לנתח, ניסוי לתפעל, וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. Explants יכול להיות מתורבת לכ 24 שעות ויהיה נתון למניפולציות שונות כגון electroporation. היתרונות העיקריים הם כי הניסוי אינו תלוי בהישרדות של העובר וכי הריכוז של המגיב הציג יכול להיות מגוון ומבוקר על מנת לקבוע ולייעל את הריכוז האפקטיבי. יתר על כן, הטכניקה היא מהירה, זולה ויחד עם השיעור הגבוה הניסיוני שלה להצלחה, הוא מבטיח לשחזור תוצאות. יודגש כי היא משמשת כמצוינת כדי להשלים את הניסויים שבוצעו באוב.

מבוא

הרשתית היא חלק ממערכת העצבים המרכזית ואת זה הוא, בפשטותה היחסית ואדריכלות סלולרית מאופיינת היטב, דגם פופולרי לחקר התפתחות מערכת עצבים מרכזית. עינו של עובר העוף היא יחסית גדולות בהשוואה לשאר העובר. לכן נגיש בקלות באובו למניפולציות ניסיוניות, כגון זריקות או electroporation, ומשמש ככלי מצוין לצבור ידע על תאים ברשתית וביולוגיה התפתחותית בvivo. למרות יתרונות הגדולים אלה, הישרדות של העוברים יכולה להיות נמוכה כאשר ניסויים פולשניים כגון עם electroporations, זריקות חוזרות ונשנות, או מניפולציות ניסיוניות משולבות.

Electroporation של פלסמידים DNA לעובר העוף באובו הוא טכניקה חשובה ומבוססת 1. היא מאפשרת תיוג של תאי עצב, התחקות של גורל תא, כמו גם שטחים עצביים בnerv המרכזימערכת היחידות הארגוניות והיא מאפשרת לביטוי גנים מחוץ לרחם לנתח תפקוד חלבון in vivo. הטכניקה נוצלה בעבר ללימודים של צינור עצבי 2, המוח האחורי 3, ורשתית 4. יש Electroporation של רשתית עוברית באוב כמה קשיים ניסיוניים הקשורים למצב in vivo. העמדה של העין, בשל קיפול הגולגולת של העובר, קרובה יחסית ללב. קרבה זו מגדילה את הסיכון של דום לב לאחר electroporation, והסיכון עולה עם גיל העובר. יתר על כן, כדי לגשת לעין, יש צורך לפתוח את הקרומים העובריים, ובכך להגדיל את הסיכון לדימום, מומים וכדאיות מופחתים שלאחר מכן. כאשר בודקים ואופטימיזציה פלסמיד דנ"א חדש לעתים קרובות ללא תוצאה פנוטיפי ידועה, מגבלות אלה עשויות להקטין את היעילות וכוחה של השיטה אפילו בניסויים מנוסים. כפי שהוצג בפרוטוקול זה, התרבות של wexplant החור ברשתית, שהוגדר כרשתית עצבית השלמה עם אפיתל הפיגמנט הוסר, הוא שיטה יעילה המשלימה בגישת אוב.

זריקות תוך עיניות של ריאגנטים כימיים קלות יחסית לביצוע באוב. עם זאת, הריכוז היעיל ומדויק של חומרים כימיים שהוחדרו בתוך הרשתית העצבית עלול להיות קשה לשלוט באופן מלא. הנפח המוזרק עשוי להשתנות עקב דליפה ואתר הזרקה המדויק עשוי להשפיע הן על חלוקת מגיב בתוך העין ודיפוזיה דרך הגוף הזגוגי. ההשתנות תהיה השלכות משמעותיות על הפרשנות של התוצאות כאשר כלומר, עקומת תגובה למינון מעכב אנזים נקבעה; במיוחד אם ההשפעה היא קטנה והחלון הזמני של ההשפעה הוא צר. יתר על כן, רק עין אחת יכולה לשמש מכל עובר בעת ביצוע ניסויים באובו בשל השפעות מערכתיות פוטנציאליות דרך זרם הדםעל העין הנגדית. התאמת גיל היא חשובה כאשר לומדים פיתוח והשתנות בודדות בין מטופלים ועוברים בקרה עשויה להוביל לשונות ניסיוניות נוספות.

מסיבות אלה, לשעבר אוב שיטה המבוססת על explants רשתית מעוברי עוף פותח, שברשתית העצבית יכולה להיות חשופה למדים ובשליטת תנאי ניסוי במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי פותח על בסיס פרוטוקולים קודמים 5-9. explants רשתית מבמה (רח ') 20 (ימים עובריים [E] 3) לst31 (E7) עוברי עופות נותחו, תרבותי וelectroporated עם ריכוז פלסמיד דנ"א מוגדר או שנחשפו למדיום המכיל ריכוז מוגדר של מגיב כימי. הפרוטוקול המובא כאן כבר מיושם בהצלחה בפרסומים האחרונים, באמצעות כמה ריאגנטים כימיים שונים, כולל רגולטורים של מסלול הנזק לדנ"א, כגון KU55933, SB 218,078, ומועצה לביטחון לאומי 109,555 דיטוsylate, ומחזור התא, כגון Cdk1 / 2 מעכב שלישי 10,11.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה מתבצע בהתאם להמלצות ב" המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה של האגודה למחקר ברפואת עיניים וראייה ".

1. טיפול בביצה וגביית עיניים

  1. אחסן ביצי ליבורנו הלבנות ב12-14 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע 1. אם זמין, להשתמש במקרר יין קירור לאחסון הביצים המופרות.
    הערה: טמפרטורות גבוהות חנות להוביל להתפתחות לא תקינה של עוברים, ואילו טמפרטורות נמוכות מגבירה תמותה. זמן אחסון מורחב מגדיל שני תמותה והתפתחות לא תקינה.
  2. לדגור על הביצים ב37.5 מעלות צלזיוס ו -60% חממת ביצת humidified עם הנדנדה עדינה בתדירות של 5 פעמים בשעה 24.
  3. הסר את הביצים מודגרות מן חממת הביצה בגיל העוברי הרצוי.
    הערה: גיל העובר העוף נקבע כזמן של דגירה והוא כונה כימים עובריים (E) או כשלבים (רח '), על פי הסדרה של שלבי התפתחות שתוארו על ידי המבורגר והמילטון 12.
  4. מניחים את הביצים שנבחרו בזרימה למינרית. נגב את קליפת הביצה עם 70% אתנול, כדי למנוע זיהום של העובר.
    הערה: ניהול כל ההליכים בתנאים אספטיים עם פתרונות סטרילי https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions ומכשירים.
  5. הקש בצד של הביצה בתקיפות כנגד משטח קשה לפיצוח פתוח הביצה. הנח את התוכן בצלחת פטרי 100 מ"מ. השתמש בכפית קטנה להעביר את העובר לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה מראש חימם (37 ° C) 1x PBS כדי למנוע את הרקמות מייבוש.
  6. מניחים את 35 מ"מ צלחת פטרי המכילה את הרקמה העוברית על מיקרוסקופ לנתח stereovision משקפת בזרימה למינרית. לערוף את העובר על ידי צובט את הצוואר עם מלקחיים עדינים וזורקים את הגוף.
  7. שימוש במלקחיים בסדר לעשות חתך המחוספס הפה, הגחון לעין. החל באתר של חתך, קורע את הרקמות המקיפות את כל העין. לצבוט את עצב הראייה ולהסיר את העיניים בשלמות מארובת העין. לאסוף צד השמאל ועין ימין מאותו העובר לשימוש כמו גם השליטה או עין שטופלה.
  8. השתמש בכפית קטנה להעביר את העיניים לצלחת חדשה 35 מ"מ פטרי המכילה מראש חימם (37 ° C) 1x PBS.

2. הכנת Explants הרשתית השלמה

  1. שימוש במלקחיים עדינים כדי להסיר את כל הרקמה סביב העין כולל Anlage scleral.
    הערה: רקמת תנתק בקלות עוזבת את הרשתית על הגוף ועדשת הזגוגית עם אפיתל הפיגמנט (1A-B איור) ללא פגע.
  2. שימוש במלקחיים עדינים לצבוט חתך קטן לאפיתל הפיגמנט בחלק הגב של העין ללא פגיעה ברשתית העצבית (איור 1 ג).
  3. שימוש במלקחי קנס לקרוע בעדינות לפתוח את starti אפיתל הפיגמנטng באתר של חתך, ומשאירה את העדשה ואת כל הרשתית מחוברת לגוף הזגוגי (1D איור). שמור את העין בחם (37 מעלות צלזיוס) 1x PBS כדי להקל על הסרת האפיתל פיגמנט.
    הערה: אפיתל הפיגמנט עלול להיות קשה להסרת, בפרט לאורך גוף הריסים סביב התלמיד, באזור הקדמי של העין, ולאורך הבקע דמית העין. לכן, חלק מאפיתל הפיגמנט ניתן להשאיר על הרשתית העצבית (איור 1E-F).

3. טיפול בExplants הרשתית השלמה

  1. Electroporation של explants רשתית השלם
    הערה: Electroporation של explants רשתית השלם יכול להתבצע מייד לאחר שלב 2.
    1. להכין מדיום תרבות המכיל 1: 1 DMEM: תערובת מזון F12, 10% FBS, 10 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, וL- גלוטמין 2 מ"מ.
    2. חותך את קובט פלסטיק חד פעמי של 1.5 מיליליטר (מ"מ 12.5 מ"מ x 12.5 x 45 מ 'מ ') (או כל מיכל קטן מסוגל להחזיק פתרון 300-400 μl) כ 8 מ"מ מהתחתית בעזרת מסור בסדר להב.
    3. לדלל את פלסמיד דנ"א של בחירה ב1xDPBS לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם / μl.
    4. הפעילו את הפרמטרים electroporator וסט 15 V לST20 - ST25 רשתית (E3-E4) ו -20 V לst26 - st27 רשתית (E5). הגדר את הדופק חוזר ל5 פולסים של 50 דופק באורך msec עם 1 מרווחי שניות. השתמש במחולל פעימות שיכולות להיות נשלט על ידי רגל דוושה על הרצפה כתהיינה צורך בשתי הידיים כדי להחזיק את האלקטרודות במקום.
    5. חבר (קוטר שטוח, עגול. 4 מ"מ) שתי ההנעה בצורת אלקטרודות פלטינה (איור 2 א) לשקע הפלט על מחולל את הדופק.
      הערה: אלקטרודות הפלטינה שימוש בפרוטוקול זה נעשו על ידי סדנת האוניברסיטה. אלקטרודות נעשו מ" rondelles "(כיתה פלטינה: 950 Pt / 5 Cu) צלחת פלטינה 0.1 מ"מ. Wi חיבור 0.8 מ"ממחדש היה מבודד באמצעות צינורות פלסטיק.
    6. להעביר בזהירות את כל explant הרשתית מצעד 2.3 לקובט (או מיכל קטן שווה ערך) בעזרת פיפטה פסטר פוליאתילן עם הקצה מנותק לרכוש את גודל טיפ-פתיחה הנכונה עבור explant הרשתית. הימנע משימוש בטיפי פיפטה כמו הרשתית נוטה לצרף לפלסטיק ולקרוע לגזרים.
    7. השתמש פיפטה 100 μl כדי להסיר בעדינות את כל 1x PBS המקיף את טיפול explant לוקח רשתית שלא לגעת ברשתית כדי למנוע את הקריעה.
    8. להוסיף פתרון פלסמיד 100 μl לקובט כדי לכסות את כל explant הרשתית. דחף בעדינות את explant הרשתית עם מלקחיים אם זה צף למעלה. שימוש במלקחיים או אלקטרודות למצב העדשה להתמודד עם כל צד אחד של קובט ועצב הראייה לחלק התחתון של קובט.
    9. מניחים את האלקטרודה החיובית מול העדשה והאלקטרודה השלילית מאחורי הרשתית (איור 2 א), בלי לגעת ברקמה.
    10. החל הנוכחי על ידי לחיצה הרגל על ​​הדוושה. בדקו בועות באלקטרודות המצביעות על שחרור מוצלח.
    11. השתמש פיפטה 100 μl כדי להסיר את כל תערובת פלסמיד מקובט ללא פגיעה ברשתית. תערובת פלסמיד ניתן לעשות שימוש חוזר שלושה עד חמש פעמים.
    12. למלא את קובט עם מחומם מראש (37 ° C) 1x PBS. שימוש במלקחיים כדי לנתק עדינות explant הרשתית מהקיר של קובט. לאחר electroporation הרשתית לעתים מכוסות בבועות, מה שהופך את לדבוק בקיר של קובט.
    13. השתמש בפיפטה פסטר פוליאתילן להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24-המכילה גם (37 מעלות צלזיוס) מדיום תרבות 1 מיליליטר מחומם מראש לכל טוב. דגירה explant רשתית אחד בכל טוב.
    14. דגירה explant הרשתית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל"ד, בתוך תא חממה עם 5% CO 2 למשך 24 שעות. הסיבוב הוא להבטיח חשיפה המרבית לבינונית ולpreveהידבקות NT של הרשתית לחלק התחתון של צלחת 24 גם.
    15. המשך לשלב 4.
  2. טיפול בexplants רשתית השלם עם ריאגנטים כימיים
    הערה: טיפול הכימי של explants רשתית השלם יכול להתבצע מייד לאחר שלב 2.
    1. להכין מדיום תרבות המכיל 1: 1 DMEM: תערובת מזון F12, 10% FBS, 10 U / ml פניצילין סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, וL- גלוטמין 2 מ"מ.
    2. השתמש בכפית קטנה להעביר explant הרשתית מצעד 2.3 לתוך צלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר מראש חימם בינונית (37 מעלות צלזיוס) תרבות לכל טוב. דגירה explant רשתית אחד בכל טוב.
    3. דגירה explant רשתית כל במשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל"ד, בתוך תא חממה עם 5% CO 2 לפני הוספת מגיב כימי או רכב.
    4. הכן את הפתרון הכימי, למשל Cdk1 / 2 מעכב III, מעכב התקדמות M-שלב 13, בגמרריכוז של 30 מיקרומטר בDMSO.
    5. הסר את צלחת 24 גם, המכיל את כל explant הרשתית, מן חממת התא. הוסף 10 μl של המגיב הכימי או הרכב (DMSO) ישירות למדיום הרשתית, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 300 ננומטר Cdk1 / 2 מעכב שלישי ב0.01% DMSO. באופן ידני לסובב את צלחת 24 גם כדי לאפשר חלוקה שווה של המגיב הכימי או רכב בפתרון.
    6. דגירה explants הרשתית על 37 מעלות צלזיוס על שייקר הכתף, עם מהירות קבועה של 50 סל"ד, בתוך חממה עם 5% CO 2 לזמן הרצוי (עד 24 שעות).
    7. המשך לשלב 4.

4. קיבוע והקפאה של כל הפריטים הרשתית Eexplants

  1. הסר את צלחת 24 היטב המכילה את explant רשתית כל מטופלים מן חממת התא.
  2. השתמש בכפית קטנה להעביר explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם קר כקרח paraformaldehyde 4% ב1xPBS. אינקובטוריםטה על קרח במשך 15 דקות.
  3. השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם 1xPBS הקרח הקר לשטוף את הרשתית. דגירה על קרח למשך 10 דקות.
  4. השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית לצלחת 24 גם המכילה 1 מיליליטר / גם סוכרוז 30% קרים כקרח ב1xPBS. לדגור על קרח במשך 1-3 שעות, בהתאם ליום העוברי של הרשתית. לST20 - ST25 רשתית (E3), דגירה עבור שעה 1, רשתית מבוגרת זקוק לזמן דגירה ארוך יותר בסוכרוז.
  5. השתמש בכפית קטנה להעביר את כל explant הרשתית על סרט פרפין המכיל הרכבה בינונית כ -500 הקפאת cryostat μl. הסר ככל סוכרוז ככל האפשר על ידי בעדינות להזיז את explant הרשתית במדיום ההקפאה באמצעות הכפית הקטנה.
  6. העבר את explant הרשתית לעובש הטבעה מכיל מדיום הקפאה. מקם את העיניים כדי להקל על חתך בעתיד. שים עובש ההטבעה מכיל את כל explant הרשתית על ד"רקרח y עד הבינוני קפוא מוצק. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה (איור 1 א-ו) וculturing של explants רשתית השלם מעוברי תרנגולת. פרוטוקול זה שמש בהצלחה לכל explants רשתית מעוברים של ST20 (E3) לst31 (E7).

Electroporation של פלסמידים DNA לתוך explants רשתית שלם מאפשר תיוג ומעקב של תאים ברשתית או ביטוי יתר של גן מוצרים שונים. לניסויי electroporation, אפיתל הפיגמנט הוסר בזהירות מעין enucleated של ST25 עובר (E4 ½). Explant הרשתית השלם היה א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעבודה זו בפרוטוקול מפורט לנתיחה, electroporation או טיפול כימי, וculturing של explants רשתית השלם מעוברי עוף מוצג. פרוטוקול זה הוא קל, מהיר ומאפשר לשניהם שיעור הצלחה גבוה ושחזור תוצאות.

Electroporation של explants רשתית השלם מייצר שטחים גדולים של תאים המבטאים את מבנה הגן של עניין. זה קל למצב בצורה נכונה את האלקטרודות ולחשוף חלק מסוים של הרשתית לריכוז פלסמיד דנ"א מוגדר. גישה זו מאפשרת לשיט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

העבודה נתמכה על ידי Barncancerfonden (PR2013-0104), מועצת המחקר השוודית (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond ו-St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1xPBS (טאבלט)טכנולוגיות חיים18912-014
10x DPBSטכנולוגיות חיים14080-048
צלחת פטרי 100 מ"מVWR734-0006
100 μ l קצות פיפטהVWR613-0798
1.5 מ"ל קוביית פלסטיק חד פעמיתתומאס סיינטיפיק8495V01
צלחת 24 בארותסיגמא אולדריץ'D7039
צלחת פטרי 35 מ"מVWR391-1998
70% אתנולSolveco1054
Cdk1/2 מעכב III217714Calbiochem300 ננומטר ב 0.01%
חממת תרבית תאיםמיקרוסקופ חיתוך תרמו פורמה
Leica
DMEMLife Technologies41966-029
אלקטרודותפלטינה, בהתאמה אישית
אלקטרו מרובע פורטור ECM 830מכשיר
F12 תערובת חומרים מזיניםטכנולוגיותחיים31331-028
FBSLife Technologies16140-071
מלקחייםAgnThos0108-5-PS
מדיום הקפאה NEG50Cellab, שוודיה6502
GFP מבטא DNA פלסמיד (pZGs)
חממה לחהGrumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, גרמניה8204
אינסוליןSigma AldrichI9278-5ML
L-glutamineLife Technologies25030024
הרכבה בינונית ProLong Gold עם DAPILife TechnologiesP36935
סרט פרפיןVWR291-1214P
ParaformaldehydeSigma Aldrich16005-1KG-R
עובש הטבעה Peel-A-Way סיגמא אולדריץ'E6032
פניצילין סטרפטומיציןLife Technologies15140-122
פוספוהיסטון 3 (PH3) Millipore06-570דילול 1/4,000
אלקטרודות פלטינה (עשויות בהתאמה אישית מ"רונדלים")סרג'נטה390-R (רונדלר)קוטר: 4 מ"מ, עובי 0.1 מ"מ
אלקטרודות פלטמון סונידלCUY700P4Lקוטר: 4 מ"מ
פיפטה מפוליאתילן פסטורVWR612-2853
שייקר מסובבVWR444-2900
כף קטנהVWR231-2151
סוכרוזVWR443815S
ביציספק מקומי
מקרר ייןWineMaster 24, Caso , ברלין גרמניה
DMSO הרווארד לגהורן לבנות

מקורות

  1. Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).
  2. Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Method. 24, 43-48 (2001).
  3. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain. J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).
  4. Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. J Vis Exp. , (2012).
  5. Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina. Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).
  6. Tomita, K., et al. Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis. Neuro. 16, 723-734 (1996).
  7. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).
  8. Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).
  9. Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors. Exp eye re. 93, 556-564 (2011).
  10. Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway. Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).
  11. Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest. Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).
  12. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
  13. Gavet, O., Pines, J. Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis. J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).
  14. Sauer, F. Mitosis in the neural tube. J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).
  15. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNAEx Ovo
Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.