מאמר שיטה

שיבוש אנטי-ארסי של Biofilms פתוגניים באמצעות Lactonases תכנון הנדסי Quorum-מרווה

DOI:

10.3791/53243

⸱

1 בינואר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, 2Department of Chemistry, University of Utah, 3Synthetic Biology Research Consortium, National University of Singapore

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנזימים מרווה מניין הם אפשרויות אנטי-אלימות ואנטי-בקטריאליות שיכולות להפחית פתוגנזה ללא סיכון ליצירת עמידות, על ידי מניעת ביטוי של גורמי אלימות וגנים הקשורים לעמידות לאנטיביוטיקה והיווצרות ביופילם. במחקר זה, אנו מדווחים על שיטה המדגימה את יעילותם של אנזימים מרווים מניין בשיבוש ביופילם חיידקי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הופעתם המהירה של חיידקים עמידים לתרופות מרובות האיצה את הצורך בגישות טיפוליות חדשות כדי להתמודד עם זיהומים מסכני חיים. התמדה של זיהום חיידקי קשורה לעתים קרובות להיווצרות ביופילם בתיווך חישת מניין. לפיכך, השיבוש של מעגל איתות זה מציג אסטרטגיה אטרקטיבית נגד אלימות. לקטונאזות מרוות מניין דווחו כמשבשים יעילים של מעגלי חישת מניין. עם זאת, היו מעט מאוד דיווחים על שימוש יעיל באנזימים אלה בשיבוש היווצרות ביופילם חיידקים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לשיבוש היווצרות ביופילם בזן A. baumannii S1 רלוונטי מבחינה קלינית באמצעות שימוש בלקטונאז מהונדס מרווה מניין. Acinetobacter baumannii הוא פתוגן אנושי עיקרי המעורב בזיהומים חמורים הנרכשים בבתי חולים ברחבי העולם והאלימות שלו מיוחסת בעיקר לעקשנות הביופילם שלו. הטיפול המהונדס בלקטונאז השיג הפחתה משמעותית של ביופילם A. baumannii S1. מחקר זה הראה גם את האפשרות להשתמש באנזימים מהונדסים למרווה מניין בטיפול עתידי במחלות חיידקיות בתיווך ביופילם. לבסוף, ניתן להשתמש בשיטה כדי להעריך את כשירותם של אנזימים מבטיחים למרוות מניין.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפשרויות טיפול במחלות זיהומיות כבר מסובכות על ידי הגידול המהיר בחיידקים עמיד multidrug כי הם חסינים מפני מגוון רחב של תרופות אנטיביוטיות 1. עם תחלואה גבוהה ושיעורי תמותה מזיהומים בתיווך חיידקים עמידים, יש צורך להסלים תהליכי פיתוח תרופות ו / או לחקור חלופות אנטי בקטריאלי טובים יותר כדי לשפר את האפשרויות טיפוליות. בזמן האחרון, הגישה האנטי-האלימות היא צוברת ריבית נתון את הפוטנציאל שלה במניעת אלימות באמצעות שיטות לא-bactericidal, ומכאן מקלים הסיכונים של מנגנוני התנגדות 2.

מניין החישה היא "מתג ראשי" בארסיות ושיבוש תופעת איתות זה חיידקים הוא שיטה אנטי-אלימות נגד מבטיחה פתוגנזה 3. תחילתה של אלימות דורשת ההצטברות של מולקולות מניין בסביבה תאית לאחר שהגיעה לצפיפות אוכלוסיית חיידקים קריטית. כקווהמולקולות רום מפוזרות בחזרה לתוך המטריצה ​​תאית, מחייב עם קולטנים המקור שלהם מובילה להפעלה של גורמים ארסי כמו גם גנים הקשורים לעמידות לאנטיביוטיקה והיווצרות biofilm 4. בשיבוש כללי, מניין חישה כרוך עיכוב מולקולת מניין ואינטראקציה קולט מבלי להשפיע על מסלולי מטבוליים עיקריים. מכאן, שאין לה שום השלכה ישירה על צמיחה סלולרית. מאז כושר לא נפגעים, יש לחץ בחירה מינימאלי לחיידקים להתפתח ולהשיג התנגדות נגד טיפולים כגון 5. בנוסף, הפרעה מניין חישה יכולה להפריע למנגנוני הגנת חיידקים טבועים, כמו במקרה של היווצרות biofilm, המספקת הגנה מפני חומרים אנטי-בקטריאלי ויארח את תגובה חיסונית.

הערכה היא כי 99% מחיידקים על פני כדור הארץ קיימים במטריצות כמו biofilm-מורכבות, המקנות יתרונות הישרדות חיוניות למיקרואורגניזמים שחיים בתוך המבני ESE 6. יותר מכך, היווצרות של תחומים נייחים אלה היא הסיבה לזיהומים נרכשים בבית חולים מתמשכים והכרוניים ביותר 7. Acinetobacter baumannii היא אחד מגורמי המחלה האנושיים הגדולים שמזוהה עם זיהומים נרכשים בבית חולים העולמיים והארסיות שלה מיוחסת במידה רבה למניין חישה היווצרות biofilm תיווך 8. אנזימים-מרווה מניין שימשו בהצלחה בשיבוש העברת אותות בתיווך מניין על ידי מיקוד קבוצה של תרכובות המכונית lactones -acyl N homoserine (AHLs) המיוצרים על ידי חיידקים גראם-שלילי 9. גם מספר מחקרים הרחיבו את השימוש באנזימים אלה כדי לחסום פתוגנזה של חיידקים באמצעות הפחתת מספרי ביטוי גורם ארסיות ותא בbiofilms 10,11. למרבה הצער, יש עדיין חוסר ההפגנה מוחשית של השימוש היעיל של אנזימי מרווה-מניין נגד היווצרות biofilm ידי חיידקים פתוגנים.מחדש נעשו ניסיונות להשתמש מעכבי מניין (אנלוגים AHL), במקום אנזימי מרווה-מניין, לשבש א היווצרות biofilm baumannii 12. למרות ששיטה זו של שימוש במעכבי מולקולות קטנות היא גישה חוקית, שמירה על הזמינות הביולוגית שלה בשימושים translational יכולה להיות אתגר. להיפך, השימוש באנזימי מרווה-מניין קטליטי יכול לעקוף את הבעיה הזמינות הביולוגית כאנזימים הם נוחים יותר לחוסר תנועה על משטחים של מכשירים ביו-רפואיים להשפעות טיפוליות.

כאן אנו מתארים הערכה של ההשפעות של lactonases מרווה-מניין מהונדס מkaustophilus Geobacillus (GKL) 13 על היווצרות biofilm חיידקים, באמצעות מכתים סגול גביש ומיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר (CLSM). מחקר זה הוא ההפגנה המוצלחת הראשונה של שיבוש biofilm בא רלוונטי קליני זן baumannii S1 באמצעות אנזימי מרווה-מניין. השיטות שתוארובמחקר זה הם שימושיים להערכת יעילותם של אנזימי מרווה-מניין אחרים במאמצי פיתוח טיפוליים שלאחר מכן נגד חיידקים גראם שלילית פתוגניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. קריסטל ויולט Quantitation של ההיווצרות biofilm בא baumannii S1

  1. לגדול תרבות 5 מיליליטר של א ' baumannii S1 במרק Lysogeny (LB) (tryptone 10 גרם / L, 5 גר '/ L תמצית שמרים) על 30 מעלות צלזיוס בחממה רועדת (220 סל"ד) במשך 16 שעות.
  2. התאם את התרבות של א ' baumannii S1 לOD רצוי 600 של 0.8. שימוש בצלחת 96-היטב, לחסן תרבות חיידקים (1: 100 דילול) לLB טרי המכילה 10 μl של אנזים GKL מטוהר (40 מ"ג / מיליליטר); הנפח הסופי של התרבות החדשה הוא 100 μl.
  3. הכן תרבות שליטה, כמו גם; זה לא יכיל כל אנזים. חזור על תנאים דומים ללהניב את המספר הרצוי של משכפל.
  4. מכסה את הצלחת עם מכסה ומניח אותו לתוך מיכל פלסטיק 10 ליטר אטום. דגירה את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לפני בעדינות הסרת התקשורת.
  5. להוסיף בינוני LB הטרי עוד 100 μl להיטב דגירה הצלחת במשך 21 שעות על 30 מעלות צלזיוס.
  6. לאחר התקופה השנייה של דגירה, בעדינות להסיר את כל אמצעי התקשורת. שטוף את תא חיידקי פלנקטון עם מים סטריליים 200 μl. ודא שיש הפרעה מינימאלית בלבד לתאים במהלך כביסה.
  7. להוסיף 1% פתרון סגול גביש 100 μl לכל היטב דגירה במשך 15 דקות ב RT. הסר את הפתרון סגול גביש על ידי שטיפה היטב עם מים סטריליים 200 μl. חזור על לשטוף לעוד פעמיים.
  8. להוסיף 33% חומצה אצטית 100 μl לכל היטב דגירה למשך 15 דקות עם רעד עדין; זה יהיה לפזר את הצבע.
  9. לכמת את כמות biofilm נוצרה על ידי מדידת הספיגה של סגול קריסטל ב 600 ננומטר. כמות סגולה גביש היא פרופורציונלית לסכום של biofilm נוצר.

2. Confocal סריקת לייזר מיקרוסקופית של א ' baumannii S1 Biofilm

  1. לגדול תרבות 5 מיליליטר של א ' baumannii S1 בLB על 30 מעלות צלזיוס בחממה רועדת (220 סל"ד) במשך 16 שעות.
  2. מוֹדָעָהרק התרבות של א ' baumannii S1 לOD רצוי 600 של 0.8. באמצעות μ-צלחת עם תחתית זכוכית 35 מ"מ, לחסן תרבות חיידקים (1: 100 דילול) לLB טרי המכילה 30 μl של אנזים GKL מטוהר (40 מ"ג / מיליליטר); הנפח הסופי של התרבות החדשה הוא 1 מיליליטר.
  3. מכסה את μ-הצלחת עם מכסה ומניח אותו במכל פלסטיק אטום 10 ליטר. דגירה μ-הצלחת על 30 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות לפני בעדינות הסרת התקשורת. הוסף 30 μl של אנזים GKL מטוהר ובינוני טריים, הבאתו להיקף כולל של 1 מיליליטר. דגירה עבור שעות 21 נוספות על 30 מעלות צלזיוס.
  4. חזור על שלב 2.3 ודגירת μ-התבשיל לשעה עוד 24 על 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר את המדיה בעדינות.
  5. הוסף 500 μl של 5 מיקרוגרם / מיליליטר 488 מצומדות- agglutinin אלכס Fluo נבט חיטה (WGA) מומס בתמיסת מלח המאוזן של האנק (HBSS) לμ-הצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה יהיה כתם biofilm נוצר. הסר את הפתרון מכתים ולשטוף tהוא μ-צלחת עם 2 מיליליטר של HBSS. חזור על השלב לשטוף עוד פעם אחת.
  6. הוסף 500 μl של פורמלדהיד 3.7% מומסים בHBSS ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; זה יהיה לתקן את biofilm על μ-הצלחת. לשטוף את μ-צלחת פעם אחת עם 2 מיליליטר של HBSS ולאחר מכן להסיר את הפתרון לחלוטין. קבוע עם biofilm μ-הצלחת ניתן לאחסן בחושך על 4 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה CLSM.
  7. הדמיה CLSM וניתוח, להשתמש 63 הגדלת פעמים כדי ליצור 97 ערימות לכל תמונה עם מרווח של 0.21 מיקרומטר לערימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניסוי quantitation הסגול גביש, שני אנזימי מרווה-מניין שמשו כדי להדגים היתכנות בשיבוש היווצרות biofilm: פרא-הסוג GKL ומוטציה משופר GKL כפולה (E101G / R230C). שני האנזימים הוכחו להפגין פעילות lactonase נגד 3-הידרוקסי-decanoyl-L-homoserine לקטון (3-OH-C 10 -HSL), מולקולת המניין המרכזית בשימוש על ידי א ' baumannii S1 14. להערכה תקפה של שיבוש biofilm, האנזימים שלהם בהתאמה catalytically לא פעילים (הראו בעבר שלא לעקל ligand...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשני הסטים של ניסוי, א baumannii S1 היה בתרבית בתקשורת LB ללא NaCl כריכוז מלח גבוה יכול להפחית את כמות biofilm נוצרה על ידי החיידקים 15. נוכחותו של חפץ כזה יכול לזלזל בסכום של biofilm נוצר, כמו גם את ההשפעות של אנזימי מרווה-מניין פני תנאי טיפול שונים. השימוש באנזים catalytically פעיל הוא חשוב כביקורת שלילית לחסל את ההשפעות אפשריות של תפיסת אנזים. איור מציג 1 שגם אם אנזימים פעילים לעקל מולקולות מניין, היווצרות biofilm לא תופרע. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר האקדמי של משרד החינוך, והמועצה הלאומית למחקר רפואי והקרן הלאומית למחקר בסינגפור.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
טריפטון תמצית211705
BD212750
צלחת 96 בארותCostar3596
קריסטל סגולסיגמא-אולדריץC6158
סריקת מעבדהחומצה אצטיתPLA00654Xזהירות: דליק
μ-צלחתIbidi80136
Alex Fluo 488-מצומד WGAInvitrogenW11261
האנק' תמיסת מלח מאוזנת Invitrogen141475095
פורמלדהידסיגמא-אולדריץ'F8775זהירות: מאכל 
Synergy HT Microplate ReaderBioTek
1X-81 מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךאולימפוס
שמרים BD '

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
  2. Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
  3. LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
  4. Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
  5. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
  6. Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
  7. Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  8. Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
  9. Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
  10. Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
  11. Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
  12. Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
  13. Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
  14. Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
  15. Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Quorum quenchingA baumannii S1

מאמרים קשורים