מאמר שיטה

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

12.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/53217

⸱

13 בנובמבר 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Department of Human Nutrition, Foods, and Exercise, Virginia Tech, 2The Metabolic Phenotyping Core, Virginia Tech, 3Seahorse Bioscience

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים שינוי של שיטה שדווחה בעבר המאפשרת בידוד של מיטוכונדריה איכותית ומטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר. הליך זה מביא למיטוכונדריה בצימוד גבוה שנושמים בתפקוד גבוה במהלך מבחני רספירומטירק מבוססי מיקרופלייט.

תקציר

מיטוכונדריה שריר שלד מתפקד לשחק תפקיד בחילוף חומרים שינו נצפו עם הזדקנות, השמנת יתר וסוכרת סוג II. מבחני respirometric מיטוכונדריאלי מהכנות המיטוכונדריה מבודדות מאפשרים ההערכה של תפקוד המיטוכונדריה, כמו גם קביעת המנגנון (ים) של פעולה של תרופות וחלבונים המווסתים את חילוף חומרים. נהלי בידוד נוכחיים לעתים קרובות דורשים כמויות גדולות של רקמה להניב מיטוכונדריה באיכות גבוהה הנדרשת למבחני respirometric. השיטות שהוצגו במסמך זה מתארים כיצד באיכות גבוהה מטוהרת מיטוכונדריה (~ 450 מיקרוגרם) יכול להיות מבודדים מכמויות מינימליות (~ 75-100 מ"ג) של שריר שלד עכבר לשימוש במדידות בדרכי הנשימה תפוקה גבוהה. אנחנו קבענו כי שיטת הבידוד שלנו מניבה 92.5 ± 2.0% המיטוכונדריה שלמה על ידי מדידת פעילות synthase ציטראט spectrophotometrically. בנוסף, ניתוח כתם מערבי במיטוכונדריה המבודדת הביא לביטוי הקלוש של cytosoחלבון Lic, GAPDH, והביטוי חזק של חלבון המיטוכונדריה, COXIV. היעדר להקת GAPDH בולט במיטוכונדריה המבודדת מעיד על זיהום קטן ממקורות שאינן המיטוכונדריה במהלך הליך הבידוד. והכי חשוב, מדידת שיעור O 2 הצריכה עם טכנולוגיה מבוססת מיקרו-צלחת וקביעת יחס הנשימה השליטה (RCR) למבחני מצמידים respirometric תערוכות בשילוב מאוד (RCR;> 6 לכל מבחני) ומיטוכונדריה הפונקציונלית. לסיכום, התוספת של צעד זהיר, נפרד והפחתת מהירות הומוגניזציה מנוע מונע משיטה שדווחה בעבר באופן משמעותי אפשרה את הבידוד של איכות גבוהה ומיטוכונדריה המטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר, כי תוצאות במיטוכונדריה בשילוב מאוד כי לנשום עם פונקציה גבוהה במהלך מבחני respirometirc microplate מבוססים.

מבוא

התפקיד העיקרי של המיטוכונדריה הוא לייצר ATP מזרחון חמצוני. עם זאת, למיטוכונדריה יש פונקציות תאיות חשובות רבות אחרות, כולל אך לא רק: ייצור וניקוי רעלים של מיני חמצן תגובתיים, ויסות סידן ציטופלזמי ומיטוכונדריאלי, סחר באברונים, הומאוסטזיס יוני ומעורבות באפופטוזיס1,2. לכן, אין זה מפתיע שמיטוכונדריה לא מתפקדת ממלאות תפקיד בפתולוגיות מחלות רבות, כגון הזדקנות, מחלות ניווניות, מחלות לב וכלי דם, סרטן, השמנת יתר וסוכרת3,4. חשוב לציין, מיטוכונדריה של שרירי השלד מעורבים באופן ספציפי ברבות מהפתולוגיות הללו3-5.

בדיקות נשימה מיטוכונדריאליות באמצעות מיטוכונדריה מבודדת מאפשרות הערכה של שרשרת הובלת האלקטרונים ותפקוד זרחון חמצוני, וקביעת מנגנוני הפעולה של תרופות וחלבונים המווסתים את חילוף החומרים. נהלי בידוד מיטוכונדריאלי קיימים עבור סוגי רקמות ותאים מרובים עבור מגוון מינים6,7. עם זאת, הליכים אלה דורשים לעתים קרובות כמויות גדולות של רקמות/תאים לתפוקת מיטוכונדריה באיכות גבוהה הנחוצה לבדיקות ספירומטריות קלאסיות.

בדיקות רספירומטירק מבוססות מיקרופלייט מאפשרות מדידות תפוקה גבוהות תוך שימוש בכמויות מינימליות של מיטוכונדריה מבודדות, לרוב רק כמה מיקרוגרם לבאר8. לכן, אנו מציגים שינוי של שיטות7 שפורסמו בעבר כדי לאפשר בידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר לשימוש במבחני רספירומטירק מבוססי מיקרו-פלטה. בנוסף, ניתנות שיטות לקביעת איכות הכנת הבידוד המיטוכונדריאלי ושלמות הממברנות המיטוכונדריאליות. בהתחשב בכך שהמיטוכונדריה של שרירי השלד מעורבים במצבים פתולוגיים רבים, מדידת צריכת O2 במחקרים מונעים מכניסטיים הופכת נפוצה יותר במחקר ביו-רפואי9,10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקרים בבעלי חיים בוצעו תחת פרוטוקול שאושר על ידי הטיפול בבעלי חיים המוסדי הוועדה השתמש בוירג'יניה מכון הפוליטכני ואוניברסיטת מדינה.

1. הגדרות (זמן: ~ 45 דקות)

  1. חנויות הפשרה קפוא של 0.25% טריפסין, בידוד מאגר למיטוכונדריה (IBM) 1 וIBM2 באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  2. יש לשטוף את הזכוכית ומכשירים לנתח באתנול 70% ואחריו מים טוהר גבוהים.
  3. הכן 0.05% פתרון טריפסין 0.25% ממניות טריפסין על ידי דילול טריפסין חלק 1 ב 4 חלקים IBM1.
  4. מערבבים קוקטייל פרוטאז ומעכב phosphatase עם חיץ תמוגה תא (1: 100 יחס) בצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge עם כובע בורג.
  5. 5 מיליליטר aliquot (5 מיליליטר / עכבר) של טריפסין 0.05% לצינור פלסטיק 15 מיליליטר.
  6. מנוע הגדר מונע homogenizer רקמות 80 סל"ד.

2. בידוד של שרירי שלד מיטוכונדריה (זמן: ~ 90 דקות)

  1. להרדים עכבר על ידי CO 2 , ואחריו נקע בצוואר הרחם.
  2. הסר שריר אדום מהארבעה הראשי והגסטרוקנמיוס השריר, הכולל את soleus (~ 75-100 כולל מ"ג) כפי שמתואר בשלבים הבאים:
    1. לקלף את העור לקראת העכבר.
    2. הסר את כרית השומן על נקודת המוצא הארבע ראשי. חותך את גיד שריר הארבעה הראשי, שמצורף לפיקת הברך עם מספריים קנס היטה.
      הערה: ארבע ראשי מזוהה על ידי העמדה אנטומית שלה בחלק הקדמי של עצם הירך הפרוקסימלית.
    3. לאט לגזור אָלָל בין העצם והשריר הארבע ראשי, תוך הימנעות עורק הירך, כדי לשחרר את השריר הארבעה הראשיים מהעצם. חותך את הגיד במספריים קנס היטה בנקודת המוצא בירך כדי לשחרר את השרירים הארבע ראשי ולמקם את השריר הארבע ראשי בPBS המקורר.
    4. הסר רקמת שומן נראית לעין על פני הארבע ראשי במספריים. הפוך את השריר הארבעה הראשיים על כך שהחלק מהשריר שמעל עצם הירך פונה uעמ '. פתח את השריר הארבע ראשי עם מלקחיים בתנועת פנינג. הסר את שני חלקי השריר אדומים גלויים מכל אונה עם מספריים עדינים היטה ומקום בכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר.
      הערה: שריר ארבע ראשי מופיע כשתי אונות עם פס של שריר אדום ממוקם בסמוך לקצה הלטרלי של כל אונה.
    5. חותך את העור שמעל גיד אכילס עם מספריים עדינים הטה ולקלף את העור כלפי העכבר. חותך את גיד אכילס החשוף ולקלף את השריר לכיוון הגוף של העכבר.
    6. חותך את הגיד בcondyles הרוחב והמדיאלי של עצם הירך במספריים קנס היטה לשחרר הגסטרוקנמיוס ולמקם את הגסטרוקנמיוס מצורף לגידים שלה בPBS הצונן.
    7. הפוך את הגסטרוקנמיוס שוב ולקלף את שריר הסוליה והמקום לכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר. מאוורר לפתוח הגסטרוקנמיוס. הסר את שלושת חלקים חזותיים אדומים שריר (שתי רצועות אדומות לרוחב והמדיאלי אחד שטחית) עם מספריים קנס היטהים ולהעביר אותם לכוס המכילה 5 מיליליטר של IBM1 המקורר.
  3. הסר ~ 75-100 מ"ג אחר של שריר אדום מהרגל השנייה של העכבר (כמתואר בשלב 2.2) ומקום לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם קוקטייל פרוטאז ומעכב phosphatase וחיץ תמוגה תא (50 מ"מ טריס-HCL, 1 mM EDTA, 150 מ"מ NaCl, 1% סולפט dodecyl נתרן, 0.5% deoxycholate נתרן, 1% Polyoxyethylene (9) nonylphenylether, מסועף. מייד Flash-להקפיא מדגם השני בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר במערב סופג (ראה שלב 6.1).
  4. מניחים משטח טרום צונן, שטוח פלסטיק על קרח בדלי גדול. יוצקים ירידה של IBM1 על גבי משטח הפלסטיק ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את כל השרירים האדומים מחולקים (שלב 2.2.4 ו2.2.7) בטיפת IBM1. לרכך את רקמת השריר למשך 2 דקות באמצעות 3 סכיני גילוח קצה אחד על ידי סכיני גילוח משתנים כל שנייה 40.
  5. העברת הרקמה הטחון לכוס חדשה עם 5 מיליליטר של IBM1 הטרי על ידי לחיצה על משטח הפלסטיק על הכוס דואר ומגרד את השריר לתוך הכוס עם סכין גילוח. קח את הפתרון הזה ולנקז אותו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר ממוקמת על צינור חרוטי 50 מיליליטר.
  6. למחוק את הרקמה עם מגב משימה עדין ולאחר מכן להעביר אותו לתוך 5 מיליליטר של פתרון טריפסין 0.05%. להשתמש בפינצטה כדי להסיר את הרקמה ממגב המשימה.
  7. דגירה רקמת השריר על קרח למשך 30 דקות ב0.05% פתרון טריפסין.
  8. ספין 15 מיליליטר תערובת טריפסין / שרירים המכילים צינור חרוטי ב XG 200 דקות 3 על 4 מעלות צלזיוס.
  9. יוצקים את supernatant טריפסין לתוך מיכל פסולת וresuspend גלולה עם 3 מיליליטר של קרח IBM1 הקר. העברת הרקמה לצינור homogenizer זכוכית 45 מיליליטר. יש לשטוף את צינור חרוטי 15 מיליליטר עם 1.5 מיליליטר IBM1 אחר כדי לאסוף כל מדגם שנותר ולהוסיף את זה לצינור homogenizer הזכוכית.
  10. מניחים את צינור homogenizer הזכוכית לאמצע מילא מיכל כוס או פלסטיק עם קרח כדי homogenizer הזכוכית נע מינימאלי בתוך הכוס.
  11. Homogenize תערובת הרקמה / IMB1 עם העלי PTFE המצורף לhomogenizer רקמות מנוע מונע עם 10 מסירות ב 80 סל"ד. החזק את החלק התחתון של כל מעבר ל~ 2 שניות.
  12. מעבירים את homogenate הרקמה לצינור 15 מיליליטר חרוטי חדש ולשטוף את צינור homogenizer הזכוכית עם 6.5 מיליליטר של IBM1. יוצקים את IBM1 לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר מכיל homogenate רקמות.
  13. ספין צינור חרוטי 15 מיליליטר ב 700 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בעדינות יוצק את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות חוזק גבוה זכוכית וזורקים את הכדור.
  14. ספין supernatant מהצעד מעל ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  15. הסר את supernatant IBM1 מחדש להשעות את הכדור על ידי הוספת 500 μl של IBM2 לאט. לחתוך את הקצה של קצה פיפטה ועדינות homogenize גלולה בIBM2 עם ערבוב ובחישת תנועות. להוסיף עוד 4.5 מיליליטר של IBM2 לתערובת לאחר גלולה מושעה באופן מלא.
    הערה: הימנע מטחינה דקה מופרזת תוך שבירת חתיכות גלולה גדולות כמו tשלו עלול לגרום נזק לקרומי המיטוכונדריה.
  16. ספין homogenate / רקמת IBM2 ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: שלב זה ניתן לחזור בצינור צנטריפוגות חוזק גבוה נקי לכימות חלבון מדויקת יותר של מיטוכונדריה המבודדת בשלב 4 מאז BSA שייר עשוי לתרום לכלל תכולת חלבון.
  17. הסר את supernatant ועדינות, אבל לגמרי מחדש להשעות את הכדור על ידי הוספת שני 25 מרווחי μl של IBM2 עם קצה פיפטה עם הנקודה שלו מנותק. בעדינות מערבבים ולערבב את הכדור לאחר כל הוספה של 25 μl של IBM2. הנח מניית המיטוכונדריה זה על קרח.

3. Homogenization של כל הפריטים רקמות lysate (זמן: ~ 45 דקות, אפשר לעשות במהלך שלב 7)

  1. הסר את השריר שמהונח בחנקן הנוזלי מצעד 2.3 ודגירה בטמפרטורת חדר עד שהפשיר באופן מלא.
  2. לרכך את הרקמה ל~ 30 שניות על קרח עם מספריים קנס היטה.
  3. להוסיף שני 100 סקופים μl של Zirconium חרוזים אוקסיד לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר עם פקק הברגה מהשלב 3.2 שמכיל רקמה הטחון. Homogenize הרקמות בhomogenizer רקמות טחנת חרוז באמצעות 02:58 5 מחזורי דקות בהגדרת מהירות של 4-6 (הגדרה בינונית).
  4. ספין את התערובת מצעד 3.3 ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant באמצעות קצה פיפטה 1,000 μl לאחר הספין וההעברה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. זורק את הכדור ומניח את supernatant על קרח.

4. קביעת חלבון (זמן: ~ 30 דקות)

  1. קבע את ריכוז החלבון של כל lysate הרקמות (שלב 3.4) ומניית המיטוכונדריה (שלב 2.17) באמצעות ערכת assay חלבון BCA על פי המפרט של היצרן.

5. המיטוכונדריה ממברנה יושרה; ציטראט synthase פעילות (CS) (זמן: ~ 15 דקות)

  1. לעשות שני 1 נפרד: 20 דילולים של מניית המיטוכונדריה במים טוהר גבוהים. לְהוֹסִיף0.1% מטריטון 100-X למדגם אחד וsonicate אותו בעצמה נמוכה (765 ואט, המשרעת של 2). השאר את הדילול האחר על קרח. להחזיר את המדגם לקרח לאחר sonication.
  2. בצע assay synthase ציטראט עם שני שאינו sonicated וsonicated דילולים המיטוכונדריה באמצעות assay spectrophotometric כפי שתואר קודם לכן 11,12.
  3. לקבוע את אחוז קרומי המיטוכונדריה שלמים באמצעות המשוואות הבאות:
    (פעילות CS ללא sonicated ÷ sonicated CS פעילות) * 100


100 N (אחוזים הושגו מלמעלה)

6. איכות בידוד המיטוכונדריה; מערבי סופג (זמן: על פי פרוטוקול מעבדה)

  1. לבצע מערבי סופג בכל lysate הרקמה ומיטוכונדריה המבודדת כפי שתואר לעיל 12.
    הערה: נוגדנים ראשוניים השתמש לGAPDH (1: 1,000 דילול ב 5% BSA / TBS-T) וCOXIV (1: 1,000 דילול ב 5% דל שומןחלב / TBS-T) ואחריו האנטי-עז, ונוגדנים משני ארנב, בהתאמה (1: 10,000).

7. Respirometric Assay הפעלה (זמן: ~ 90 דקות)

  1. לבצע מבחני respirometric רצויים באמצעות טכנולוגית microplate מבוססת O 2 צריכת מדידה כפי שתואר לעיל (ראה מאמר נלווה ורוג'רס ואח '8).
  2. לקבוע את יחס שליטה בדרכי הנשימה (RCR) על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי המדינה 4O (RCR) או חלוקת 3U מדינה על ידי 4O המדינה. השתמש באחת נקודת האמצע (ממוצעת), או (3 המדינה) הגבוהה ביותר ומחירים נמוכים (4O מדינה) מעקבות נקודה לנקודה בעת קביעת RCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פעילות synthase ציטראט משמשת כמדד לשלמות קרום מאז synthase ציטראט ממוקם בקרום המיטוכונדריה הפנימי, ובכך לא צריך להיות נוכח במתלים של המיטוכונדריה עם קרומים. איור 1 מייצג פעילות synthase ציטראט בדגימות של המיטוכונדריה-sonicated הלא לעומת sonicated דגימות מאותו הבידוד. Sonicating תוצאות מיטוכונדריה בעלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בפעילות synthase ציטרט (P <0.01). חשוב לציין, 92.5 ± 2.0% של המיטוכונדריה היו שלמים הבאים הבידוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטות שהוצגו במסמך זה מספקים תיאור מפורט של הליך בידוד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות (~ 75-100 מ"ג) של שריר שלד עכבר. הליך בידוד זה מסוגל להניב בתפקוד גבוה, מיטוכונדריה הטהורה (~ 450 מיקרוגרם) כפי שמעיד O 2 שיעורי הצריכה, ערכי RCR, פעילות synthase ציטראט מקסימלי וביטוי חלבון מimmunoblotting. חשוב לציין, מיטוכונדריה מבודדת מהליך זה יכול לשמש למבחני respirometirc מרובים עם טכנולוגית microplate מבוססת O 2 הצריכה המאפשרת לתפוקה גבוהה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ג'ורג' רוג'רס הוא עובד של Seahorse Bioscience המייצרת את המכשיר שעבורו שונה פרוטוקול זה.

תודות

מכון המחקר למדעי החיים פרלין וליבת הפנוטיפינג המטבולי בווירג'יניה טק תמכו בעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בעיקרו שומניסיגמא אולדריץ'A6003N/A
ללא חומצה- BSA
Tris/HClPromegaH5123N/A
KCLSigma AldrichP9541N/A
Tris BasePromegaH5135N/A
EDTASigma AldrichE6511N/A
EGTASigma AldrichE4378N/A
סוכרוזSigma AldrichS7903N/A
D-MANNITOLSigma Aldrich63559N/A
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםThermo Scientific25200-056N/A
נתרן כלורי
גבישים לבנים או אבקה גבישית
≥ 99.0		Fisher ScientificBP3581N/A
נתרן דודציל סולפטSigma AldrichL3771 לא ישים
נתרן דאוקסיכולאטסיגמא אולדריץ'D6750 לא ישים
פוליאוקסיאתילן (12) אתר נונילפניל, מסועףסיגמא אולדריץ'238651N/A
סכיני גילוח חד צדדייםפישר סיינטיפיק12-640N/A
Falcon- 100 uM מסנני תאי ניילוןפישר סיינטיפיק352360N/A
עצור פרוטאז & מעכב פוספטse קוקטיילThermo Scientific1861284N / A
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה עם מכסה בורגThermo Scientific3474N/A
חרוזי תחמוצת זירקוניוםפישר סיינטיפיקC9012112נוגדן N/A
GAPDH (1D4)Santa Cruz Biotechnologysc-59540N/A
Anti- COXIV נוגדניםאיתות תאים4844sכל חלבון ממברנה פנימית מיטוכונדריאלית יספיק
חמור מצומד פרוקסידאז, אנטי ארנב IgG (H+L)Jackson ImmunoResearh711-035-152/A
פרוקסידאז מצומד affinipure עז, אנטי עכבר IgG (H+L)Jackson ImmunoResearh115-001-003N/A
Triton-X100Sigma AldrichX100N/A
Pierce BCA ערכת בדיקת חלבון Thermo Scientific23225N/A
חומצה פירובית, 98%Sigma Aldrich107360חנות ב-4 מעלות; C, pH עד 7.4 עם KOH לפני השימוש בבדיקה רספירומטרית
חומצה סוקסיניתSigma AldrichS9512יש לאחסן בטמפרטורת החדר, pH עד 7.4 עם KOH לפני השימוש בבדיקה ספיררומטרית
L(-) חומצה מאלית, BioXtra, ≥ 95%Sigma AldrichM6413יש לאחסן בטמפרטורת החדר, עד 7.4 עם KOH לפני השימוש בבדיקה רספירומטרית
L-Glutamic acidSigma AldrichG1251יש לאחסן בטמפרטורת החדר, עד 7.4 עם KOH לפני השימוש בבדיקה ספירומטרית, עד 7.4 עם KOH לפני השימוש בבדיקה
פלמיטואיל L-קרניטין כלורידסיגמא אולדריץ'P1645יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס
אוליגומיצין A, ≥ 95% (HPLC)Sigma Aldrich75351חנות ב-20 מעלות; C
קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)Sigma AldrichC2920חנות ב-2-8 מעלות; C
פנילהידרזון
≥ 98% (TLC), אבקה [FCCP]
אנטימיצין A מסטרפטומיצס sp.חנות סיגמא אולדריץ'A8674ב -20 מעלות; C
אדנוזין 5′-דיפוספט מונופוטסיום מלח מיובש [ADP]Sigma AldrichA5285יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, עד 7.4 עם KOH לפני השימוש בבדיקה
RotenoneSigma AldrichR8875אחסן בטמפרטורת החדר
% N ספירומומטרית ספירומטרית

מקורות

  1. Brand, M., Nicholls, D. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, 297-312 (2011).
  2. Nicholls, D. G., Ferguson, S. Bioenergetics. , Academic Press. (2013).
  3. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148, 1145-1159 (2012).
  4. Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. The mitochondrial genome in aging and senescence. Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).
  5. Dube, J. J., et al. Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).
  6. Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells. Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).
  7. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).
  8. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PloS one. 6, e21746(2011).
  9. Guarino, R. D., et al. Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration. Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).
  10. Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).
  11. Hulver, M. W., et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab. 2, 251-261 (2005).
  12. Frisard, M. I., et al. Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).
  13. Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).
  14. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. JoVE. , (2011).
  15. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).
  16. Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization. J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).
  17. Asmann, Y. W., et al. Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia. Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).
  18. Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western Blot

מאמרים קשורים