מאמר שיטה

לומד קהילות חיידקים In vivo: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח קנדידה אלביקנס ו Pseudomonas aeruginosa באיירווייס

DOI:

10.3791/53218

⸱

13 בינואר 2016

 ,  ,  ,  , 
1Recherche translationnelle: relations hôtepathogènes, Université Lille

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעוד שמחקר במבחנה של אינטראקציות מארח-פתוגן מאפשר אפיון של תגובות חיסוניות ספציפיות, מודלים in vivo נדרשים כדי להתבונן בהשפעות של תגובות מורכבות. באמצעות חשיפה לקנדידה אלביקנס ואחריה זיהום ריאות בתיווך Pseudomonas aeruginosa, הקמנו מודל עכברי של אינטראקציות מיקרוביאליות המעורבות בפתוגניות של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לימוד אינטראקציה מארח הפתוגן מאפשר לנו להבין את המנגנון הבסיסי של פתוגניות במהלך זיהום חיידקים. הפרוגנוזה של המארח תלוי במעורבות של תגובה חיסונית מותאמת נגד הפתוגן 1. תגובה חיסונית היא מורכבת ותוצאות מהאינטראקציה של פתוגנים וכמה סוגים חיסוניים תאיים או אי-חיסון 2. מחקרים במבחנה לא יכולים לאפיין אינטראקציות אלה ולהתמקד באינטראקציות תא-הפתוגן. יתר על כן, בדרך הנשימה 3, במיוחד בחולים עם מחלת ריאות כרונית מוגלתית או בחולי מאוורר מכאני, קהילות polymicrobial נמצאים ולסבך אינטראקציה מארח הפתוגן. אלביקנס Pseudomonas aeruginosa וקנדידה שניהם הבעיה פתוגנים 4, לעתים קרובות מבודדת מדגימות tracheobronchial, ו קשורים לזיהומים חמורים, במיוחד ביחידה לטיפול נמרץ 5. יש אינטראקציות חיידקיםדווח בין פתוגנים אלה במבחנה, אך ההשפעה הקלינית של אינטראקציות אלה נותרה 6 לא ברורים. כדי לחקור את יחסי הגומלין בין C. אלביקנס ופ aeruginosa, מודל עכברי של ג קולוניזציה אלביקנס דרכי הנשימה, ואחריו פ דלקת ריאות חריפה בתיווך aeruginosa- בוצעה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של בעלי חיים, בעיקר עכברים, נעשו שימוש נרחב כדי לחקור את תגובה חיסונית נגד פתוגנים. למרות חסינות מולדת ונרכשת שונה בין מכרסמים ובני האדם 7, הקלות בגידול והפיתוח של knockouts לגנים רבים, להפוך עכברי מודל מצוין ללמוד תגובות חיסוני 8. התגובה החיסונית היא מורכבת ותוצאות מהאינטראקציה של הפתוגן, (תאי האפיתל, תאי האנדותל) צמחיית תושב חיידקים וכמה (לימפוציטים, נויטרופילים, מקרופאגים) חיסוניים ואינם חסינים סוגים סלולריים 2. במבחנה אינה מאפשרות התבוננות אינטראקציות המורכבות אלה ומתמקדים בעיקר באינטראקציות התא-פתוגן ייחודיים. בעוד מודלים של בעלי חיים יש להשתמש בזהירות ובמוגבלת לשאלות מאוד ספציפיות ורלוונטיות, מודלים עכבר מספקים תובנה טובה לתגובה החיסונית יונק in vivo ויכולים להתייחס לחלקים של שאלות קליניות חשובות 7.

"Jove_content"> בדרכי הנשימה, קהילת החיידקים היא מורכבת שיוך מספר גדול של מיקרואורגניזמים שונים 6. בעוד מה שמהווה Microbiome "נורמלי" בדרכי נשימה עדיין לא נקבע, קהילות תושב לעתים קרובות polymicrobial, ומקורן ממקורות אקולוגיים מגוונים. חולים עם מחלת ריאות כרונית מוגלתית (סיסטיק פיברוזיס, bronchectasis) או חולי מאוורר מכאני התערוכה צמחייה מסוימת בשל התישבות של דרכי הנשימה על ידי מיקרואורגניזמים לסביבה שנרכשו-9. אלביקנס Pseudomonas aeruginosa וקנדידה שניהם הבעיה פתוגנים 5, לעתים קרובות מבודדת יחד מדגימות tracheobronchial , ואחראי לזיהום אופורטוניסטי חמור בחולים אלה, במיוחד ביחידה לטיפול הנמרצת (ICU) 4.

בידוד של מיקרואורגניזמים אלה בדלקת ריאות חריפות בתוצאות טיפול נמרץ בטיפול אנטי-מיקרוביאלי נגד פ aeruginosa בשמרי ut בדרך כלל לא נחשבים פתוגניים באתר זה 5. במבחנה אינטראקציות בין פ aeruginosa וג אלביקנס כבר דווח בהרחבה, והראה כי מיקרואורגניזמים אלה יכולים להשפיע על הצמיחה וההישרדות של אחד את השני, אבל מחקרים לא הצליחו להסיק אם נוכחותם של ג אלביקנס הוא מזיק או מועיל למארח 10. מודלים העכבר פותחו כדי לטפל בזה רלוונטי של פ aeruginosa וג אלביקנס in vivo, אבל האינטראקציה בין מיקרואורגניזמים לא הייתה נקודת המפתח. ואכן, המודל הוקם כדי להעריך את מעורבותו של ג אלביקנס בתגובה מארח חיסוני, ותוצאה.

דגם קודם שנקבע על ידי רו et al כבר השתמש התישבות ראשונית עם ג אלביקנס אחרי דלקת ריאות חריפה הנגרמת על ידי פ ' aeruginosa. שימוש במודל שלהם, החוקרים מצאו תפקיד מזיק של prior ג אלביקנס קולוניזציה 11. עם זאת רו et al משמש עומס גבוה של ג אלביקנס במודל שלהם עם 2 x 10 6 CFU / עכבר במהלך 3 ימים רצופים. הקמנו מודל 4 ימים של ג קולוניזציה בדרכי הנשימה אלביקנס, או בהתמדה לפחות ללא פגיעת ריאות, במודל זה ג אלביקנס אוחזר עד 4 ימים לאחר החדרה יחידה של 10 5 CFU לכל עכבר (איור 2) 12,13. לאחר 4 ימים, אין עדות לגיוס דלקתי תא, ייצור ציטוקינים דלקתי ולא נזק אפיתל נצפתה. ב24 - 48 שעות, בנוכחות השיא של ג אלביקנס, למרות שתגובה חיסונית מולדת סלולרית וציטוקינים נצפתה, לא היה עדות לפגיעת ריאות. באופן מפתיע, עכברים וכך יישבו עם ג אלביקנס 48 שעות לפני intranasal החדרה של פ aeruginosa שנחלש זיהום בהשוואה לעכברים עם פ זיהום aeruginosa לבד. אניndeed, עכברים הציגו פציעת ריאות פחותה וירידה בניטל חיידקי 12,13.

כמה השערות יכולות להסביר השפעה חיובית זו של התישבות מוקדמת עם ג אלביקנס על פ aeruginosa בתיווך דלקת ריאות חריפה. ראשון, שיחה בין-interspecies מעורב כל מיקרואורגניזמים מערכות חישת מניין, פ מבוסס homoserinelactone מערכת aeruginosa וג מבוסס פרנסול מערכת אלביקנס, הוערכה. שנית, ג אלביקנס פועל כמטרה "דמה" לפ aeruginosa הסטת הפתוגן מתאי האפיתל ריאות נחקר. שני ההשערות ביטלו (נתונים שלא פורסמו). ההשערה השלישית הייתה של "תחול" של מערכת החיסון המולדת על ידי ג אלביקנס האחראי לתגובה מולדת הבאה משופרת נגד פ aeruginosa. ההשערה האחרונה זו אושרה. אכן ג קולוניזציה אלביקנס הובילה ליחול חסינות מולדת throuGH IL-22, בעיקר מופרש על ידי תאי הלימפה מולדים, וכתוצאה מכך אישור חיידקים גדל ומופחת פגיעת ריאות 12.

לסיכום, המארח הוא שחקן מרכזי ביחסי הגומלין בין מיקרואורגניזמים ויסות התגובה חיסונית המולדת ומעורבים סוגי תאים דלקתיים שונים. בעוד שניתן גזור אינטראקציות חיסוני המורכבות אלה במבחנה ניתן לספק השערות הראשוניות רק על ידי מתאים בדגמי vivo. הפרוטוקול הבא מספק דוגמא למחקר vivo של אינטראקציה הפתוגן בתיווך מארח שעשוי להיות מותאם למייקרו-אורגניזמים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוועדה המחוזית האתיקה האזורית לניסויים בבעלי החיים אישרה בשיטה זו, בהתאם לטיפול בבעלי חיים לאומי ובינלאומי ושימוש בקווי מנחים מחקר ניסיוניים.

אוסף 1. לדוגמא

  1. אחסון מדגם
    1. לאסוף את כל הדגימות ומייד לאחסן ב-- 20 מעלות צלזיוס או על קרח עד אחסון במקפיא, כדי למנוע הידרדרות. הנח פוספט סטרילי שנאגרו (PBS) על קרח כדי לשפר lavages סימפונות מכתשי ביצועים (BAL).
  2. כִּירוּרגִיָה
    1. לעקר את כל הציוד כירורגי באמצעות החיטוי.
      הערה: במידת האפשר, מומלץ להשתמש בשתי קבוצות שונות של מכשירים לצעדי בטן ובית חזה, כדי למנוע זיהום צולב. ציוד לנתיחה חובה מפורט באיור 4 א

2. עכברים, זני חיידקים ושמרים

  1. עכברי בית בעמידה בשימוש מקומי של בעלי חיים מחדשהנחיות ועדת איתור במעמד מאוורר ללא עולה על 5 עכברים לכלוב, במזון ובמים lib מודעה, במתקן דיור ברמת בטיחות ביולוגית 2 עקב השימוש של 2 מיקרו-אורגניזמים ברמת בטיחות ביולוגית: פ aeruginosa וג אלביקנס.
  2. שמור את זני החיידקים ב -80 ° C ב -40% בינוניים גליצרול.
    1. להוסיף חיידקים ישירות ממניות קפוא לתוך צינור תרבות המכיל 3 מיליליטר של המרק לוריא-Bertani סטרילי באמצעות חיסון לולאת 10 μl. השאר O ​​/ N ב 37 מעלות צלזיוס עם (סל"ד 400) רועד מסלולית היום לפני החדרה.
    2. חיידקי קציר על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות.
    3. לשאוב supernatant לסילוק פסולת הביולוגי מסוכן סגור מתאים. שים לב גלולה חסיד לבנה בחלק התחתון של צינור התרבות.
    4. לשטוף ולהשעות את גלולה באמצעות 5 מיליליטר של PBS.
    5. חזור על השלבים 2.2.2 ל2.2.3 בפעם שנייה כדי לבצע שטיפה שנייה.
    6. Resuspend חיידקי pelleted באמצעות 1 מיליליטר של PBSוvortexing הקצר.
    7. לקבוע את צפיפות הבידוד באמצעות מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר באמצעות מד צפיפות אופטי. צפיפות של 0.9 מתאים 10 9 CFU / ml לPAO1, לדלל בהתאם.
      הערה: תוצאה זו יש כדי להתקבל לכל זן בשימוש על ידי קביעת צפיפות של דילולים רצופים של הבידוד מכויל.
    8. ודא הבידוד על ידי דילולים לוגריתמים סידוריים וצלחת של דילול כל 100 μl על bromocresol צלחות אגר סגול (BCP) ותרבות O / N. לנהל כל עכבר 50 intranasally μl של התמיסה המכילה 1 x 08-02 אוקטובר x10 8 CFU למ"ל (5 x 06-01 אוקטובר x10 7 CFU לכל עכבר).
  3. השימוש ג אלביקנס SC5314 כזן התייחסות. לשמר את המתח ב- 40% בינוניים גליצרול ב -80 ° C.
    1. תוספת מרק שמרים-Peptone דקסטרוז עם אמיקצין 0.015%, כדי למנוע זיהום בקטריאלי ולהקל ספירה נוספת.
    2. להוסיף שמרים באמצעות 10 ו# 181; חיסון לולאת l לYPD-מרק מוכן להשלים עם O אמיקצין / N על 37 מעלות צלזיוס.
    3. שמרי קציר על ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות.
    4. הסר supernatant לסילוק פסולת bioharzard מתאים. גלולה חסיד לבנה יש לשים לב שבתחתית צינור התרבות.
    5. לשטוף ולהשעות את חיידקי pelleted באמצעות 5 מיליליטר של PBS וvortexing הקצר.
    6. חזור על השלבים 2.2.2 ל2.2.3 בפעם שנייה כדי לבצע שטיפה שנייה.
    7. Resuspend גלולה באמצעות 1 מיליליטר של PBS וvortexing הקצר.
    8. לקבוע את הגודל של הבידוד על ידי סומך על hematocytometer Mallassez באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי ב40X הגדלה.
      הערה: ריכוז (בCFU / ml) מתקבלת באמצעות הנוסחא הבאה: (מספר השמרים x 10 5) / (מספר המלבנים רשת לספור על hematocytometer Mallassez).
    9. ודא ידי דילול לוגריתמים סידורי 10 -5 ו -10 -6 לאשר פתרון המכיל 2 x 10 6 CFU / ml.
    10. צלחת על צלחות אגר YPD בתוספת אמיקצין 0.015%.

3. איירווייס התיישבות על ידי ג אלביקנס

הערה: לאחר הסתגלות סביבתית, עכברים הם שקלו פעמיים ביום.

  1. מתחת למכסת מנוע קטר, 500 μl הפקדת sevoflurane על 4 סנטימטרים X 4 סנטימטר גזה (טכניקה פתוחה שחרר) 14.
    1. מייד למקם את הגזה על הרצפה של תא כ 750 מיליליטר אינדוקציה. מייד למקם את הפלטפורמה העלתה רשת מעל הגזה, כדי למנוע מגע ישיר בין בעלי החיים והגזה.
    2. סגירת מכסה אטום ולחכות 1 עד 2 דקות, כדי לאפשר דיפוזיה של sevoflurane בתא.
    3. העבר את העכבר מכלוב לרשת פלטפורמה וקרובה מיכסה. הרדמה אור עם נשימה ספונטנית שימור צריכה להיות מושגת ב30 עד 45 שניות.
    4. לפקח על hypotonia על ידי התבוננות אובדן ליישר רפלקס שבו נקודת העכבר ניתן להסיר FROM התיבה והחדיר.
  2. החדרת intranasal (ניתן לבצע בשניות 10 על ידי מפעיל מיומן).
    1. החזק את העכבר אחד בידיים שוכנות על גבה זקוף (איור 4).
    2. בעזרת אצבע, תומך בראש ולהשתמש באגודל כדי לשמור על הלסת סגורה כדי למנוע יריקה (איור 4C).
    3. כפי שתואר בשלב 2.3.8, להבטיח כי ג מוכן פתרון אלביקנס מכיל 2 x10 6 CFU למ"ל לμl 50 החדיר נפח.
      הערה: הנקודה הקריטית השנייה היא הנפח החדיר. נפח נמוך מ -50 μl עלול לגרום לקולוניזציה מספיקה או החדרת הומוגניות של דרכי הנשימה, נפח גדול יותר עלול לגרום לטביעה / חנק ומוות.
    4. להחדיר את העכבר תוך מאנפף ידי מתקרב פיפטה לנחיריים.
    5. פיפטה ירידה של 50 μl יוצרת בועה המכילה את הפתרון בנחיריים, בשאיפה לאחר מכן על ידי spontaneouslעכבר נשימת y.
    6. מקום עכבר באזור התאוששות (למשל, כלוב חשוף מוגזים היטב גדול עם מנורת חימום מעל). עכברים חייבים להיות במעקב עד התעוררות מלאה. אל תשאיר חיה ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור על כיבה sternal ורפלקס ליישר. בשלב זה, העכבר ניתן להחזיר לכלוב דיור רגיל.

4. פ הזיהום חריף ריאות -induced aeruginosa

הערה: עכברים הם שקלו במהלך ארבעה הימים הבאים. בדרך כלל, עכברים לעלות במשקל במהלך ג קולוניזציה תיווך אלביקנס בדרכי הנשימה (איור 2 א).

  1. הכן את ההשעיה מכילה פ aeruginosa היום של החדרה לאחר O / צמיחת N (סעיף 2.2).
  2. הרדימי בקצרה באמצעות שאיפת sevoflurane כפי שתואר לעיל (סעיף 3.1).
    הערה: כדי לבצע דלקת ריאות חריפה, מומלץ נטל חיידקים הם הציעו בטבלת 1.
  3. להחדיר את העכבר כפי שתואר לעיל (סעיף 3.2) עם תשומת לב מיוחדת להתאוששות שלאחר החדרה.

5. מדוד של ריאות פגיעה אינדקס

  1. הכן תמיסה המכילה אלבומין FITC שכותרתו. הזרק פתרון HR 2 זה לפני המתת חסד של בעלי החיים.
    1. שוקל 0.2 מ"ג של אלבומין-FITC עם הציוד המתאים.
    2. להוסיף 0.2 מ"ג למ"ל PBS 1. בקצרה מערבולת. אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, למקם את הפתרון בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור הסביבה.
    3. להזריק תוך-peritoneally 200 μl של פתרון אלבומין FITC שכותרתו לכל עכבר.
  2. המתת חסד
    1. לשקול את העכברים לנתונים במשקל האחרונים.
    2. להרדים עכבר אחת בהתאם לשימוש מקומי של בעלי חיים בהנחיות ועדת מחקר באמצעות זריקה אחת תוך הצפק ממנת יתר קטלני של pentobarbital: 300 μl של pentobarbital 5.47%.
    3. הסר עכבר מהכלוב ומקבל lהזרקת ethal על ידי מפעיל.
    4. לאחר הזרקה, להעביר את העכבר לבד לכלוב אחר, נסתר מכל בעלי חיים אחרים. שים לב לעכבר עד היעדר התנועה. מוות הוא לאשר בהיעדר התנועה, תנועה במיוחד בדרכי הנשימה, חוסר הדופק.
    5. לבצע איסוף של דגימות כירורגית על חיות מתות, ולכן ללא הרדמה ולא משככי כאבים.
  3. אוסף כירורגי מדגם: שלב בית חזה.
    הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים, כל הניתוח מתבצע תוך שימוש בציוד סטרילי בסביבת רמת בטיחות ביולוגית 2.
    1. החל אתנול לעור. לבצע חתך בעור קו האמצע מעצם החזה ועד אמצע בטן עם מספריים. לַחתוֹך קו האמצע לאורך בית החזה משני הצדדים. מקפלים בחזרה את העור בכל צד של בית החזה כדי להמחיש את כלוב הצלעות.
    2. בצע חתך אנכי של בית החזה משני הצדדים הולכים לכיוון עצם הבריח כדי שתוכל להישען על קיר החזה הקדמי כולו עם שטרןאממ מאפשר הדמיה המושלמת של לב וריאות (איור 5 א, 5).
    3. איסוף דם באמצעות מזרק מראש heparined על ידי ניקוב הלב ליד עורק interventricular. למשוך מינימום של 500 μl להשיג פלזמה לפחות 100 μl. מניחים את דגימת הדם על קרח.
    4. לבצע חתך בצוואר הרחם קו האמצע כדי להמחיש את קנה הנשימה (איור 5 ב ו -5 ג). זהירות לנתח את fascia סביב קנה הנשימה. מניחים תפר מאחורי קנה הנשימה (איור 5 ג ו5D). בהמשך לכך התפר ייסגר סביב מחט cannulating כדי להבטיח שטיפה נאותה.
    5. קטטר קנה הנשימה באמצעות מחט 20-G שונה gavage (איור 5D ו4A). לקשור קשר כירורגית סביב קנה הנשימה cannulated עם התפר ממוקם בעבר.
    6. כדי לבצע lavages רונכואלוואולרית (BAL), בעדינות ובהדרגה להזריק ולצייר 500 μl של PBS קר כקרח ל/ מהריאות. מניחים את המדגם עלייce להימנע תמוגה הסלולרית.
    7. חזור על שלב 5.3.6, 3 פעמים כדי לקבל סך של 1,500 דגימות μl נוזל BAL ושטיפת בריכה לתוך צינור צנטריפוגות 2 מיליליטר (איור 5E).
    8. הסר את הריאות מהחזה. הנח קטע ריאה (גודל צריך להתאים למחצית מריאה אחת או אונה) לתוך 1.5 מיליליטר צינור צנטריפוגות ולאחסן במהירות ב-- 80 מעלות צלזיוס.
    9. הנח קטע ריאות בצינור המוליזה שקל מראש המכיל PBS לקבוע נטל חיידקים ולמקם אותו על קרח.
  4. אוסף כירורגי מדגם: שלב בטן.
    1. לבצע חתך נוסף בצד השמאל של הבטן. שים לב לטחול דרך הצפק.
    2. הסר את הטחול ואת המקום לתוך צינור שני המוליזה המכיל 1 מיליליטר PBS ומניחים על קרח.
  5. מדד פציעת ריאות
    הערה: חדירות קרום מכתשי-נימים מוערכת על ידי מדידת FITC שכותרתו-אלבומין דליפה מהתא של כלי הדם למכתשים-interstתא itial.
    1. מדגם צנטריפוגה דם ונוזל BAL במשך 10 דקות ב 1500 x גרם. לאסוף את supernatants לתוך צינורות צנטריפוגות חדשים. כדורים מתאים לתאי פלזמה או BAL גויסו וצריכים להיות ממוקם על קרח.
    2. להוסיף כל supernatant דם (פלזמה, צהובה) או supernatant BAL 100 μl לצלחת 96-היטב שקופה (300 בארות μl). מניחים נייר כסף על הצלחת אם לא נעשה שימוש באופן מיידי.
    3. למדוד את רמות הקרינה בפלזמה וsupernatants BAL באמצעות קורא microplate פלואורסצנטי (עירור, 487 ננומטר; פליטה, 520 ננומטר).
    4. לקבוע את מדד פציעת ריאות על ידי חישוב יחס הקרינה [(supernatant supernatant / דם BAL) x 100].
  6. ספירת רונכואלוואולרית שטיפה (BAL) תא ההפרש.
    הערה: השתמש בתא גלולה שהתקבל מצנטריפוגה של נוזל BAL בשלב 5.5.1.
    1. במידת הצורך, להשתמש במאגר תמוגה האדום-תא. הוסף 500 μl של חיץ תמוגה אדום תאים לתוך צינור צנטריפוגות מכיל celגלולה l. מערבולת ובקצרה להשאיר 10 דקות על קרח. הוסף 500 μl PBS להפסיק תמוגה האדום-תא.
    2. קציר תאים על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב 1500 x גרם. הסר supernatant ולהשעות את התא גלולה ל1 מיליליטר של PBS סטרילי. ספירת תאים בhematocytometer Mallassez. באמצעות hemacytometer לספירת תאים. להתרכז תאים בשקופית עם cytospin.
    3. תאי כתם באמצעות ערכת צבעים המאפשרת זיהוי וספירת תאים (מקרופאגים, לימפוציטים, נויטרופילים).
  7. נטל חיידקי ריאות והפצת חיידקים
    הערה: כדי להעריך נטל ריאות חיידקית והפצת חיידקים, ריאות וטחול נאספו בהתאמה ומאוחסנות לתוך צינורות המוליזה-שקל מראש המכילים 1 מיליליטר של PBS (צעד 5.3.9).
    1. לשקול צינורות המוליזה המכילים 1 מיליליטר PBS וגם ריאות או טחול. Homogenize הדגימות עם homogenizer רקמות להשיג homogenates ריאות והטחול homogenates.
    2. הפקדה של הומו רקמה 100 μlgenates לתוך צינורות צנטריפוגה המכילים 900 μl של PBS סטרילי כדי להשיג דילולים לוגריתמים סידוריים.
    3. צלחת שתי דוגמאות האחרונות המתאימות מדוללות (10 -3 ו -10 -2) משני BCP-אגר לפ aeruginosa או YPD-אמיקצין-בתוספת אגר לג אלביקנס ריאות ונחישות נטל טחול.
    4. דגירה צלחות O / N על 37 מעלות צלזיוס. למחרת, למנות את המושבות על צלחות.
    5. מדד התוצאה למשקל ריאות להשיג CFU לגרם של ריאות. גודל מדגם ריאות הם לא אותו הדבר, התוצאה היה צריך לבוא לידי ביטוי בCFU לגרם של ריאות.
      נוסחה למדד היא: [CFU] x [משקל של צינור המוליזה וריאות] - [משקל של צינור המוליזה].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שניתן לראות בעבר בתיאור הפרוטוקול, הניסוי צריך 5 ימים כדי להשלים (איור 1: ציר זמן ניסוי). מפעיל אחד שידל במשך כל הריצה של הניסוי ויכול להתמודד עם התהליכים עד למקסימום של 10 עכברים. אם יותר בעלי חיים נדרשים, שני אנשים נדרשים במיוחד עבור אוסף מדגם כירורגית. ואכן כל הדגימות יש לאסוף בתחת 2 שעות, כדי למנוע דליפת מכתשי-נימים פסיביות מוגברת של אלבומין FITC שכותרתו בעכברים שעבר.

הצעד הראשון הוא הכנת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודלים של בעלי חיים, במיוחד יונקים, שימושיים להבהיר מנגנונים מורכבים של אינטראקציה מארח הפתוגן בתחומי חסינות. כמובן, את הצורך במידע זמין רק ממודלים של בעלי החיים חייבים להיות חיוני; אחרת, שימוש בבעלי החיים חייב להיות מוחלף על ידי מודלים במבחנה. מודל חיה זה ממחיש את תובנה שיכולה להינתן רק על ידי מודל חיה מאז האינטראקציה בין פתוגנים מתווכת על ידי תגובת מארח מרובה רכיבים. עכברים המשמשים כיום ללמוד אינטראקציה מארח הפתוגן זה הם צעירים בגילים 6 עד 10 שבועות עם תגובה חיסונית בוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לאוניברסיטת ליל ולמכון פסטר של ליל, ובמיוחד לתיירי שאסאט וז'אן-פייר דקאוול, האחראים על שיכון, גידול בעלי חיים, בטיחות וגידול. עבודה זו נתמכה על ידי "Société de Pathologies Infectieuses de Langue Française" (SPILF).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Sevorane, SevofluraneAbott05458-02בקבוק פלסטיק 250 מ"ל
קורא פלואורסצנטי Mithras  LB940Berthold Technologiesהפניה בטור הראשוןאין תגובה
Bromo-cresol agar סגולBiomerieux4302120x ליחידה
Pentobarbital sodique 5.47%CEVA6742145100 מ"ל בקבוק פלסטיק
שסתום דו-ראשי Distrimed92831אין תגובה
לולאת חיסון סטרילית 10 ומיקרו; lDutscher10175x1,000 מזרקי
אינסולין 1 מ"לDutscher30003לכל 100 מיזוג
2 מצבים צינור תרבית 8 מ"לDutscher64300אין תגובה
Ultrospec 10 ג'נרל אלקטריק מדעי החיים80-2116-30אין תגובה
צינורות המוליזה 13 x 75 מ"מ GosselinW1773Xלכל 100
PBS - טכנולוגיות חיים מלוחים עם חוצץ פוספט10010023ארוז ב-500 מ"ל
אמיקאצין 1 גרםMylan62516778ל-10 
הפרין 10,000 UI ב 2 מ"לPan pharma912870110x ליחידה
ערכת צביעה RAL 555RAL Diagnostics3615503 פלקונים של 100 מ"ל
1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגהSarstedt55.526.006x 1000
שקוף 300 ומיקרו; l צלחת 96 בארותSarstedt82 1581500אין תגובה
Yest-peptone-Dextrose מרקסיגמא95763באבקה
FITC-אלבומיןסיגמאA9771באבקה
מרק לוריא ברטאניסיגמאL3022באבקה
25 מד מחטTerumo או unisharpA231x 100 מיזוג
ציטוצנטריפוגהThermo ScientificA78300003תגובה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Casadevall, A., Pirofski, L. -A. The damage-response framework of microbial pathogenesis. Nat. Rev. Micro. 1 (1), 17-24 (2003).
  2. Eddens, T., Kolls, J. K. Host defenses against bacterial lower respiratory tract infection. Curr. Opi. Immunol. , (2012).
  3. Beck, J. M., Young, V. B., Huffnagle, G. B. The microbiome of the lung. Translational research : J. Lab. Clin Med. 160 (4), 258-266 (2012).
  4. Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas-Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
  5. Nseir, S., Ader, F. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans: do they really need to stick together. Crit. Care Med. 37 (3), 1164-1166 (2009).
  6. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat. Rev. Micro. 8 (1), 15-25 (2010).
  7. Gibbons, D. L., Spencer, J. Mouse and human intestinal immunity: same ballpark, different players; different rules, same score. Mucosal Immunol. 4 (2), 148-157 (2011).
  8. Ariffin, J. K., Sweet, M. J. Differences in the repertoire, regulation and function of Toll-like Receptors and inflammasome-forming Nod-like Receptors between human and mouse. Curr. Opi. Micro.. , (2013).
  9. Slutsky, A. S., Ranieri, V. M. Ventilator-Induced Lung Injury. NEJM. 369 (22), 2126-2136 (2013).
  10. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).
  11. Roux, D., Gaudry, S., et al. Candida albicans impairs macrophage function and facilitates Pseudomonas aeruginosa pneumonia in rat. Crit. Care Med. 37 (3), 1062-1067 (2009).
  12. Mear, J. B., Gosset, P., et al. Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response. Infect. Immun. 82 (1), 306-315 (2013).
  13. Ader, F. Short term Candida albicans colonization reduces Pseudomonas aeruginosa load and lung injury in a mouse model. Crit. care. , 1-33 (2009).
  14. Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).
  15. Stover, C. K., Pham, X. Q., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
  16. Boutoille, D., Marechal, X., Pichenot, M., Chemani, C., Guery, B. P., Faure, K. FITC-albumin as a marker for assessment of endothelial permeability in mice: comparison with 125I-albumin. Exp. Lung Res. 35 (4), 263-271 (2009).
  17. Faure, E., Mear, J. -B., et al. Pseudomonas aeruginosa type-3 secretion system dampens host defense by exploiting the NLRC4-coupled inflammasome. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (7), 799-811 (2014).
  18. Peleg, A. Y., Hogan, D. A., Mylonakis, E. Medically important bacterial-fungal interactions. Nat. Rev. Micro. 8 (5), 340-349 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vivo

מאמרים קשורים