באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

סיכום

השיטות המוצגות מספקות הוראות שלב אחר שלב לביצוע אוסף של בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרו-צלחת באמצעות מיטוכונדריה מבודדת מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר. מבחנים אלה מסוגלים למדוד שינויים/התאמות מכניסטיות בצריכת החמצן המיטוכונדריאלית במודל נפוץ של בעלי חיים.

תקציר

מיטוכונדריה של שרירי השלד ממלאים תפקיד ספציפי בפתולוגיות מחלות רבות. ככזה, מדידת צריכת החמצן כאינדיקטור לתפקוד המיטוכונדריה ברקמה זו הפכה נפוצה יותר. למרות שקיימות טכנולוגיות ומבחנים רבים המודדים מסלולי נשימה מיטוכונדריאלים במגוון תאים, רקמות ומינים, קיים כיום חלל בספרות בנוגע לאיסוף בדיקות אלה באמצעות מיטוכונדריה מבודדת משריר השלד של עכבר לשימוש בטכנולוגיות מבוססות מיקרו-פלטות. חשוב לציין, השימוש במבחנים ספירומטריים מבוססי מיקרו-צלחת הולך וגדל בקרב ביולוגים מיטוכונדריאלים מכיוון שהוא מאפשר מדידות תפוקה גבוהות תוך שימוש בכמויות מינימליות של מיטוכונדריה מבודדת. לכן, פותח אוסף של בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרו-פלטות המסוגלות להעריך שינויים/התאמות מכניסטיות בצריכת חמצן במודל בעלי חיים נפוץ. השיטות המוצגות כאן מספקות הוראות שלב אחר שלב לביצוע בדיקות אלו עם כמות אופטימלית של חלבון מיטוכונדריאלי וריאגנטים, ודיוק גבוה כפי שמעידה השונות המינימלית על פני הטווח הדינמי של כל בדיקה.

מבוא

התפקיד הפיזיולוגי העיקרי של המיטוכונדריה שרירי שלד הוא לייצר ATP מזרחון חמצוני ^1. חשוב לציין, מיטוכונדריה שריר השלד לשחק תפקיד ספציפי בתרגיל קיבולת ^{2, 3} הזדקנות, מחלה ניוונית ⁴ וסוכרת סוג II ^5. כחברה מזדקנת, ולהיות הגורם המוביל ^-7 של מוות בארצות הברית ⁶ סוכרת סוג II, את הצורך בשיטות שלהעריך את התפקוד המיטוכונדריה הפך יותר ויותר נפוץ יותר במחקר ביו ^7,8. באופן ספציפי, המדידה של צריכת חמצן יש שירות יוצא דופן בהערכה של תפקוד המיטוכונדריה שכן הוא מייצג את הפונקציה מתואמת בין הגנום המיטוכונדריאלי והגרעיני להביע רכיבים פונקציונליים של חמצוני זירחון ^9.

מספר טכנולוגיות הקיימות לאפשר המדידה של צריכת חמצן בתאים שלמים ולבודדמיטוכונדריה ד ^7-10. בנוסף, מבחני פותחו עבור סוגי תאים רבים ורקמות, ובמגוון רחב של מינים המאפשרים המדידה של מסלולי המיטוכונדריה ושליטה בדרכי הנשימה ^9,11,12. עם זאת, אין כיום חלל בספרות בנוגע לאוסף של כל מבחני אלה באמצעות המיטוכונדריה מבודדת משרירי שלד עכבר לשימוש בטכנולוגיות צריכת חמצן microplate מבוססים. חשוב לציין, שימוש במבחני respirometric microplate מבוסס גדל בקרב הביולוגים המיטוכונדריה ומאפשר למדידות תפוקה גבוהות באמצעות כמויות מזעריות של מיטוכונדריה המבודדת ^9. לכן, אוסף של מבחני respirometric microplate מבוסס פותחו המאפשר איתור של חריגות שבו ו / או התאמות עשויות להיות מתרחשות בשרשרת הובלת אלקטרונים (וכו '). בנוסף, שני מבחני respirometric מבוססים microplate נוסף פותחו המאפשרות ההערכה של התיאום between חומצת מחזור tricarboxylic (TCA) והכד ', ובין SS-חמצון ווכו' חשוב לציין, השיטות שהוצגו מספקות דרך ברורה ותמציתית כדי למדוד שינויי מכניסטית במיטוכונדריה במודל חיה נפוץ.

פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה מתחיל אחרי אחד מבודד המיטוכונדריה משרירי שלד אדומים. המיטוכונדריה היו מבודדת כפי שתוארה לעיל מ~ 75-100 מ"ג של שרירי שלד אדומים ^13. בין 5 - 10 מיקרוגרם / μl של חלבון המיטוכונדריה יושג מסכום זה של רקמה על ידי resuspending גלולה הסופי המיטוכונדריה ב≤50 μl של חיץ בידוד למיטוכונדריה (IBM) 2 (ראה Frisard et al ^13).

1. התקנה

1. הכן עבודה פתרונות מניות (טבלה 1) ותערובות של פתרון assay המיטוכונדריה (MAS) (טבלה 2) למבחנים הבאים.
   הערה: רוב ההכנה למבחנים ניתן לעשות מראש כפי שניתן לאחסן הפתרונות וMAS המניות ביותר.
2. מימה מחסנית assay respirometric בפתרון כיול 1 מיליליטר בלילה שלפני הניסוי בחממה אינו CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס.
3. היום של הניסוי, לאאיית את מניות קפוא (מצעים ומאפנני המיטוכונדריה, תערובת MAS, MAS w / o BSA, טבלת 1) והפשרה באמבט 37 ° C או חממה.
4. הכן את כל פתרונות המצע (לוח 3) וזריקות (טבלה 4-5) ולהתאים את ה- pH כרצוי (pH 7.4). לאחר pH מותאם, לאחסן על קרח.
5. תכנית המכונה מדידה רב גם צריכת חמצן לתמהיל נכון, לחכות, ופרמטרי מדד (ראה לוח 6) ורקע תווית ובארות קבוצה / מצב על-ידי הזנת תוכנת הניתוח, ואחריו את המצב "רגיל" ראשון.
   1. היכנס לפורום "האורח" ולחצו על "Assay האשף". פעם אחת ב" Assay האשף ", לחץ על" פרוטוקול "לשינוי בתמהיל, לחכות, ולמדוד פרמטרים. תווית בארות הרקע תחת "חזרה. תיקון "כרטיסייה והקפד להדגיש" האם תיקון שרקע ".
   2. מנצח תוויתitions על ידי הלחיצה ראשונה על כרטיסיית "קבוצות ותוויות", ואחריו בכרטיסייה "קבוצת מידע". לאחר פרמטרים אלה נכנסו, לחצו על "סיום", ואחריו "שמירת תבנית".

2. Assay הפעלה

1. טען את פתרונות ההזרקה לתוך מחסנית טווח assay ולהתחיל את הכיול על ידי הזנת תוכנת הניתוח, ואחריו נכנס למצב "רגיל" ראשון. היכנס לפורום "האורח". פתח את התבנית נשמרת בשלב 1.5 בכונן "XF", תחת לשונית "תבניות". ברגע פתוח, לחץ על "התחל" כדי להתחיל כיול.
   הערה: מחסנית טווח assay חייבת להיות נכנסה לתוך המכונה עם הפינה הקטומה לפינה השמאלית התחתון. זה לוקח בערך 30 דקות. דואג להזרים פתרונות ליציאות התקינים. זריקות בטבלה 4-5 מפורטות בצו של טעינה.
2. בעדינות, אבל לערבב ביסודיות mitochondריה מניות על ידי ערבוב הפתרון עם קצה פיפטה 200 μl, ואחריו בעדינות triturating המניה עם קצה פיפטה 200 μl שיש לו פתח שלה התרחב על ידי חיתוך ~ 3 מ"מ מקצה לקצה עם מספריים.
3. בצע assay חומצת bicinchoninic (BCA) כדי לקבוע את ריכוז החלבון של המניה במיטוכונדריה.
4. שימוש במניות הריכוז נרכש מצעד 2.3, resuspend 10 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה / 200 μl של תמהיל מצע succinate / rotenone (לוח 3). Resuspend 14 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה / 200 μl של תערובות מצע שנותרו (זה חייב להיעשות עבור כל תערובת מצע) (לוח 3). מניחים את כל החלבון / מצע המיטוכונדריה מערבב על קרח.
   הערה: הכמות האופטימלית של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב לכל assay נקבעה כפי שתוארה קודם לכן ^9. נקבע כי פירובט / Malate, קרניטין palmitoyl / Malate, גלוטמט / Malateזרימת אלקטרונים מבחני ד מנצל 3.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה, בעוד assay succinate / rotenone מנצל 2.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב. לכן, החוקר צריך resuspend חלבון המיטוכונדריה מספיק ל -4 משכפל בשלב זה שכן או 2.5 מיקרוגרם או 3.5 מיקרוגרם לכל 50 μl נטען בכל טוב (ראה שלב 2.6).
5. מערבבים את פתרונות המיטוכונדריה / מצע בעדינות, אך ביסודיות על ידי ערבוב הפתרון עם קצה פיפטה 200 μl, ואחריו בעדינות triturating המניה עם קצה פיפטה 200 μl כי יש לו ~ 3 מ"מ של הסוף נותק.
6. מניחים צלחת תרבית תאים על קרח ובשלושה עותקים, גם של עומס 50 μl / כל אחד מתערובות המיטוכונדריה / המצע. המפתחים של assay respirometric microplate מבוסס ממליצים להשאיר מינימום של שתי (אין מיטוכונדריה) בארות ריקות, עדיף על שני צדדים על צלחת תרבית תאים.
7. ספין צלחת תרבית תאים ב2,000 גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בעוד הצלחת היא שלמצמיד, לחמם את פתרונות המצע באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
8. אחרי הספין הוא מלא, לטעון בזהירות 450 μl של כל פתרון מצע על גבי בארות בהתאמה שלה (כלומר, לטעון את פירובט / מצע Malate לבארות שיש לי מיטוכונדריה תחילה resuspended בפתרון מצע זה). הקפד לטעון את הצלחת ב RT. הערה: יש לטעון בארות ריקות עם 500 μl של מצע. יש לטעון בארות ריקות המיועדות לזרימת האלקטרונים assay עם זרם אלקטרונים המצע (פירובט / Malate + FCCP), בעוד שניתן לטעון את הבארות ריקות assay בשילוב עם כל מצע assay צימוד.
   הערה: אם מבצעים את זרימת מבחני מצמידים ואלקטרונים באותה הצלחת, החוקר חייב להקצות מחדש בארות רקע למבחני ההתאמה אחרי ריצת assay היא מלאה באמצעות הפלטפורמה "XF Reader" דרך הכרטיסייה "הכלי". ברגע שבתוך ההגדרה "הכלי", לחץ על "המינהל"כרטיסייה, ואחריו "תיקון רקע". פגע "סיום מצב התקנת מכשיר" כששלם. סיבה לכך הוא השילוב של ascorbate / TMPD יכול לצרוך O _2, ובכך תיקון רקע נפרד נחוץ לכל סוג assay.
9. לאחר μl 450 של מצע מתווסף כל טוב, להציג את השכבה של המיטוכונדריה בבאר על מנת להבטיח את המיטוכונדריה מפוזרות באופן שווה בשכבה יחידה (הגדלה 20X [ראה ⁹ רוג'רס, איור 4]). ולס שלא נראה שיש לי monolayer מופץ באופן שווה ניתן להסיר פוסט הוק.
10. לאחר הבדיקה לדבקות במיטוכונדריה, הכנס את microplate למכשיר assay respirometric ולהתחיל assay מנוהל על ידי לחיצה על "אישור".
    הערה: הכיול מצעד 2.1 חייב להיות מלא לפני הריצה תתחיל. ברגע שהחוקר לוחץ על "אישור", המכונה להוציא את צלחת השירות ששימשה לכיול.
    1. הסר את צלחת השירות ולמקם את צלחת תרבית תאים המכילה את המיטוכונדריה על המגש. החריץ הכחול על צלחת תרבית התאים צריך להיות ממוקם בפינה השמאלית התחתונה של המגש. לחץ על "המשך" על מנת להתחיל את ריצת assay.
11. לאחר הריצה תושלם, להוציא את צלחת תרבית תאים ומחסנית על ידי לחיצה על "הוצא" על המסך.
    1. ברגע שהצלחת הוא נפלט, להסיר ולסלק את צלחת תרבית תאים ומחסנית ולחץ על "המשך" על המסך. הריצה תישמר באופן אוטומטי כקובץ .xls בקובץ "נתונים".
12. פתח קובץ זה ולשנות את התצוגה מ" O2 "ל" OCR "על ידי להכות את החץ כלפי מטה תחת" Y1: "סמן.
    1. השינוי הבא "נקודה התיכונה" ל "מחירים Point-to-Point" תחת "קצב נתונים מוצג כ:" אפשרות. לחץ על "אישור" כדי להחיל את השינויים הללו.
13. לחץ על הכרטיסייה "ובכן הקבוצה Mode" בפינה השמאלית תחתונה של המסך כדי בארות קבוצה של תנאים דומים יחד. לבסוף, לחץ על כרטיסיית "לדוגמא ממוצעת / תקן השגיאה" לקראת אמצע המסך, בצד השמאל. לחלופין, בפקודות אלה יכולות להיות התקנה לפני assay מתחיל בהגדרה "Assay האשף".
    הערה: כל מצב יהיה ממוצע ± סטיית תקן מוצג עבור כל שיעור וכל מצב. יש מדידות שיעור נלקחו למצב (מדינה 2 [צימוד] / State3u נשימה [אלקטרונים תזרים] ואחריו ארבע זריקות). השתמש בתוחלת שער המדינה 2 למדידה השנייה, לקבוע מדינה 4O בנקודת המינימום לאחר oligomycin הזרקה, השתמש בנקודת המקסימום למדינה 3 ו3U המדינה לאחר ADP והזרקת FCCP, בהתאמה, ולהשתמש בנקודת המינימום לAntimycin נשימה הנגרמת למבחני זיווגים. השתמש בנקודת המקסימום לפירובט / נשימה 3U מדינת Malate מושרה, להשתמש במינימוםנקודה לנשימה rotenone מושרה, להשתמש בנקודת המקסימום לנשימה 3U המדינה succinate מושרה, ולהשתמש בנקודת המינימום לAntimycin נשימה הנגרמת לassay אלקטרונים הזרימה. כל הניסויים בוצעו 3 פעמים והנתונים המוצגים התוצאות של מעקב נציג.

תוצאות

איור 1 מייצג שיעורי חמצן הצריכה (OCR) לפירובט / Malate, succinate / rotenone, קרניטין / Malate palmitoyl, ומבחני Malate גלוטמט / (מבחני צימוד). העתקים assay אלה מוצגים כשיעור צריכת חמצן, או OCR, לעומת זמן, הם correceted רקע, ומוצגים כשיעורי נקודה לנקודה. כל פנל מייצג את צריכת חמצן במדינות שונות במיטוכונדריה כפי שתיארו סיכוי ו ^-14 וויליאמס. הפנל הראשון מייצג את צריכת חמצן בסיסית, או מדינת הפנל השני 2., לאחר ההזרקה של ADP, מייצג נשימה מקסימלי בשילוב, או מדינת הפנל השלישי 3., לאחר ההזרקה של oligomycin (מעכב של V מורכב), מייצג נשימה עקב לדליפת פרוטון, או המדינה 4O. הפנל הרביעי, לאחר ההזרקה של FCCP, מייצג נשימה מקסימלי נחק, או 3U המדינה. לבסוף, הלוח החמישי, לאחר ההזרקה של Antimycin, מייצג את העיכוב של נשימה חמצוני. יש לציין, אליש מדינות המיטוכונדריה l סטיית תקן מינימאלית. זאת בשל ערבוב יסודי של מניית המיטוכונדריה ותערובות המיטוכונדריה / מצע, והשגת שכבה יחידה של המיטוכונדריה לאחר ספין הדבקות (שלב 2.6). מצד השני, טוען מיטוכונדריה שוויונית בהשגת כל טוב ולא שכבה יחידה של המיטוכונדריה בבאר של microplate מוביל לעליית סטיית התקן בכל מדינה כמוצגת באיור 2.

העתקים במישורי תצוגת איור 1 עבור כל מדינת המיטוכונדריה ועבור כל מצע. הרמה שהושגה לאחר שני מחזורי מדידה מצביעה על איכות המיטוכונדריה טובה ושתישאר מיטוכונדריה דבקה גם בכל משך הזמן של assay. בנוסף, השגת התייצבו שיעורים מרביים עשויים להיות רצוי יותר שכן זה מאפשר לחוקר לקחת OCR הממוצע במדינות המיטוכונדריה אלה, ובכך להקטין הטיות שעלולות להתרחשעל ידי באופן שרירותי בחירת נקודה.

כמות המיטוכונדריה לכל גם נקבעה על ידי ניסויי אופטימיזציה. הכמות האופטימלית של מיטוכונדריה לכל גם צריכה לגרום למדינה 2 שיעורים בין 100-200 pmol / דקות / 3 שיעורים היטב ומדינה <1500 pmol / דקות / טוב, מאז ערכים אלה נמצאים בטווח חישת חמצן הדינמי של החמצן רב גם מכונה מדידת הצריכה. טוען יותר מדי חלבון המיטוכונדריה לכל גם עלול לגרום לOCRs מעבר לטווח הדינמי של המכשיר (איור 3 א). איור 3 מתאר טעינת 3.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב (מעקב כחול) בהשוואה לטעינת 2.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב (אדום התחקות) עבור assay succinate / rotenone. טוען יותר מדי חלבון המיטוכונדריה לכל גם יכול גם להוביל לתשישות של חמצן בתוך microchamber הבאר, ובכך למנוע מדידה מדויקת של OCR לכל מדידה רצופה ⁹ (איור 3 </ Strong>). נקודה לנקודה OCR הוא השיעור המיידי של שינוי של OCR. אם שטוח, OCR הוא יציב / יציב, אבל אם יורד, אז ייתכן שיש בעיה ביולוגית או טכנית. הירידה החדה בOCR במדינה 3 ונשימה המדינה 3U (איור 3 א) נגרמת על ידי המיטוכונדריה מתיש אספקת החמצן לפני סוף המדידה (איור 3).

איור 4 מייצג OCR לעומת זמן לזרימת האלקטרונים assay. המעקב הוא תיקן ומוצג כפי שתואר לאיור 1. הפנל הראשון בassay זה מייצג נשימה 3U מדינה על פירובט / Malate באמצעות I. מורכב הפנל השני, לאחר ההזרקה של rotenone, מייצג עיכוב של נשימה אני קומפלקס בתיווך. הפנל השלישי, לאחר ההזרקה של succinate, מייצג 3U מדינת מצע מגורה עם אלקטרונים נכנסים וכו 'במתחם השני (קומפלקס השני נשימה בתיווך). הפנל הרביעי, לאחר ההזרקה של Antimycin, מייצג עיכוב של קומפלקס III ונשימה ובכך מוחלטת. לבסוף, הלוח החמישי, לאחר ההזרקה של ascorbate / TMPD, מייצג נשימה IV מורכבת בתיווך. בדומה להעתקים באיור 1, יש לי כל המדינות המיטוכונדריה סטיית תקן מינימאלית, וכל שיעור יש או כמעט השיג רמה.

איור 1. מבחני זיווגים. () 10 מ"מ פירובט / 5 Malate מ"מ, (ב) succinate 10 מ"מ / 2 מיקרומטר rotenone, 40 מיקרומטר קרניטין / 1 Malate מ"מ palmitoyl (ג), ו- (ד) גלוטמט 10 מ"מ / 10 מ"מ Malate שילוב העתקים assay הנשימה המיטוכונדריאלי כפי שנקבע על ידי מדידה רב גם של צריכת חמצן. הערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן. חלבון מיטוכונדריאלי העמוס בכל טוב היה 3.5 מיקרוגרם לכל מבחני חוץ succinate / ריקבוןenone, אשר מנצל 2.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב. הנתונים מייצגים n = 3 משכפל ביולוגי מותאם. דרג = צריכת חמצן OCR; ADP = diphosphate אדנוזין; אוליגו = Oligomycin; FCCP cyanide- = קרבוניל 4 - phenylhydrazone (trifluoromethoxy); אנטי-= Antimycin; PYR = פירובט; Succ = succinate; ROT = Rotenone; PAL-C = קרניטין palmitoyl; שפע = גלוטמט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. מאוד משתנה פירובט / Malate Assay. Assay מאוד משתנה 10 פירובט / 5 המ"מ Malate שנגרם על ידי ערבוב חלקי המיטוכונדריה ממניות המיטוכונדריה במצע / תערובת MAS, ובכך מוביל לפרו המיטוכונדריה משתנהטעינת חלבון בכל טוב. חלבון מיטוכונדריאלי העמוס בכל טוב היה 3.5 מיקרוגרם. הנתונים מייצגים n = 3 משכפל ביולוגי מותאם. דרג = צריכת חמצן OCR; ADP = diphosphate אדנוזין; אוליגו = Oligomycin; FCCP cyanide- = קרבוניל 4 - phenylhydrazone (trifluoromethoxy); אנטי-= Antimycin; PYR = פירובט. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. חלבון ההעמסה מיטוכונדריאלי לsuccinate / Rotenone Assay. (א) שיעורי צריכת חמצן מחוץ לטווח הדינמי של המכונה מדידת צריכת חמצן רב גם נגרמים על ידי טעינת 3.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב (מעקב כחול) בהשוואה לטעינה 2.5 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב (מעקב אדום). (ב ) שורygen מתח מתקרב לאפס הבא ADP וזריקות FCCP נגרמות על ידי טעינת חלבון מוגזם המיטוכונדריה (3.5 מיקרוגרם) בכל טוב (מעקב כחול) בהשוואה לטעינת כמות אופטימלית (2.5 מיקרוגרם) של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב (מעקב אדום). הנתונים מייצגים n = 3 משכפל ביולוגי לזווג לכמות חלבון המיטוכונדריה. דרג = צריכת חמצן OCR; ADP = diphosphate אדנוזין; אוליגו = Oligomycin; FCCP cyanide- = קרבוניל 4 - phenylhydrazone (trifluoromethoxy); אנטי-= Antimycin; Succ = succinate; ROT = Rotenone; O ₂ = חמצן; = מילימטרים מ"מ כספית של כספית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. Assay. 5 פירובט / 1 FCCP Malate + 4 מיקרומטר מ"מ אלקטרונים זרימה, האלקטרונים fמעקב נמוך המיטוכונדריה assay הנשימה, כפי שנקבע על ידי מדידה רב גם של צריכת חמצן. הערכים באים לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן. חלבון מיטוכונדריאלי העמוס בכל טוב היה 3.5 מיקרוגרם. הנתונים מייצגים n = 3 משכפל ביולוגי מותאם. דרג = צריכת חמצן OCR; אנטי-= Antimycin; עולה = Ascorbate; TMPD = N, N, N ', N' -phenylenediamine עמ -tetramethyl-. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מגיב	ריכוז מניות	MW	נפח סופי	מסה נוסף	תגובות / תיאור
	(M)	(G / mol)	(מיליליטר)	(ז או מיליליטר)
EGTA, pH 7.2	0.1	380.35	של 1M טריס בסיס 100 מיליליטר	3.801 גרם	חנות ב 4 מעלות צלזיוס
HEPES	1	238.3	250 מיליליטר של DiH 2 O	59. 57 גרם	חנות ב 4 מעלות צלזיוס
MgCl 2, hexahydrate	1	203.31	250 מיליליטר של DiH 2 O	50.82 גרם	חנות ב 4 מעלות צלזיוס
pH 7.4 פירובט	0.1	88.06 (מגיע כ14.11 M פתרון)	40 מיליליטר של DiH 2 O	0.283 מיליליטר של פירובט	הפוך 1 מיליליטר aliquots ולאחסן ב -20 ° C, לעשות טריים כל שבועיים
pH 7.4 succinate	0.5	118.09	של DiH 2 O 100 מיליליטר	9.4 גרם של suחומצת ccinic	הפוך 1 מיליליטר aliquots ולאחסן ב -20 ° C
Malate, pH 7.4	0.5	134.09	של אתנול 95% 100 מיליליטר	6.7 גרם של חומצת מאלית	הפוך 200 aliquots וחנות μl ב -20 ° C
TMPD	0.01	164.25	10 מיליליטר	.0164 ז	הפוך 300 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C; מערבבים עם כמות equimolar של ascorbate לשמור TMPD המופחתת
כלוריד-קרניטין Palmitoyl	0.01	436.07	1.14 מיליליטר של אתנול 95%	0.005 גרם	הפוך 40 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C
Oligomycin	0.006	791.06	0.987 מיליליטר של אתנול 95%	0.005 גרם	הפוך 20 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C
FCCP	0.01	254.17	3.9 מיליליטר של אתנול 95%	0.01 גרם	הפוך 40 aliquots μl ולאחסן ב -20 ° C
Rotenone	0.001	394.4	10 מיליליטר של אתנול 95%	.0039 ז	חנות ב -20 מעלות צלזיוס
Antimycin	0.005	548.63	9.12 מיליליטר של אתנול 95%	0.025 גרם	חנות ב -20 מעלות צלזיוס
K + ADP	0.5	501.32	3.9 מיליליטר של DiH 2 O	1.0 גרם	חנות ב -20 מעלות צלזיוס
מאלית חומצה, pH 7.4	0.5	134.09	40 מיליליטר	2.68 גרם	הפוך 200 aliquots וחנות μl ב -20 ° C

פתרונות מניות טבלה

מגיב	ריכוז מניות	מסה נוסף	Molarity הסופי / אחוזים
	(M)	(ז או מיליליטר)
סוכרוז	-	11.98 גרם	70 מ"מ
מניטול	-	20.04 גרם	220 מ"מ
monobasic פוספט אשלגן	-	0.34 גרם	5 מ"מ
MgCl 2, hexahydrate	1	2.5 מיליליטר	5 מ"מ
HEPES	1	1.0 מיליליטר	2 מ"מ
EGTA	0.1	5.0 מיליליטר	1 מ"מ
בעיקרו של דבר חומצות שומן פריפורט BSA	-	1.0 גרם	0.20%

. טבלה 2. MAS מיקס pH 7.4, 500 מיליליטר: Aliquot 25 מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס * הערה: אל תכלול BSA לתערובת MAS משמשת לזריקות assay.

מצע בינוני	ריכוז סופי	כמות המניות (μl)	הסכום של MAS * (מיליליטר)
פירובט / Malate	10 מ"מ / 5 מ"מ	פירובט: 1000	9
		Malate: 100
Succicinate / Rotenone	10/2 מיקרומטר מ"מ	Succinate: 200	10
		Rotenone 20
* פירובט / Malate + FCCP	5 מ"מ / 1 מ"מ / 4 מיקרומטר	פירובט: 500	10
		FCCP: 4
		Malate: 20
ל-קרניטין Palmitoyl / Malate	40 מיקרומטר / 1 מ"מ	Palmitoylcarnitine: 40 Malate: 20	10
גלוטמט / Malate	10 מ"מ / 10 מ"מ	גלוטמט: 400	10
		Malate: 200

טבלת 3. pH פתרונות תשתית 7.4: הפוך טרי היום של הניסוי. * פתרון הזרימה assay אלקטרונים.

הזרקה בינונית	ריכוז	כמות המניות (μl)	הסכום של MAS (מיליליטר)	הסכום שהוחדר לתוך המחסנית	ריכוז סופי
					(מוזרק לאחר בצלחת)
ADP	50 מ"מ	300 μl	3	50 μl	5.0 מ"מ
Oligomycin	20 מיקרומטר	10 μl	3	55 μl	2.0 מיקרומטר
FCCP	40 מיקרומטר	12 μl	3	60 μl	4.0 מיקרומטר
Antimycin	40 מיקרומטר	24 μl	3	65 μl	4.0 מיקרומטר

T4. זריקות מסוגלים למבחנים יחד pH 7.4:. הפוך טרי היום של הניסוי. * מבחני צימוד כוללים (אך לא רק) פירובט / Malate, succinate / rotenone, קרניטין / Malate palmitoyl, וגלוטמט / Malate.

הזרקה בינונית	ריכוז	כמות המניות (ז או UL)	הסכום של MAS (מיליליטר)	הסכום שהוחדר לתוך המחסנית	ריכוז סופי (לאחר שהוחדר בצלחת)
Rotenone	20 מיקרומטר	60 μl	3	50 μl	2.0 מיקרומטר
Succinate	50 מ"מ	300 μl	3	55 μl	5.0 מ"מ
Antimycin	40 מיקרומטר	24 μ; L	3	60 μl	4.0 מיקרומטר
TMPD / Ascorabte	1 מ"מ, 100 מ"מ	TMPD: 300 μl	3	65 μl	100 מיקרומטר, 10mm
		Ascorbate: 0.059 g

זריקות לוח 5. לאלקטרוני הזרימה Assay pH 7.4:. הפוך טריות היום של הניסוי

פיקוד	זמן (דקות)	# של מחזורים
לכייל
חכה	10 דקות (כדי לאפשר את הצלחת כדי לחמם מצעד דבקות)
מערבבים	1 דקות	2
שליAsure	2 דקות
הזרק
מערבבים	1 דקות	2
מדד	2 דקות
הזרק B
מערבבים	1 דקות	2
מדד	2 דקות
הזרק C
מערבבים	1 דקות	2
מדד	2 דקות
הזרק D
מערבבים	1 דקות	2
מדד	2 דקות

לוח 6. מכשיר הפעלת פרוטוקול.

דיון

השיטות שהוצגו במאמר זה מספקות הוראות צעד-אחר-צעד לביצוע אוסף של מבחני respirometric microplate מבוסס באמצעות המיטוכונדריה מבודדת 75-100 מ"ג של שרירי שלד עכבר. ניתן לבצע מבחני אלה עם דיוק גבוה כפי שמעידים סטיית התקן ההדוקה בין בארות בשלושה עותקים. חשוב לציין, מבחני respirometric אלה מאפשרים איתור של חריגות שבו ו / או התאמות עשויות להיות מתרחשות בETC, מחזור TCA, מסלול β-חמצון, מובילי מצע, וכו 'במודל חיה נפוץ.

חשוב להדגיש את הרציונל לשימוש בדלקים שונים ומעכבי שימוש בפרוטוקול זה. פירובט / Malate ומבחני respirometric Malate גלוטמט / נאפשר להערכת נשימה אני קומפלקס תיווך, כמו גם ההערכה של המובילים שלהם, ובמקרה של גלוטמט, deaminase ^15. לחלופין, השילוב שלsuccinate / rotenone מאפשר ההערכה של שטף נשימה במיטוכונדריה באמצעות הקומפלקס השני של ETC מאז rotenone מעכב אני מורכב וsuccinate מספק אלקטרונים לקומפלקס השני באמצעות ההפחתה של פלבין dinucleotide אדנין (FADH ₂₎ ^15. מבחני אלה מספקים מידע ספציפי מצע כליעילות צימוד ונשימה מקסימלי. זרימת האלקטרונים assay הוא ייחודי בכך שהשילוב של מצעים ומעכבים מאפשר ההערכה של מתחמים מרובים במהלך שטף נשימה במיטוכונדריה ^9. תערובת המצע הראשונית של פירובט / Malate + FCCP מאפשרת ההערכה של נשימה מקסימלי מונעת על ידי מורכב, תוך ההזרקה של rotenone אחרי succinate מאפשרת לנשימה המקסימלי הערכה מונעת על ידי הקומפלקס השני. ההזרקה של Antimycin, מעכב של קומפלקס III, ואחרי ההזרקה של ascorbate / TMPD לאפשר להערכת הנשימה מונעת על ידי IV מורכב מאז Ascorbate / TMPD הואתורם אלקטרונים לציטוכרום C / IV מורכב. אמנם אין מידע על יעילות צימוד מתקבל, השיטה אידיאלית לגודל מדגם קטן מאוד שמונעים הפעלת מצעים מרובים באופן עצמאי. לבסוף, השימוש בקרניטין / Malate palmitoyl מאפשר ההערכה של התיאום בין β-חמצון וETC מאז שווה ערך הפחתה מופק מהחמצון של חומצה פלמיטית (β-חמצון) מוזן לתוך ETC דרך אלקטרון העברת flavoprotein ^15. יש לציין כי מבחני זרימת הצימוד ואלקטרונים יכולים לשמש גם במקביל לזיהוי שינויים בתפקוד המיטוכונדריה בשל כמה התערבות (טיפול תרופתי, מניפולציה גנטית).

הדיוק הגבוה שהושג עבור מבחני אלה הוא בעיקר בשל ערבוב יסודי של המיטוכונדריה, אם זה לפני קביעת חלבון, או עם פתרונות המצע. לאורך שורות אלה, ברגע שהמיטוכונדריה הוא resuspendend בsolutio המצעNS, זה קריטי כדי לערבב את הפתרון הזה ביסודיות לפני טעינת צלחת תרבית התאים כפי שמתואר בשלב 2.2 עם קצה פיפטה פתח מורחב. כישלון לערבב מיטוכונדריה יסודיות יוביל לשינוי גדול בתוך assay. בנוסף, באמצעות קצה פיפטה פתח צר ייצור כוחות הגז תוך ערבוב מיטוכונדריה ומגדיל את הפוטנציאל לניזק לקרומי המיטוכונדריה ושחרורו של ציטוכרום C. צעד הדבקות (2.7) הוא גם שלב קריטי בפרוטוקול זה. אי לסובב את צלחת תרבית תאים הטעונה ארוכים / מספיק מהר יגרמו דבקות שלמה של המיטוכונדריה לטובה, ובכך מוביל השתנות מוגברת בין בארות ומדידות.

הפרוטוקול המתואר כבר מותאם לכולל: טעינת כמות אופטימלית של חלבון המיטוכונדריה בכל טוב, באמצעות ריכוזים / שיטות הכנה הנכונות כדי להפוך פתרונות מניות ומצע, לשנות את טווח assay כדי להבטיח PLA המדינה המיטוכונדריהteaus, וערבוב מתאים של תערובות המניות והמיטוכונדריה / מצע של המיטוכונדריה. לפני מאמצי ייעול אלה, המחברים נתקלו מלכודות בטווח assay. הבא דן שיטות לפתרון בעיות / שינויים שהיו מסייע באופטימיזציה של פרוטוקול זה. עם כל כבוד לטעינה אופטימלית, מיטוכונדריה מעט מדי טעינה לא לעורר תגובה חזקה, בעת הטעינה מדי מיטוכונדריה יהיה למצות את החמצן בתוך microchamber ולהוביל למדידה לא מדויקת. רוג'רס ואח ^'9 מספק דוגמאות לקביעת סכומי טעינה אופטימליות של מיטוכונדריה לכל גם למבחני respirometric microplate מבוססים. לעתים קרובות יותר, יותר מדי מיטוכונדריה נטענת בכל טוב כפי שמעידה מדינה 2 שיעורים על 100-200 pmol / דקות / גם ושיעורים 3> 1500 pmol / דקות / גם מדינה. אם על טעינה מתרחשת, לבצע ניסוי עם משתנה ריכוז של חלבון המיטוכונדריה (למשל, בין 1 -. 10 מיקרוגרם) כדי לעורר OCRs בתוך r ​​הדינמיAnge של המכונה מדידת צריכת חמצן. הכנה ושימוש בריכוזים הנכונים של מצעים ומניות היא בעל חשיבות עליונה. תמיד השתמש בטופס החומצה של מצעים / זריקות ולהתאים את ה- pH עם אשלגן הידרוקסיד או HCl; מאגרי נתרן / פתרונות אינם מומלצים. בנוסף, מצעי resuspending / המניות בDMSO או אתנול 100% יגרמו לכישלון מדידה או שגיאה. הקפד להשתמש אתנול 95% שבו ציין. זה נפוץ קרניטין palmitoyl כדי לזרז מתוך אתנול 95% לאחר הפשרת המניות הקפואות, ובכך גורם שונות גדולות. הקפד לחמם את מניית קרניטין palmitoyl ומערבולת היטב לפני השימוש. בנוסף, פירובט / תוצאת assay Malate משתנה מאוד יכולה להיות בגלל יצור מניית פירובט> 2 שבועות. הקפד מחדש aliquots הקפוא של פירובט כל 2 שבועות. ריצת assay שונה כדי מדידות 2-דקות כדי להבטיח מישורי המדינה המיטוכונדריה. אם תצפית של תשישות של ADP היא רצויה, רשאי החוקרלהאריך את זמן המדידה תחת לשונית "פרוטוקול" תחת הפורום "Assay האשף". לבסוף, השתנות גדולה מתרחשת כאשר פתרונות מניית המיטוכונדריה ומיטוכונדריה בתוספת המצע אינם הומוגני לפני מלא לטעינה. אם שונות בין הבארות היא גבוהות אחרי ריצת assay, הקפד לערבב באופן מלא את פתרון המצע לפני הניסוי הבא. לא מערבולת פתרונות מיטוכונדריה / מצע, ולא לעורר, מחית, ובעדינות triturate עם פיפטה קצה פתח מורחב.

ישנן מספר מגבלות של טכניקה זו, כי הם ראויים לציון. ראשית, מספר הבארות בצלחת תרבית תאים המשמשת למבחנים אלה הוא נמוך יחסית (כלומר., 24 בארות ולפחות 2 מיועדים לבארות ריקות). אם זה רצוי לבצע את כל 5 של מבחני אלה על צלחת אחת, החוקר הוא רק מסוגל לבחון את התגובות מעכבר אחד בכל פעם. עם זאת, יש לציין כי 96 מכשירים וזמינים לhigheתפוקת r. שנית, יש את נקודות החוזק וחולשות הגלומות בהערכת תפקוד המיטוכונדריה במיטוכונדריה מבודדת בהשוואה בתאים שלמים ^1. חולשות מסוימות כוללות שיש רלוונטי פחות פיסיולוגי לעומת תאים שלמים וחפצי התרמה מתהליך הבידוד. לבסוף, ההצלחה של שיטה זו היא תלויה באיכות של תהליך בידוד המיטוכונדריה.

למרות שחלק ממבחנים אלה פותחו גם במערכות שונות או אומתו במודלים של בעלי חיים אחרים, השיטות שהוצגו במסמך זה הן ראשון לסנתז את כל מבחני האמורים לשימוש האופטימלי בעכבר באמצעות מכונה מדידת צריכת חמצן רב גם שרירי שלד. חשוב לציין, כל 5 של מבחני אלה יכולים להתבצע עם כמות המיטוכונדריה מבודדת מ~ 75-100 מ"ג של שרירי שלד עכבר, ובכך לספק תפוקה גבוהה עם חומר מינימאלי. משמעות רבה, היכולת של רב גםטכנולוגיות צריכת חמצן כדי לבצע מבחני עם כמויות מינימליות של מיטוכונדריה, בשילוב עם שיטת בידוד מותאמת, מאפשר לחוקר לבצע מספר רב של ניסויים אחרים עם שארית רקמת שריר שלד (למשל., כתמים מערביים, RT-PCR, מבחני האנזימטית, וכו '), אשר לעתים קרובות מאבק עם מודל חיה זו.

לסיכום, השיטות שהוצגו במסמך זה מספקות הוראות צעד-אחר-צעד לביצוע אוסף של מבחני respirometric microplate מבוסס באמצעות כמויות מינימליות של שריר שלד עכבר. חשוב לציין, השיטות שהוצגו דורשות כמויות מינימליות של רקמות ומיטוכונדריה. ברגע שמשתלט עליו, הטכניקות המתוארות במסמך זה תאפשר לחוקרים לקבוע מנגנון פוטנציאלי של מוצר או מתחם גן על צריכת חמצן במיטוכונדריה במודל חיה נפוץ.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חנות סוכרוז	סיגמא אולדריץ'	S7903	ב-RT
D-מניטול	סיגמא אולדריץ'	63559	חנות ב-RT
אשלגן פוספט מונובסיסי, מינימום 99.0%	סיגמא אולדריץ'	P5379	חנות ב-RT
מגנזיום כלוריד הקסהידרט, מגיב ACS, 99.0-102.0%	סיגמא אולדריץ'	M9272	חנות ב-RT
HEPES מינימום 99.5% טיטרציה	חנות Sigma Aldrich	H3375	ב-RT
EGTA	חנות Sigma Aldrich	E4378	ב-RT
שומני בעיקרו	חנות סיגמא אולדריץ'	A6003	ב-4 מעלות;
ללא חומצה C -
, 98%	Sigma Aldrich	107360	יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
חומצה סוקסינית	Sigma Aldrich	S9512	חנות ב-RT
L(-) חומצה מאלית, BioXtra, ≥ 95%	Sigma Aldrich	M6413	חנות ב-RT
L-חומצה גלוטמית	Sigma Aldrich	G1251	חנות ב-RT
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma Aldrich	T7394	חנות ב-RT
99%, אבקה [TMPD]
פלמיטואיל L-קרניטין כלוריד	סיגמא אולדריץ'	P1645	חנות ב-20 מעלות; C
אוליגומיצין A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	חנות ב-20 מעלות; C
קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)	Sigma Aldrich	C2920	חנות ב-2 - 8 מעלות; C
פנילהידרזון
≥ 98% (TLC), אבקה [FCCP]
אנטימיצין A מסטרפטומיצס sp.	חנות סיגמא אולדריץ'	A8674	ב -20 מעלות; C
אדנוזין 5′-דיפוספט מונופוטסיום מלח מיובש [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	חנות ב-RT
Pierce™ ערכת בדיקת חלבון BCA	תרמו סיינטיפיק	23225	לא ישים